FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定

要約

本研究は、フローサイトメトリー、FcγR の活性化から生じる活性酸素種 (ROS) 生産を検出するための使用方法を示します。このメソッドは、抗菌および酸化還元シグナル免疫複合体、微生物のオプソニン、または直接 FcγR 架橋への応答で食細胞の機能の変化を評価するために使用することができます。

要約

酸化または呼吸バーストは様々 な免疫刺激への応答の食によって酸素を急激に消費と活性酸素種 (ROS) の生成を記述する使用されます。免疫活性化中に生成された ROS は、微生物の死を引き起こす損傷 DNA とタンパク質、ROS の能力を中心に強力な抗菌活性を発揮します。再現性をもって、容易に活性酸素産生を測定することが様々 な経路やこの生体防御のメカニズムを分子の寄与を評価するために必要です。本稿では、蛍光プローブの使用方法を示すし、フローサイトメトリー活性酸素産生を検出します。広く使用されている活性酸素の蛍光測定は悪名高く問題となる、具体的でない細胞増殖刺激による活性酸素の測定に関して特に。マクロファージの生成、プライミング、染色、FcγR 架橋、およびフローサイトメトリーによる解析で終わるで始まる特定の FcγR 刺激の結果として生成された ROS を検出する詳細な方法論を提案します。

概要

活性酸素種 (ROS)、反応分子または (文献¹) 好気性の呼吸の副産物であるフリーラジカルです。これらには、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、他の中の水酸イオンが含まれます。通常の生理学的な条件の下で ROS は主にミトコンドリアとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADPH) 酸化酵素によって生成され、様々 な酵素、スーパーオキシドディスムターゼやグルタチオンなどのタンパク質によって急速に無害化します。活性酸素や活性酸素を除去する能力に欠陥の誇張された生産は、酸化ストレス、活性酸素種がタンパク質、脂質、および病理学的病気の状態や死細胞ストレスにつながる DNA の損傷を促進するというで起因できます。しかし、それは現在感謝 ROS も (レドックスシグナ リング)、シグナル分子として機能し、様々 な分子および経路の中間体の活性酸素を介した変更に影響を与える細胞の代謝、増殖、生存、炎症性シグナル伝達と²を老化します。貪食細胞では、ROS は、いわゆる「呼吸バースト」^1,3,4,5,6時に抗菌活性を提供する重要な役割を果たしています。外部刺激に食細胞の応答、時に NADPH オキシダーゼ複合体 (p40^phox、p47^phox、p67^phox) のコンポーネントは gp91phox と p22phox 含む phagosomal 膜に細胞質から、若しサブユニット、Rac1/2 のアクションと共に完全に機能 NADPH オキシダーゼ酵素複合体を形成します。組み立ての NADPH オキシダーゼ、スーパーオキシド phagosomal 液胞内に酸素を減らす NADPH を利用しています。スーパーオキシドの陰イオンは、直接破損したり、過酸化水素に dismutated。スーパーオキシドと過酸化水素は、反応性の高いヒドロキシラジカルを生成する他の分子と反応できます。被害は、タンパク質の鉄硫黄クラスターとこれらの ROS の反応、dna の制限の微生物代謝または微生物⁵の死に最終的につながる基本の酸化を引き起こすことによって媒介されます。NADPH オキシダーゼ酵素の複合体の重要性と呼吸バースト中に生成された ROS は慢性肉芽腫症 (CGD)^7,8,9,の患者で臨床的に示されて¹⁰. CGD を持つ個人は、活性酸素産生や細菌および真菌は通常免疫の個人の関心事の再発性感染症への感受性の欠如の結果 gp91phox、変異を持っています。したがって、勉強を測定することができる酸化ストレス、レドックス シグナル、または宿主防御されてかどうかリアルタイムでの活性酸素産生は有用な試みです。

複数のアッセイは、メジャーの活性酸素産生や酸化ストレス^11,12,13の結果に利用されています。これらのうち、最も広く使用されるの 1 つは蛍光プローブ 2', 7' dichlorodihydrofluorescein ジアセテート (DCFH₂-DA)¹⁴です。この分子は無色と脂溶性です。DCFH₂- da セル膜を渡る拡散できます、細胞内エステラーゼによって速やかに DCFH_2、不浸透性セルを表示にナミズムします。DCFH₂ ROS (過酸化水素、ペルオキシ ナイト ライト、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、ペルオキシラジカル) の複数の種類のアクションは蛍光である DCF にそれを酸化 (Ex 報告/Em: 485-500 nm/515-530 nm)、フローを使用して検出することができますcytometer フルオレセイン (FL1 チャネル) の設定標準フィルター搭載します。スーパーオキシドは、DCFH₂と強く反応しないが、製品は、蛍光 2 hydroxyethidium (同様に他の蛍光活性酸素に依存しない酸化生成物)¹⁵を生成する別のプローブ dihydroethidium (DHE) と反応することができます。518 の励起波長を用いた蛍光 dhe は酸化物を検出できる nm、発光波長 605 nm (FL2 チャネル)。身の程の知識と実験に有効があるために実行されている特定の測定手順とコントロールを染色の注意定款に ROS の検出用のプローブの使用率が必要ですを使用する比較的簡単ですが、結果と結論。次のプロトコルは、フローサイトメトリーによるロスを測定するように設計これらの 2 のプローブを用いた市販のキットの使用を示します。我々 はこれらのプローブでプライミング骨髄由来マクロファージを染色、FcγR 架橋による活性酸素産生を誘導します。このプロトコルを使用して得られた代表的なデータを提示し、成功した実験を実施する必要があります適切な予防措置を強調.

