JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Это исследование демонстрирует использование проточной цитометрии для обнаружения реактивнооксигенных видов (ров) производства в результате активации FcγR. Этот метод может использоваться для оценки изменений в противомикробные и сигнальные функции фагоцитов в ответ иммунные комплексы, опсонизированными микроорганизмов или прямого FcγR cross-linking окислительно-восстановительные.

Аннотация

Окислительная или дыхательных всплеск используется для описания быстрого потребления кислорода и поколение реактивнооксигенных видов (ров), фагоциты в ответ на различные стимулы иммунной. ROS, созданные во время иммунной активации оказывает мощный антимикробной активности, главным образом через Рось возможность повреждения ДНК и белков, вызывает гибель микроорганизмов. Будучи в состоянии измерить ROS производства можно воспроизвести и с легкостью необходимо для того, чтобы оценить вклад различных путей и молекул, чтобы этот механизм узла обороны. В этой статье мы продемонстрировать использование флуоресцентных зондов и проточная цитометрия обнаружить производства рос. Хотя широко используется, флуоресцентный измерение ROS крайне проблематичным, особенно в том, что касается измерения ROS, вызванных конкретными и не митогенный раздражителей. Мы представляем подробная методология для обнаружения рос в результате конкретных FcγR стимуляции, начиная с поколения макрофагов, грунтование, окрашивание, FcγR cross-linking и заканчивая гранулярных анализа потока.

Введение

Реактивнооксигенных видов (ров), реактивных молекул или свободные радикалы, которые являются побочными продуктами аэробного дыхания (обзор в 1). К ним относятся супероксид анион, пероксид, перекись водорода, Гидроксильная группа и гидроксильных ионов, среди других. В нормальных физиологических условиях Рось производятся главным образом в митохондриях и никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидазы и быстро обезвреженных различными ферментов и белков, таких как супероксиддисмутазы и глутатиона. Преувеличенные производства ROS или дефект в возможность удалять ROS может привести к окислительный стресс, whereby реактивнооксигенных видов содействия ущерб белки, липиды и ДНК, ведущих к клеточного стресса или государств патологических заболеваний и смерти. Однако она в настоящее время ценится, что рос может также выступать в качестве сигнальных молекул (редокс сигнализации), и рос опосредованной модификации различных молекул и промежуточных путь может влиять клеточный метаболизм, распространения, выживание, воспалительные сигнализации и старения2. Фагоцитирующих клеток Рось играет важную роль в предоставлении антимикробной активности во время так называемого «дыхательных взрыв»1,3,4,5,6. Во время реакции на внешние раздражители, фагоциты перемещают компоненты NADPH оксидаза комплекс (p40phox,phoxp47 p67phox) от цитозоль phagosomal мембраны, содержащий gp91phox и p22phox подразделения, и вместе с действиями Rac1/2, формируют полностью функциональный NADPH оксидаза ферментного комплекса. Затем собранный NADPH оксидаза использует NADPH сократить кислорода до супероксида в пределах phagosomal вакуоль. Супероксид анионов непосредственно может привести к повреждению или dismutated в перекиси водорода. Супероксиддисмутаза и перекись водорода может реагировать с другими молекулами для создания высокой реакционной способностью гидроксильных радикалов. Повреждение опосредовано реакции этих рос с железо серные кластеры на белки или вызывая базовый окисления ДНК, в конечном счете приводит к ограниченным микробного метаболизма или смерти Микроб5. Важность NADPH оксидаза ферментного комплекса и ROS, вырабатываемые в ходе дыхания всплеск иллюстрируется клинически у больных с хроническим гранулематозная болезнь (КГД)7,8,9, 10. лица с CGD имеют мутации в gp91phox, что приводит к отсутствию производства рос и восприимчивость к инфекции с бактериями и грибками, которые обычно не являются проблемой с иммунокомпетентных лиц. Таким образом изучения оксидативного стресса, редокс сигнализации или принимающей обороны, возможность измерить ROS производства в режиме реального времени является ли полезные усилия.