プロトコル

動物取扱のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) のユニバーシティ オブ セントラル フロリダによって承認されました。

1 世代の骨髄由来マクロファージ (BMDMs)

1. 文化メディアの準備
   1. D10F 基本メディアの準備: 10% 熱ウシ胎児血清 (FBS)、1 mM ピルビン酸ナトリウム、10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、0.05 mM β-メルカプトエタノールを不活化するダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) を追加。
      注: 新鮮な D10F メディアを使用するが最善ですが、D10F 基本メディア用意できますを 2 週間以内に事前に 1 週間以内に複数の実験に使用します。1 つのマウスの D10F ベースのメディアの約 175 mL が必要 (骨をフラッシュする 25 mL) としてマクロファージ分化メディア 150 mL
   2. LADMAC 成長媒体の準備: 10% 熱は FBS と 2 mM L グルタミンを不活化するイーグル最小必須培地 (実装された EMEM) を追加。あなたがあなたの文化を開始する予定日にメディア フレッシュを準備します。
      注: メディアの LADMAC 完備の約 (19) 50 mL 因数で LADMAC 成長媒体の 1 リットルになります。
   3. 完全な DMEM メディアの準備: DMEM、追加 10% 熱不活性 FBS と 1 x 抗生物質抗真菌薬。新鮮なメディアを用意し、BMDMs の収穫の日に。
      注: 1 つのマウスの DMEM 完全なメディアの約 100 mL 必要となります。これは細胞のプライミング用のメディアが含まれます。
2. LADMAC 馴化培地の調製
   1. LADMAC 成長媒体 (1.1.2 で定義) の 10 mL を使用して 10 cm 皿の confluency に LADMAC 細胞を成長します。37 ° C、5% でセルを孵化させなさい CO_2.
   2. Confluency にセルにメディアを強制的に調剤して細胞をデタッチします。通路細胞 T-175 フラスコ 100 mL LADMAC 成長媒体を含むに剥離細胞の 1 つの mL を追加します。37 ° C、5% CO₂ (約 1 週間) で完全に合流するまでのセルを孵化させなさい。このように、1 つの 10 cm 皿 10 T-175 フラスコまたは調節されたメディアの約 1 L をもたらすことができます。
   3. セルは、準備ができて、一度エアコン メディアと不要な細胞のペレットに 5 分間、350 × gで遠心分離を収集します。0.2 mm のフィルターを通して収集した培養上清をフィルター処理し、-80 ° C で 50 mL の因数を格納LADMAC 付きメディアの因数は、活動の最小の損失の数ヶ月の-80 ° C で保存できます。
      注: 大規模な実験が予想される場合は、整合性を確保する同時に LADMAC 付きメディアの大規模なバッチを準備します。できない場合は、同じバッチまたは多くの各実験のための LADMAC 付きメディアから派生した因数を使用します。
3. 調製された骨髄由来マクロファージ
   1. 実験の日に事前に準備された D10F メディア (1 部分エアコン LADMAC D10F 3 分割) にエアコン LADMAC メディアの 25% を加えることによって新鮮なマクロファージ分化メディアを準備します。このメディアを事前に準備しない!のみ BMDM 文化に必要な同様に多くのメディアを準備します。
   2. 日 1: 大腿骨および脛骨 D10F ベースのメディアを使用してから骨髄をフラッシュの変更で説明したプロトコル¹⁶に従ってマウス骨髄細胞を分離します。D10F メディアの 2.5 mL を使用して、(4) 骨の両端をフラッシュします。中古湿式 40 mm セル ストレーナーに直接フラッシュの骨髄細胞は 50 mL のチューブの上に配置されます。残りのメディア (~ 5 mL) は、セル ストレーナーを洗浄する使用できます。
   3. 350 x gで 5 分間破棄で収集した骨髄細胞の上清を遠心し、マクロファージ分化メディア (マウス) ごとの 30 mL の合計で細胞を再懸濁します。
   4. 準備し、(6) 滅菌 10 cm シャーレにラベルを付けます。プレート 5 mL 各シャーレにマクロファージ分化メディア。皿あたり 10 mL の容量の各シャーレにマクロファージ分化メディアの再懸濁の骨髄細胞の分注 5 mL。37 ° C、5% で 5 日間インキュベート CO_2.
   5. 日 5: セルからメディアを吸引します。1-2 mL の PBS で 1 回洗浄し、作りたてのマクロファージ分化メディアの 10 mL を追加します。さらに 3 日間孵化させなさい。
   6. 8 日目:下記のとおり BMDMs の収穫に進みます。