Несколько анализов были использованы для производства рос меру или результаты оксидативного стресса11,12,13. Среди них одной из наиболее широко используемым является флуоресцентный зонд 2', 7' dichlorodihydrofluorescein диацетата (DCFH2-DA)14. Эта молекула является бесцветным и липофильных. Распространение DCFH2-да через клеточную мембрану позволяет быть приняты внутриклеточных эстераз, который deacetylates в DCFH2, визуализации ячейки непроницаемыми. Действия нескольких типов Рось (перекись водорода, пероксинитрита, гидроксильных радикалов, оксид азота и перокси радикалы) на DCFH2 окислить его в DCF, который флуоресцентные (сообщил Ex / Em: 485-500 Нм/515-530 Нм) и может быть обнаружен с помощью потока цитометр оснащены стандартным фильтром Набор для флюоресцеином (значения параметров FL1 канал). Супероксид не сильно реагируют с DCFH2 , но может реагировать с другой зонд dihydroethidium (DHE) приносить флуоресцентные продукт 2-hydroxyethidium (а также других продуктов флуоресцентные супероксид независимые окисления)15. Флуоресцентный продуктов окисления DHE могут быть обнаружены с помощью волны возбуждения 518 Нм и длина волны излучения 605 Нм (FL2 канал). Хотя сравнительно прост в использовании, использование этих датчиков для обнаружения ROS требует знания их ограничений и тщательного включения окрашивания процедур и механизмов контроля в конкретных assay, выполняемой для того чтобы иметь действительный экспериментальной результаты и выводы. Следующий протокол демонстрирует использование коммерчески доступных комплект, используя эти 2 зонды, разработанный для измерения ROS проточной цитометрии. Мы пятно загрунтовать макрофагов, костного мозга, полученных этими датчиками и заставить ROS производства через FcγR сшивки. Мы представляем репрезентативных данных, полученных с помощью этого протокола и подчеркнуть соответствующие меры предосторожности, которые должны быть предприняты для успешного проведения экспериментов.

протокол

Протокол для обработки животных был одобрен институциональный уход животных и использования Комитет (IACUC) из университета Центральной Флориды.

1. поколение костного производные макрофагов (BMDMs)

  1. Подготовка Культура СМИ
    1. Подготовить D10F базы СМИ: чтобы Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM), добавить 10% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС), пируват натрия 1 мм, 10 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES) и β-меркаптоэтанол 0,05 мм.
      Примечание: Хотя это лучше всего использовать свежие D10F СМИ, D10F базы СМИ могут быть готовы до двух недель заранее использоваться для нескольких экспериментов в течение недели. Для одной мыши около 175 мл D10F базы СМИ является необходимой (25 мл для сброса костей) и 150 мл сделать макрофагов дифференциация СМИ
    2. Подготовить LADMAC роста СМИ: чтобы орла минимум основных средних (EMEM), добавить 10% тепла инактивированная FBS и 2 мм L-глютамина. Подготовьте свежие средства массовой информации, в день, вы планируете начать свой культур.
      Примечание: Один литр LADMAC роста СМИ приведет к приблизительно (19) 50 мл аликвоты кондиционерами LADMAC средств массовой информации.
    3. Подготовить полный DMEM СМИ: DMEM, добавить 10% тепла инактивированная FBS и 1 x антибиотик-противогрибковое. Подготовьте свежие средства массовой информации, на день BMDMs будет собран.
      Примечание: Для одной мыши, около 100 мл DMEM полный СМИ будет необходимо. Это включает в себя средства массовой информации используются для грунтования клетки.
  2. Подготовка среды LADMAC с кондиционером
    1. LADMAC клетки растут в confluency в 10 см блюдо с помощью 10 мл LADMAC роста СМИ (определено в 1.1.2). Инкубировать клетки при 37 ° C, 5% CO2.
    2. В confluency отсоедините клетки, насильственно дозирования СМИ над клеток. Клетки в проход, добавив 1 мл отдельностоящий клеток в T-175 флаконы, содержащие 100 мл LADMAC роста средств массовой информации. Инкубируйте клетки до полностью вырожденная при 37 ° C, 5% CO2 (приблизительно одна неделя). Таким образом, один 10 см блюдо может принести десять T-175 колбы или примерно 1 Л кондиционером средств массовой информации.
    3. После того, как клетки будут готовы, собирайте кондиционером СМИ и центрифуги на 350 x g за 5 мин до Пелле нежелательных клеток. Фильтр собранные supernatants через фильтр 0.2 мм и хранить 50 мл аликвоты-80 ° c. Аликвоты LADMAC-кондиционером СМИ может храниться при температуре-80 ° C месяцев с минимальной потерей активности.
      Примечание: Если ожидается большой эксперименты, подготовьте большие пакеты с кондиционером LADMAC СМИ в то же время для обеспечения согласованности. Если это не представляется возможным, используйте аликвоты, производные от той же партии или много LADMAC-кондиционером СМИ для каждого эксперимента.
  3. Подготовка костного производные макрофаги
    1. В день эксперимента подготовьте свежие макрофагов дифференциации СМИ, добавив 25% LADMAC кондиционером СМИ в ранее подготовленных D10F массовой информации (1 часть LADMAC кондиционером на 3 части D10F). Заранее не подготовить этот СМИ! Только Подготовьте столько средств массовой информации, необходимых для BMDM культуры.
    2. День 1: изолировать клетки костного мозга мыши в соответствии с ранее описанных протокол16 с модификацией для очистки костного мозга от бедра и tibias с помощью D10F базы СМИ. Использование 2,5 мл D10F СМИ, чтобы избавиться от каждого конца костей (4). Флеш клетки костного мозга непосредственно в сито клеток заранее мокрый 40 мм укладывают поверх Тюбик 50 мл. Остальные средства массовой информации (~ 5 мл) может использоваться для промойте ситечко ячейки.
    3. Центрифуга клеток костного мозга собранных на 350 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в общей сложности 30 мл макрофагов дифференциация СМИ (на мышь).
    4. Подготовить и этикетки (6) Петри стерильные 10 см. Плита 5 мл макрофагов дифференциация СМИ в каждый в чашке Петри. Аликвота 5 мл ресуспензированы костный мозг клеток в СМИ дифференциация макрофагов в каждой чашке Петри для общим объемом 10 мл на блюдо. Инкубируйте на 5 дней при 37 ° C, 5% CO2.
    5. День 5: аспирационная СМИ из клеток. Мыть раз с 1-2 мл PBS и добавляют 10 мл свежеприготовленные макрофагов дифференциация СМИ. Инкубируйте еще 3 дня.
    6. День 8: Перейти к уборке BMDMs, как описано ниже.