2. 収穫、種まき、BMDMs のプライミング

1. マクロファージの分化メディアの BMDMs の成長の 7 日後上澄みを除去します。一度 1-2 mL の PBS と付着性マクロファージを洗います。PBS を吸い出しなさい。
2. 0.25% の 1 mL を分注各マクロファージにトリプシン-EDTA プレートし、セルをデタッチする頻繁にタップで 5-10 分の 37 ° C の定温器でそれらを残します。P1000 ピペットを使用して上下ピペッティングによるマクロファージのトリプシンを分離し、10-15 mL の完全な DMEM 培地を含む 50 mL チューブにマクロファージを収集します。任意の残りの大食細胞を収穫する追加の mL の 2 完全な DMEM メディアを洗浄します。
   注意: は、10 分以上のトリプシンのマクロファージを放置しないでください。
3. 50 mL チューブ 350 x gで 5 分間破棄で上澄みを遠心分離機します。ゆっくりペレットを切り離して考えるし、完全な DMEM メディアの 10 mL の細胞を再懸濁します。カウント マクロファージの存在下で、生存率の検定を使用して色素トリパンなど青、次のとおり。
   1. たとえば、セルの 10 μ L では 1:10 のトリパン ブルー色素の 90 μ L をミックス希釈。
   2. この混合物の診断に 10 μ L を読み込み、中央広場 (5 x 5 グリッド) をカウントします。総セル数カウント x 10⁴倍の希釈係数 (10) x ボリューム (10 mL) を =。
4. 完全な DMEM メディアとプレート各 6 cm 皿にこの細胞懸濁液 4 mL で 100 万/mL に細胞懸濁液を調整します。
   注: 3 プレートの最小値は実験ごとに必要です。セルの 1 つのプレートは左刺激になります、セルの 2 番目のセットは、FcγRs の架橋を通じて刺激が、細胞の 3 番目のプレートはすべての追加用実験と流れフローサイトメトリーによる制御。
5. 一晩で 37 ° C、5% CO₂版を孵化させなさい。
6. 次の日は、1-2 mL の PBS で 1 回洗浄細胞上清を吸引します。各プレートに 100 ng/mL マウス IFN-γ を含む完全なメディアの 4 つの mL を追加します。一晩で 37 ° C、5% CO₂版を孵化させなさい。
7. 必要な場合、フローサイトメトリーによる BMDMs の適切な生成を評価する細胞の因数を取る。テストあたり 1 x 10 の⁶セルを使用して、次の条件のポリスチレンの FACs チューブを準備: アイソタイプ コントロール F4/80 で染色 (またはまた、CD11b で染色)。
8. フローサイトメトリーの 0.1% を追加することによってバッファーを染色の準備 1 × PBS に FBS。後の手順で血清飢餓の効果を打ち消すように FBS のこの量だけを使用します。
9. チューブおよび 750 x gで 5 分間遠心するあたり分注 1 x 10 の⁶セル。
10. デカント、上清を吸引または 2 mL の流れ cytometry バッファー内セルを再して一度洗います。750 x gで 5 分間遠心します。
11. 上清を吸引し、フローサイトメトリー バッファーを染色の 100 μ L の細胞を再懸濁します。各チューブに抗マウス CD16/32 Fc 遮断抗体の 1 μ L を追加します。氷上で 5 分間インキュベートします。
12. 洗濯、なし「ステンド グラス」のチューブと同様「アイソタイプ」チューブに対応するアイソタイプ コントロール抗体の量に FITC 抗マウス F4/80 の 2 μ l または APC 抗マウス CD11b 抗体の 1 μ l を追加します。氷上で 30 分間、暗闇の中で孵化させなさい。
13. セルに直接 2 mL の PBS を追加してセルを洗浄します。750 x gで 5 分間遠心します。
14. 上清を吸引し、150 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。
15. 流れの cytometer 関心のゲートに 100 μ L または 10,000 イベントの停止条件を使用してサンプルを取得し、ことを確認、FSC、SSC、FL1 (FITC 抗マウス F4/80) または分析するパラメーターの選択を FL4 (APC 抗マウス CD11b) チャンネル。
16. 流れ cytometry ソフトウェアを使用して、(x 軸) に FSC 対 SSC (y 軸) 上のドット プロットを開き、ゲートを囲む死んだ細胞や破片を除く興味のセル (死んだ細胞残骸メイン携帯の人口よりもはるかに小さいイベントし、ロウで表示r はプロットの左します。)
17. FL1 とヒストグラム プロットを開いて興味のセルのゲート (FITC 抗マウス F4/80) またはを FL4 (APC 抗マウス CD11b) x 軸に。
18. 「アイソタイプ」サンプルをを実行します。「アイソタイプ」のサンプル イベントの大半門左側にマーカー ゲートを生成 (< 1% 肯定的な)。ステンド グラス サンプル ファイルにこのテンプレートを適用します。
19. 「ステンド グラス」のサンプルを実行します。BMDMs が正しく生成されます > FITC 抗マウス F4/80 または APC 抗マウス CD11b の 95% 式 (図 1 a)、不適切な培養条件はマクロファージ (図 1 b) のサブ最適な世代になります。
    注: 複数の遺伝子型から BMDMs を生成している場合これが活性酸素生成を刺激に応答を評価分析からサンプルを除くための根拠である場合、生成された BMDM のバッチごとに、これらのマーカーの表現の注意してください。

3. ROS 測定のため試薬および材料の作製

1. 5 mM 在庫ソリューションをもたらすため無水 DMF の 60 μ L の凍結乾燥酸化ストレス検出試薬を再構成します。使用前に軽く混ぜます。
   注: 表記し ID ROS キットのマニュアルで、再構成された試薬の寿命が-20 ° C で約 1 週間早かった小さな遮光瓶に試薬直後再構成その酸化を最小限に抑え、-20 ° C で寿命を最大化
2. 5 mM 在庫ソリューションをもたらすため無水 DMF の 60 μ L で凍結乾燥させた活性酸素検出試薬を再構成します。使用前に軽く混ぜます。
   注意: 前述のキット マニュアルには変異として両方の検出試薬を扱う、それぞれケアと処分を適切に処理します。
3. 50 mM 在庫ソリューションをもたらすため無水 DMF の 20 μ L の ROS インデューサ (Pyocyanin) を再構築します。
4. 0.5 M ストック濃度をもたらす 123 μ L の脱イオン水で ROS 阻害 (N-アセチル-L-システイン) を再構成します。
5. 5 mL のポリスチレン チューブ (流れ cytometry 管) 実験的コントロールと条件と丸のラベルを付けます。(4 を参照してください。アッセイ条件と制御)
6. 低血清の準備 DMEM (フェノールレッドは除く) 0.1% を追加してフェノールレッド フリー DMEM に FBS。
7. 抗 BSA 抗体 (使用状況) に応じて小さい因数の因数-80 ° C で保存し、
8. HBSS の BSA を 100 mg/mL の原液を準備 (ハンクス平衡塩類溶液) または PBS。100 μ L の因数に-20 ° C にてストア因数
9. ROS プローブ (プローブ ソリューション x 2) の 2 倍溶液を調製: 低血清 DMEM の各 10 mL、酸化ストレス検出試薬 (緑色の染料) の 4 μ L とスーパーオキシド検出試薬 (オレンジ色の染料) の 4 μ L を追加。
10. 準備のみを含むプローブ x 2 酸化ストレス検出試薬 (プローブ ソリューション、グリーンのみ x 2)、または含むだけ活性酸素検出試薬 (プローブ ソリューション、オレンジのみ x 2)。実験に必要な試薬の量だけを準備し、常に 2 倍のソリューションを使用する前にすぐを準備します。
    メモ: 検出ソリューション x 2 の小さいボリュームを準備する使用、中間 1:10 DMEM で最終希釈前に緑とオレンジの両方の検出試薬の希釈。たとえば、検出ソリューション x 2 の 1 mL を準備する DMEM の 9 μ L に各プローブの 1 μ L を希釈 (1:10 の希釈中間)。これの 4 μ L を希釈 1:10 中間 DMEM の 1 mL に希釈します。

4. 測定条件とコントロール

1. 各実験の流れフローサイトメトリーによる補償のため次の実験のコントロールがあります。
   a) 無染色、些細のセルです。
   b) 細胞は酸化ストレス検出試薬 (グリーン試薬) のみ染色し、ROS インデューサと扱われます。
   c) 細胞活性酸素検出試薬 (オレンジ試薬) のみ染色し、ROS インデューサと扱われます。
2. マウスまたは生物的複製ごとに、以下の 6 条件を含めます。
   a) 無染色と処理細胞
   b) ステンド グラスと処理細胞
   c) ステンド細胞が陽性誘導治療
   d) 陽性細胞陽性誘導と活性酸素阻害剤で治療
   e) 染色細胞の FcγR 架橋を通じて活性化
   f) 陽性細胞 FcγR 架橋を通じてアクティブ化および ROS 阻害剤で治療
3. マウスと (プローブ ソリューション x 2 を 200 μ l 添加は染色を必要とする各条件に対して使用される) 条件の数に基づいて必要なプローブ ソリューション x 2 の量を計算します。
   注: 6 匹のマウスを使用して試金、マウスあたりプローブ染色を必要とする 5 つの条件が必要でしょう。これは 30 に条件の合計数をもたらします。したがって、2 x プローブ ソリューションに必要な総額は少なくとも 6 mL (30 * 200 μ L) であります。

5. セル準備

1. マクロファージをプライミング後一夜にして、上清を吸引します。PBS で 1 回洗浄を行う。
2. 血清は、低血清 DMEM の同じボリュームにメディアを置き換えることで細胞を飢えさせます。各マウスのワンプレート投与となる抗 BSA IgG₁血清が飢えさせている間他のままになります、未処理。未処理プレートにのみ低血清 DMEM を追加します。低血清マウス抗 BSA IgG₁扱われたプレートの 2.5 μ g/mL を含む DMEM を追加します。
   注: 1 つの追加の未処理プレート フロー フローサイトメトリーによる補償制御の各実験のため必要です。
3. 37 ° C、5% CO₂で 4 h 用の版を孵化させなさい。
4. 飢えている血清後、穏やかスクレーピングによってまたは PBS の 0.2 mM EDTA を使用してセルを収穫します。ラベル付き 5 mL の丸底チューブにそれらを収集し、遠心分離機セル 750 x gで 5 分間でそれらの追跡はマウス抗 BSA IgG₁と扱われました。
5. 2 mL の PBS 扱われた細胞から任意の残留抗 BSA を取り除くために一度細胞ペレットを洗浄します。
6. 600 μ L の血清 DMEM で細胞ペレットを再懸濁します。
7. 600 μ L 細胞懸濁液から事前ラベル 5 mL に 200 μ L 分注ラウンドは、次のとおり下部チューブ
   1. 未処理細胞から管「些細」、チューブ ラベル"肯定的な誘導」の 200 μ L、200 μ L チューブの「肯定的なインデューサ + 阻害剤」ラベル ラベルの 200 μ l を取る
   2. 抗 BSA IgG₁から扱われた細胞取る 200 μ L 用ラベル「FcγR 架橋/FcγR XL」と 200 μ l 用ラベル「FcγR XL + 阻害剤」
   3. 補正のコントロールに使用する未処理細胞から取る「無染色些細」ラベル付け管用 200 μ L、200 μ L「グリーン + インデューサ」の制御と「オレンジ + インデューサ」を 200 μ l 添加制御。
      注: 5.7.1 および 5.7.3 から細胞は同じマウス由来、同じ「無染色些細」セルが実験および補償制御のため使用できます。いない場合は、セルの追加 200 μ L を「無染色些細」実験的制御に必要となる、)。
8. 染色と刺激まで氷の上の管を保ちます。血清飢餓および IgG₁バインディング中に特定の刺激および下記のとおり誘導プローブを準備します。
   注: の試金を実行している場合、初めて、テンプレートがないか、流れの cytometer で対応するソフトウェアは、事実後補償がない場合刺激し染色補正コントロールとを実行する流れの cytometer でこれらを実行実験サンプルに刺激の追加前に手動補正。