2. Заготовка, посева и заправка BMDMs

  1. После 7 дней выращивания BMDMs в СМИ дифференциация макрофагов удалите супернатант. Вымойте адэрентных макрофаги раз с 1-2 мл ФСБ. Аспирационная PBS.
  2. Отказаться от 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в каждом макрофагов пластины и оставить их в инкубаторе 37 ° C за 5-10 мин с частыми разговоров для отсоединения клетки. Отделить trypsinized макрофагов, закупорить вверх и вниз с помощью пипетки P1000 и собирать макрофагов в 50 мл пробирки, содержащие 10-15 мл полного DMEM средств массовой информации. Вымойте тарелку с еще 2 мл полный DMEM СМИ собирать любые оставшиеся макрофагов.
    Предупреждение: Не оставляйте макрофагов в трипсина для более чем 10 мин.
  3. Центрифуга 50 мл трубки на 350 x g для 5 минут удалить супернатант. Аккуратно отделить гранулы и Ресуспензируйте клетки в 10 мл полного DMEM средств массовой информации. Макрофаги Count, с использованием Горяева присутствии жизнеспособности красителя например Трипановый синий следующим образом:
    1. Например, смесь 90 мкл Трипановый синий с 10 мкл клеток для 1:10 разрежения.
    2. Из этой смеси загрузить 10 мкл в Горяева и рассчитывать центральной площади (5 x 5 сетки). Граф ячейке = количество x 104 x разрежения фактор (10) x тома (10 mL).
  4. Отрегулируйте суспензию клеток в 1 млн/мл в полной DMEM СМИ и плиты 4 мл суспензии этой ячейки в каждое блюдо 6 см.
    Примечание: Минимальная 3 плит требуется для эксперимента. Одна пластина клеток будет слева кератоз, второй набор ячеек будет стимулироваться через cross-linking FcγRs и третий пластины клеток будет использоваться для всех дополнительных экспериментальных и гранулярных элементы управления потоком.
  5. Инкубируйте пластины на ночь при 37 ° C, 5% CO2.
  6. Следующий день, аспирационная супернатанта, вымыть клетки один раз с 1-2 мл ФСБ. Добавьте 4 мл полное сред, содержащих 100 нг/мл мыши ИФН γ для каждой пластины. Инкубируйте пластины на ночь при 37 ° C, 5% CO2.
  7. При желании, принять Алиготе клеток для оценки соответствующих поколение BMDMs подачей cytometry. Использовать 1 х 106 клеток на тест и подготовиться вспененный СУИМ трубы следующих условий: изотипа управления, окрашенных с F4/80 (или в качестве альтернативы, окрашенных с CD11b).
  8. Подготовить проточной цитометрии пятнать буфера путем добавления 0,1% FBS в однократном ПБС. Используйте только это количество FBS чтобы инвертировать эффект сыворотки голода в последующих шагах.
  9. Аликвота 1 x 106 клеток / трубки и центрифуги на 750 x g за 5 мин.
  10. Мыть раз сцеживать или аспирационных супернатант и resuspending клетки в 2 мл цитометрии буфера потока. Центрифуга на 750 x g за 5 мин.
  11. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл проточной цитометрии пятнать буфера. 1 мкл анти мыши CD16/32 Fc блокирующие антитела, к каждой трубе. Инкубируйте на льду на 5 мин.
  12. Без стирки, добавьте 2 мкл FITC анти мыши F4/80 или 1 мкл, APC анти мыши CD11b антитела «витражи» трубы и аналогичную сумму соответствующего изотипа управления антитела к «изотипа» трубы. Инкубируйте на льду, в темноте, за 30 мин.
  13. Вымойте клетки путем добавления 2 мл PBS непосредственно к клеткам. Центрифуга на 750 x g за 5 мин.
  14. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в 150 мкл PBS.
  15. Приобрести образцы на проточный цитометр, используя условие остановки 100 µL или 10000 событий на ворота интерес и обеспечить что FSC, ГКС, значения параметров FL1 (FITC анти мышь F4/80) или для параметров для анализа выбраны FL4 (APC анти мыши CD11b) каналы.
  16. С помощью программного обеспечения цитометрия потоков, откройте точка участок для КФН (на оси x) vs ККК (на оси y) и нарисуйте ворот вокруг клетки интереса, исключая отмершие клетки и мусора (мертвые клетки и мусора гораздо меньше событий, чем население основной ячейки и появляются на лоу r оставил участка).
  17. Строб на клетки интереса, открыть гистограмма участок с значения параметров FL1 (FITC анти мышь F4/80) или FL4 (APC анти мышь CD11b) на оси x.
  18. Запуск образца «изотипа». Генерировать маркер ворот, так что большинство событий выборки «изотипа» слева от ворот (< 1% позитивных). Примените этот шаблон к файлу цветного образца.
  19. Запуск образца «пятнами». Успешное поколение BMDMs приведет к > 95% выражение FITC анти F4/80 или APC анти мышь CD11b (рис. 1а), в то время как неправильный культуры условий может привести к неоптимальному поколения макрофагов (рис. 1B).
    Примечание: Если генерации BMDMs из нескольких генотипов, принять к сведению выражение этих маркеров для каждого пакета BMDM, созданный, в случае, что это может быть основанием для исключения образец из анализа, когда поколение ROS в ответ на стимул оценивается.

3. реагентов и материалов, подготовка к ROS измерения

  1. Воссоздать лиофилизированные Оксидативный стресс обнаружения реагента в 60 мкл безводный ДМФ приносить Стоковый раствор 5 мм. Аккуратно перемешать перед использованием.
    Примечание: Это говорится в комплект руководства ПВ-ID что срок хранения восстановленный реагента составляет около 1 недели при температуре-20 ° C. Aliquoting сразу же после растворения реагента в небольших флаконах свет доказательство снижает его окисления и увеличивает срок годности при-20 ° C.
  2. Воссоздать лиофилизированные супероксид обнаружения реагента в 60 мкл безводный ДМФ приносить Стоковый раствор 5 мм. Аккуратно перемешать перед использованием.
    Предупреждение: как указано в руководстве комплект лечить оба обнаружения реагентов как возможных мутагенов, правильно обрабатывать каждый с осторожностью и распоряжаться.
  3. Воссоздать индуктором Рось (Pyocyanin) в 20 мкл безводный ДМФ приносить Стоковый раствор 50 мм.
  4. Воссоздать ROS ингибитора (N-ацетил L-цистеин) в 123 мкл деионизованной воды приносить запасов концентрации 0,5 М.
  5. Ярлык 5 мл круглые трубы (Расходомерные трубки цитометрии) полистирола с экспериментальных элементов и условий. (См. 4. Assay условия и элементы управления)
  6. Подготовить низкой сыворотки DMEM (без фенола красного), добавив 0,1% FBS для свободного фенола Красного DMEM.
  7. Алиготе антитела anti-BSA в небольших аликвоты (в зависимости от использования) и хранить их в-80 ° C.
  8. Подготовить раствор 100мг/мл BSA в HBSS (Hanks сбалансированный раствор соли) или PBS. Алиготе в 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
  9. Приготовляют раствор 2 x ROS зондов (2 x зонд решение): для каждого 10 мл сыворотки низкой DMEM, добавить 4 мкл Реагента Оксидативный стресс обнаружения (зеленый краситель) и 4 мкл Реагента обнаружения супероксида (оранжевый краситель).
  10. Готовить 2 x зонд растворы, содержащие только Оксидативный стресс обнаружения реагента (2 x зонд решение, зеленый только), или содержащие только супероксид обнаружения реагента (2 x зонд решение, только оранжевый). Подготовить только необходимое количество реагентов, необходимых для эксперимента и всегда подготовить 2 x решение непосредственно перед использованием.
    Примечание: Для приготовления небольших объемов 2 x обнаружения решение, использовать промежуточные 1:10 разбавления реагентов зеленый и оранжевый обнаружения до окончательного растворения в среде DMEM. К примеру, подготовить 1 мл 2 x решения по обнаружению, разбавьте 1 мкл каждого зонда в 9 мкл DMEM (1:10 промежуточных разрежения). Разбавить 4 мкл это 1:10 промежуточных разрежения в 1 мл DMEM.