6. 試金の実行

1. Pyocyanin の 500 μ M の濃度が 2 倍に (3.9 の手順で準備) プローブ ソリューション x 2 Pyocyanin 1: 100 希釈することによって肯定的なインデューサ ソリューション x 2 を準備 (最終濃度は 250 μ M になります)。また、それぞれの「プローブ ソリューション x 2 グリーンのみ」と「2 x プローブ ソリューション、オレンジのみ」のチューブが 3.10 で準備に pyocyanin 1: 100 を希釈します。
   注:「肯定的な誘導」と「肯定的なインデューサ + 阻害剤」とラベルの両方の条件は、肯定的なインデューサと取り扱われます。2 x 肯定的なインデューサ溶液を準備しての量を計算するときをそれに応じて計画します。たとえば: 6 条件 (3 * 2) 陽性誘導扱われる、だから 6 * 200 μ L を準備 3 マウスのアッセイを行う場合 = 1.2 x 陽性誘導液 2 mL。
2. 2 x、2 μ G/ml の濃度プローブ ソリューションの BSA の原液を希釈して BSA ソリューション x 2 を準備 (最終濃度が 1 μ g/mL になります)。
   注:"FcγR XL"と「FcγR XL + 阻害剤」とラベルの両方の条件は、BSA ソリューション x 2 で取り扱われます。準備する溶液の量を計算するときは、それに応じてを計画します。例: マウス 3、6 (3 * 2) を使用して分析を実行する条件は、BSA 溶液とだから 6 * 200 μ L に扱われる、または 1.2 mL BSA ソリューション × 2 が必要になります。
3. 特定の刺激 (FcγR 架橋) を開始する前にすべての試薬、細胞が準備ができていることを確認します。彼らは刺激される順序で氷にチューブを配置します。
4. オートサンプラー、cytometer は、1 つのサンプルを分析し、次へ移動するのにかかる時間の注意と流れの cytometers の混合およびプローブ手順 (たとえば 3.5 分) を洗浄を含みます。
   注:タイミングがこの試金のため非常に重要です。よく制御するすべての条件は、刺激が各条件に対して正確な時刻 (30 分) 実施する必要があります。順序で細胞を刺激し、流れの cytometer によるサンプル獲得までのタイムラグを組み込みます。たとえば、cytometer 1 つのサンプルを分析し、次へ移動するために必要な時間は 3.5 分で、彼らはすべての 3.5 分を分析する順序で細胞を刺激します。
5. この時点で手動補正を実行している場合は、補償 (ステップ 5.7.3) に使用する制御管を刺激します。「X プローブ ソリューション 2 グリーンのみ」を 200 μ l 添加"グリーン + インデューサ"をマーク チューブに (6.1) からを含む (ステップ 5.7.3)。「プローブ ソリューション、オレンジのみ x 2」を 200 μ l 添加「オレンジ + インデューサ」をマーク チューブに誘導 (ステップ 6.1) を含んでいる (ステップ 5.7.3).
6. 37 ° C で 30 分間、暗闇の中で 5% CO₂のセルを孵化させなさい。
7. 流れの cytometry ソフトウェアを使用して生成コントロール「無染色、未処理」、「グリーン + インデューサ」の 3 つのサンプル ファイルにラベルを付けるし、「オレンジ + インデューサ」サンプル、チャンネル ・ パラメーターで分析 (FSC、SSC、FL1、FL2) を示すことを確かめる停止を希望条件 (100 μ L、3 分など)。生成し、同様の実験サンプルのファイルのセットにラベルを付けます。
8. 「無染色、未処理」のサンプルを実行します。(X 軸) に FSC 対 SSC (y 軸) 上のドット プロットを開きゲートを囲む死んだ細胞や破片を除く興味のセル (死んだ細胞や破片メイン携帯の人口よりもはるかに小さいイベントし、プロットの左下に表示されます)。
9. FL1 のもう一つのドット プロットを開くこの「セル」ゲートを用いた (x 軸) vs FL2 (y 軸) です。初期の象限儀のゲートを描画します。FL1 対 FL2 プロットの左下にイベントが表示される作業領域は、ゲートを調整します。
10. 「グリーン + インデューサ」サンプルをを実行します。FL1 対 FL2 プロットの下左と右の象限にイベントが表示されるように、電圧を調整します。この補償行列を適用すると、すべての 3 つのサンプル ファイルに。
11. 「オレンジ + インデューサ」サンプルをを実行します。イベントは、上部と下部に表示されるように、電圧を調整する FL1 対 FL2 プロットの象限を残しました。この補償行列を適用すると、すべての 3 つのサンプル ファイルに。
12. 各補償のファイルを確認し、「無染色、未処理」イベント左の下のセクションに表示されます、「グリーン + インデューサ」イベント下の左右にある象限に表示されます、「オレンジ + インデューサ」イベント上部と下部に表示されます FL1 対の象限を左FL2 のプロット。補償行列を適用すると、すべてのサンプル ファイルに。
    1. すべての実験のサンプル ファイルに補償行列を適用する前に、コントロール サンプルのすべてのファイルに適切な補償が適用されることを確認します。非補償を示す代表的なデータと正しく補正サンプルは、図 2を参照してください。
       注: 多くの cytometers は標準の FITC/GFP チャネル (青い 488 nm レーザー励起/530/30 フィルター セットで検出) および標準的な PE チャネル (青の 488 nm レーザー励起し、585/40 フィルター セットで検出) として FL2 として FL1 を指定します。彼らの cytometer は同様に構成されていることと、適切なチャネルを使用してこれらのプローブを検出することを確保するため流れ cytometry コア マネージャーと相談する注意新しい流れ cytometry ユーザーが、この規則を使用します。流れの cytometer とソフトウェアに付属のモデルによっては前に、またはサンプルが取得された後に補正を実行することが可能があります。事実後補正は可能ですが、すべて実験サンプルが、cytometer で取得されている後補正手順が実行できます。ダイナミック レンジは、PMT 電圧調整が必要ない場所 cytometers 補償実験を別の日に実行することも、実行に必要な時間を短縮する (補償行列を含む) 実験的テンプレートを保存することができます。手動補正。
13. 一度手動補正を行った実験的テンプレートを取得、実験サンプルの処理を開始します。肯定的な誘導と FcγR 細胞刺激治療する前に管を得る ROS 阻害剤をマークします。これらの細胞で陽性誘導または FcγR 刺激する前に活性酸素阻害剤の少なくとも 30 分を扱います。
14. ROS 阻害剤を追加、再懸濁細胞 (抗 BSA IgG₁) なしを 200 μ l 添加する阻害物質の 1 μ L を追加することによって最終濃度 5 mM を準備します。
15. 刺激 (または肯定的なインデューサ) で細胞を治療し、ロードセルを ROS プローブと次のように。
    1. 処理セルの:「ステンド グラス、些細」の標識細胞懸濁液 200 μ l に 200 μ l 任意刺激を持たないソリューションをプローブ x 2 を追加。
    2. 肯定的な制御のため:「肯定的な誘導」または「肯定的なインデューサ + 阻害剤」に分類される細胞懸濁液 200 μ l に正インデューサ ソリューション (6.1 の手順で準備) x 2 の 200 μ L を追加。
    3. FcγR 架橋 (特定刺激) による刺激細胞のため:"Fcγr XL"あるいは「FcγR XL + 阻害剤」の標識細胞懸濁液 200 μ L に 2 BSA 溶液 (6.2) × 200 μ L を追加。
       注意: 追加の刺激すべての x 分 x は 1 つのサンプルの集録と次間のタイムラグによるサンプル分析までのタイムラグを組み込む。
16. 37 ° C で 30 分間、暗闇の中で 5% CO₂のセルを孵化させなさい。オートサンプラーを搭載したフローサイトを用いて刺激された順序のサンプルを分析します。初期補正手順の間に生成された分析テンプレートを使用します。分析の前に細胞を洗浄しないでください。