4. анализ условий и управления

  1. Включить следующие экспериментальные элементы управления для компенсации гранулярных потока для каждого эксперимента:
    ) клетки безупречный и кератоз.
    b) клетки окрашивали только Оксидативный стресс обнаружения реагента (зеленый реагент) и относились с ROS индуктором.
    c) клеток окрашенных только с реактивом обнаружения супероксида (оранжевый реагент) и относились с ROS индуктором.
  2. Для каждой мыши или биологических репликации включают в себя 6 следующих условий:
    ) клетки безупречный и кератоз
    b) окрашенных и кератоз клетки
    c) окрашенных клеток лечение с позитивным индуктор
    d) окрашенных клеток, относились с позитивным индуктор и ROS ингибитор
    e) окрашенных клеток, активированный через FcγR cross-linking
    f) окрашенные клетки активируется через FcγR cross-linking и лечили ингибитором ROS
  3. Рассчитайте количество 2 x зонд решения необходимы основанные на количество мышей и условий (200 мкл 2 x зонд решение будет использоваться для каждого условия, требующие окрашивания).
    Примечание: Для assay с использованием 6 мышей, 5 условия, требующие окрашивания с зондами необходимо будет на мышь. Это приносит общее количество условий до 30. Таким образом общая сумма 2 x зонд решения необходимо, по крайней мере 6 мл (30 * 200 мкл).

5. Подготовка клетки

  1. После грунтования макрофаги в одночасье, аспирационная супернатант. Вымойте клетки один раз с PBS.
  2. Сыворотка голодать клетки, заменив СМИ с такой же объем низким сыворотки DMEM. Для каждой мыши, одна пластина будет рассматриваться с anti-BSA IgG1 а сыворотка голодали, в то время как другой будет оставлено untreated. Добавьте только низкой сыворотки DMEM необработанной плиты. Добавление низкой сыворотки DMEM, содержащие 2,5 мкг/мл мышиных anti-BSA IgG1 обработанные пластины.
    Примечание: Один дополнительный необработанной плиты необходимо для каждого эксперимента для элементов управления гранулярных компенсация потока.
  3. Инкубируйте пластины для 4 ч при 37 ° C, 5% CO2.
  4. После сыворотки голодали урожай клетки с нежным очищая или с помощью 0,2 мм ЭДТА в PBS. Собрать их в обозначенные 5 мл вокруг нижней трубы и центрифуги, их на 750 x g для 5 минут держать за какие клетки обрабатывали мышиных IgG anti-BSA1.
  5. Вымойте клетки окатышей с 2 мл PBS избавиться от каких-либо остаточных anti-BSA от обработанной клеток.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 600 мкл низкой сыворотки DMEM.
  7. От 600 мкл суспензии клеток аликвота 200 мкл предварительно помечены 5 мл вокруг нижней трубы следующим образом:
    1. Из необработанной клеток принять 200 мкл для труб, помечены «кератоз», 200 мкл для трубки помечены «позитивные индуктором» и 200 мкл для труб, помечены «позитивные индуктором + ингибитор»
    2. Из IgG anti-BSA1 обработанные клетки, взять 200 мкл для труб, помечены «FcγR сшивки/FcγR XL» и 200 мкл для трубки помечены «FcγR XL + ингибитор»
    3. Из необработанной клетки использоваться для компенсации элементов управления, принимать 200 мкл для трубки помечены «незапятнанное кератоз», 200 мкл для «зеленый + индуктором» контроля управления и 200 мкл для «оранжевый + индуктором».
      Примечание: Если клетки от 5.7.1 и 5.7.3 являются производными от же мышь, клетки же «незапятнанное кератоз» может использоваться для экспериментальных и компенсации управления. Если не, дополнительные 200 мкл клеток будут необходимы для «незапятнанное кератоз» экспериментальных элементов управления для).
  8. Держите трубы на льду до окрашивания и стимуляции. Во время голодания сыворотки и обязательного IgG1, Подготовьте зондов, конкретные стимулы и индукторов, как указано ниже.
    Примечание: Если выполнение assay для в первый раз, если шаблон не доступен, или компенсация после том доступен на проточный цитометр и соответствующего программного обеспечения, стимулирования и пятно компенсации управления и побегите эти на проточный цитометр для выполнения ручной компенсации до добавления стимулов экспериментальных образцов.