7. 流れ cytometry データ分析と期待される成果

1. 流れの cytometry ソフトウェア内で実験サンプルの以前に生成された分析ファイルを開く (6.7 6.12 の手順で生成されたテンプレートとサンプルは 6.16 のステップで実行した)。手動補正を実行するから補償行列が実験サンプルに正しく適用されていることを確認します。
   注: 流れの cytometers と事実後補償のできる流れ cytometry ソフトウェア補償行列は、以前実験サンプル ファイルに適用されませんだった場合、適用されますそれこの時点で。
2. 同様正しい手動補正を確認するのには、実験のサンプル内のコントロールが期待どおりに動作するを確認します。
   1. 「肯定的なインデューサ」イベント, 発蛍光で表示左上上右、上下、FL1 対 FL2 プロットの右の象限、FL1 対 FL2 プロットの左下に「無染色、未処理」イベントが表示されることを確認」肯定的なインデューサ + ROS 阻害剤「イベント減少を示す蛍光で左上の上部右、上下蛍光に比べて FL2 プロット観測「肯定的な誘導」サンプル FL1 対の右の象限儀。
   2. 実験サンプル内のコントロールは、任意の増加の蛍光を表示しない場合すべての試金のステップが実行されたことを確認、適切な生成と骨髄由来マクロファージ (2.7-2.19) のプライミングを確認し、実験を繰り返します。実験サンプル内のコントロールは、予想される傾向を示す場合、FcγR (図 3 a) を刺激実験サンプルの分析に進みます。
3. FcγR 専用の刺激が適切に動作しているを確認します。C57bl/6 j WT マウスから以下のサンプルを実行:「無染色、些細」、「ステンド グラス、些細」、"ステンド グラスは、FcγR を刺激"と"ステンド グラス、FcγR + ROS を介して刺激阻害剤」。これらはそれぞれ、セクション 4 で 4.2f、4.2 e、4.2b 4.2a サンプルに対応します。
   1. 「無染色、安静時」イベントは、「ステンド グラス、安静時」イベントは、FL1 対 FL2 プロットの左下にも表示されます FL1 対 FL2 プロットの左下に表示されますを確保する」、FcγR を刺激され、ステンド グラス"イベントをします。増加蛍光で表示左上上右、上下 FL1 対 FL2 プロットの右の象限」ステンド グラス、FcγR + ROS を介して刺激阻害剤「左上、右上、右下で蛍光を減少したイベントが表示されます「ステンド グラス、、FcγR を刺激」のサンプル (図 3 a) と比較して FL1 対 FL2 プロットの象限儀。
   2. これらの期待が満たされていない場合、たとえば、"ステンド グラス、FcγR を刺激"サンプルを示します最小限または既に「ステンド グラス、些細」のサンプルや「ステンド グラス、些細」のサンプルと比較されたとき高められた蛍光表示されない著しく「無染色、些細」のサンプルと比較して蛍光の上昇すべての試金のステップが正しく実行されたことを確認、適切な生成、プライミング、および BMDMs (2.7-2.19) の処理を確認、実験を繰り返します。これらの期待を満たしている場合は、実験サンプルの残りの部分の分析に進みます。
      注: 緑のプローブ (過酸化水素、ペルオキシ ナイト ライト、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、ペルオキシラジカル等) と反応して活性酸素を産生する細胞は右上に表示され、ログ FL2 とログ FL1 の右の象限儀 (x 軸) を下げる (y 軸) ドット プロット。(大部分が排他的ではないスーパーオキシド) オレンジ プローブ反応 ROS を産生する細胞が、2 つ上の象限ログ FL1 (x 軸) ログ FL2 対で表示されます (y 軸) ドット プロット。
4. FL1 と FL2 蛍光分析のための興味のセルのゲート、個々 のヒストグラムを生成します。「無染色、些細」のすべてのイベントは、このマーカーの左側に表示するよう、ヒストグラム マーカーを生成「無染色、些細」のサンプルを使用して、します。このプロットをマーカーで実験サンプル (図 3 b) の残りの部分に適用されます。
5. 陽性細胞の割合として ROS プローブまたはコントロール (図 3) 対刺激のサンプルの平均蛍光強度 (MFI) を示すことによってそれぞれの実験の結果を示します。

8. セルのフローサイトメトリー解析と活性酸素産生 (オプション) の組み合わせで表面の汚損

注: この手順は、マクロファージを刺激 FcγR とロスの測定の前にセル表面のマーカーの染色のプロトコルを提供します。これは、混合細胞集団における活性酸素産生を評価する上で役に立つかもしれません。マクロファージ表面マーカー酸化ストレスや活性酸素検出試薬から蛍光と干渉しない適切な蛍光標識抗体を選択することが重要です。このプロトコルでは、F4/80 共役 Alexa fluor 647 にマウスの抗体を使用しています。

1. BMDMs を生成、収穫および前述 (セクション 1 および 2) それら首相。
   注: すべての実験的コントロールと下記のとおり条件を実行するために 3 つの 6 cm 板の最小値が必要です。ワンプレートは、未処理の飢えている一方、他の 2 つのプレートが残される血清中抗 BSA IgG₁と取り扱われます。
   1. 4 実験コントロール フロー フローサイトメトリーによる補償 (実験) あたり使用できるがあります。
      a) 無染色、些細のセルです。
      b) 細胞は酸化ストレス検出試薬 (グリーン試薬) と ROS インデューサと扱われます。
      c) 細胞は、活性酸素検出試薬 (オレンジ試薬) と ROS インデューサと扱われます。
      d) 細胞に染まった F4/80 共役 Alexa 647 に抗マウスのみ。
   2. マウスまたは生物の複製は、次の 3 つの条件があります。
      a) ステンド F4/80 と左些細
      b) F4/80 で染色、FcγR を介して活性化
      c) F4/80 で染色、FcγR を介して活性化し、ROS 阻害剤で治療
2. マクロファージをプライミング後一夜にして、上清を吸引します。1-2 mL の PBS で 1 回洗浄を行う。血清は、低血清 DMEM の同じボリュームにメディアを置き換えることで細胞を飢えさせます。各マウスのワンプレートは、血清を飢えさせている間抗 BSA IgG₁と扱われるが、他の 2 つのプレート間が放置します。37 ° C、5% CO₂で 4 h 用の版を孵化させなさい。
3. 飢えている血清後、穏やかスクレーピングによってまたは PBS の 0.2 mM EDTA を使用してセルを収穫します。ラベル付き 5 mL の丸底チューブの各プレートを収集し、遠心分離機、セル 750 x gで 5 分間でそれらの追跡はマウス抗 BSA IgG₁と扱われました。
4. 1-2 mL の PBS 扱われた細胞から任意の残留抗 BSA を取り除くために一度細胞ペレットを洗浄します。
5. 600 μ L の血清 DMEM で抗 BSA IgG₁を取得していないプレートから細胞ペレットの再懸濁します。これらの細胞がないセル表面の汚損にさらされます。これら補正コントロールを使用します。(3) にこの細胞懸濁液の分注 200 μ L 5 mL の丸 ROS インデューサ c) オレンジ スーパーオキシド検出試薬 + ROS インデューサ下部チューブ ラベル付き) 無染色、些細 b) 緑酸化ストレス試薬。
6. Cytometry 流れ染色バッファー 300 μ L に₁セルの 1 つが抗 BSA を取得していないプレートからペレットを再懸濁します IgG (PBS + 0.1 %fbs)。(2) にこの細胞懸濁液の 100 μ L 分注 5 mL ラウンド Alexa 647 抗マウス F4/80 で汚損のため下部チューブ。
7. 流れ cytometry 染色バッファーの 300 μ L の抗 BSA IgG₁を受け取ったプレートから細胞ペレットを再懸濁します。(2) にこの細胞懸濁液の 100 μ L 分注 5 mL ラウンド Alexa 647 抗マウス F4/80 で汚損のため下部チューブ。
8. 8.6 8.7、暗闇の中、氷の上で 30 分間 Alexa 647 抗マウス F4/80 の 5 μ L での検体が細胞を染色します。
9. 染色, 750 x gで 2 mL の PBS と遠心分離機を追加してセルを洗浄後、上清を吸引、低血清 DMEM フェノールレッドなしの 200 μ L で各管を再懸濁します。単独でステンド グラスを fl4 するコントロールとして機能する 1 つの未処理管置いておきます。セクション 3.9、3.10、6.1、6.2、および 6.14 に示すように、プローブ、インデューサ、FcγR 刺激、および ROS の阻害剤を準備します。
   1. 抗 BSA を受信していない細胞 IgG₁のラベルを次のようにチューブ:) 刺激は一切 b) ROS インデューサです。
   2. 抗 BSA を受け取った細胞 IgG₁のために次のようにラベルを付ける:) Fc XL または b) Fc XL + 阻害剤。
10. 次の 1 つのサンプルの集録の間に遅延時間を組み込む、流れの cytometer で読み取られる順序で 6.5 6.6 に示すように、それぞれの治療法によると補償のための試料を刺激します。
11. 37 ° C で 30 分間、暗闇の中で 5% CO₂のセルを孵化させなさい。オートサンプラーを搭載したフローサイトを用いて刺激された順序のサンプルを分析します。
12. 6.7 6.12 とデータ分析セクション 7 に記載に記載されている手動補正を実行します。
13. 流れの cytometry ソフトウェアを使用して生成し、「無染色、未処理」、「グリーン + インデューサ」4 サンプル コントロールのファイルにラベルを付ける、「オレンジ + インデューサ」、「F4/80 ステンド グラス」のサンプル (FSC、SSC、FL1、FL2 を FL4) 分析するチャンネル/パラメーターを示すことを確かめる必要な停止条件 (100 μ L、3 分など)。
14. サンプルを実行し、手動補正を実行するドット プロットを生成します。
    1. 細胞表面染色の 2 つ追加のプロットを生成: FL1 対 (x 軸) を fl4 する (y 軸) と FL2 対 (x 軸) を fl4 する (y 軸) です。図 7 aに示すように適切な補償が適用されるようにする電圧を調整します。すべての報酬が適切に実施されて、一度補償行列実験サンプル ファイルのすべてに適用します。
15. 手動補正を実行して実験的テンプレートを取得、したら 6.15.3 6.13 に示すように実験サンプルの治療を開始して、6.16 で説明されているように流れの cytometer でサンプルを集録します。

結果

記載されているプロトコルを使用して、FcγR を介して WT c57bl/6 j BMDMs の刺激から生じる活性酸素産生の流れフローサイトメトリー検出を示す代表的なデータを提案する.予想通り、FL1 または FL2 蛍光処理細胞でのバック グラウンド レベルの上で最小限の変更を遵守 (図 3 a、「ステンド グラス、些細」対「無染色、些細」ドット プロットを比較)。FcγR 架橋剤 (

ディスカッション

DCFH₂-DA ROS の dhe はベースの検出は、広く使用される手法^14,15です。使いやすさと運動のマイクロ プレート フォーマットのためのこれらの ROS プローブの適応性、蛍光顕微鏡またはフロー解析は彼らの人気に貢献しています。ただし、FcγR を介したマクロファージの機能の私達の研究でそうでなかった FcγR 架橋細胞のフローサイトメトリー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BSA IgG1	Innovative Research	IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400626
Anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647	BD Biosciences	565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC	BioLegend	123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647	BioLegend	101218
beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV	Fisher	BP1600-100
C57BL/6J	Jackson labs	Stock No.000664
CM-H2DCFDA	Molecular Probes	C6827	Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE)	Molecular Probes	D11347	Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x	Corning	10-013-CV
DMEM no phenol red	Gibco	31053-028
DMF Anhydrous	Acros Organics	61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400506
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
L glutamine	Gibco	25030-081
LADMAC cells	ATCC	CRL-2420
MEM	Corning	10-010-CV
mouse IFN-g	GoldBio	1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine	EMD Milipore	106425	Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler	Acea	2060R
Pyocyanin (ROS inducer)	Cayman chemical	10009594	Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit	ENZO	ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM)	Gibco	11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056