6. выполнение анализа

  1. Готовить 2 x позитивные индуктором решения путем разбавления 1: 100 Pyocyanin в 2 x зонд решение (подготовленных на шаге 3.9) для получения концентрации 2 x 500 мкм pyocyanin (конечная концентрация будет 250 мкм). Кроме того развести pyocyanin масштаба 1: 100 в каждой из «2 x зонд решение, только Грин» и «2 x зонд раствор, оранжевый только» трубы, подготовленный в 3.10.
    Примечание: Оба условия, помечены «позитивные индуктором» и «позитивные индуктором + ингибитор» будут рассматриваться с позитивным индуктором. План соответственно, при расчете суммы 2 x позитивные индуктором решение подготовить. Например: Если выполнение анализа с 3 мышей, 6 условия (3 * 2) будут рассматриваться с позитивным индуктором, поэтому приготовьте 6 * 200 мкл = 1,2 мл 2 x индуктором положительные решения.
  2. Готовить 2 x BSA решение путем разбавления BSA Стоковый раствор в 2 x зонд решение для получения концентрации 2 мкг/мл (конечная концентрация будет 1 мкг/мл).
    Примечание: Оба условия, помечены «FcγR XL» и «FcγR XL + ингибитор» будет рассматриваться с 2 x BSA решения. План соответственно, при расчете суммы решение подготовить. Например: Если выполнение анализа с использованием 3 мышей, 6 (3 * 2) условия будут рассматриваться с BSA решения и поэтому 6 * 200 мкл или 1,2 мл 2 x BSA решение будет необходимо.
  3. Перед началом конкретных стимуляции (FcγR сшивки), убедитесь, что все реагенты и клетки готовы. Место труб на льду в том порядке, что они будут стимулировать.
  4. Для цитофлуориметрами потока с Автоматический пробоотборник, принять к сведению время цитометр проанализировать один образец и перейти к следующему, в том числе любой смешивания и зонд, мытье шаги (например 3,5 мин).
    Примечание: время имеет очень важное значение для этого анализа. Чтобы для каждого состояния хорошо управляться стимуляции необходимо осуществляться для точного времени (30 минут) для каждого условия. Стимулировать клетки в порядке и включают время запаздывания между образца приобретения проточный цитометр. Например если время, необходимое для цитометр проанализировать один образец и перейти к следующему 3.5 мин, стимулируют клетки в порядке, в котором они будут анализироваться каждые 3,5 мин.
  5. При выполнении ручной компенсации на данный момент, стимулировать управления трубы, которые будут использоваться для компенсации (шаг 5.7.3). 200 мкл «2 x зонд решение, только зеленые» содержащий индуктором (от 6.1) в трубы пометкой «зеленый + индуктором» (шаг 5.7.3). 200 мкл «2 x зонд решение, только оранжевый» содержащий индуктором (шаг 6.1) в трубы пометкой «оранжевый + индуктором» (шаг 5.7.3).
  6. Инкубируйте клетки для 30 минут при 37 ° C, 5% CO2 в темноте.
  7. С помощью программного обеспечения цитометрия потоков, генерировать ярлык 3 образцы файлов для управления «незапятнанное, лечить», «зеленый + индуктором» и «оранжевый + индуктором» образцы, убедившись в том указать, что каналы/параметры быть проанализированы (FSC, ККК, значения параметров FL1, FL2) и желаемой остановке условия (100 мкл, 3 мин, и т.д.). Создавать и этикетки аналогичный набор файлов для экспериментальных образцов.
  8. Запуск образца «безупречная, неочищенные». Откройте точка участок для КФН (на оси x) vs ККК (на оси y) и нарисуйте ворот вокруг клетки интереса, исключая отмершие клетки и мусора (мертвые клетки и мусора гораздо меньше событий, чем население основной ячейки и появляются в нижнем левом углу участка).
  9. С помощью этой «клетки» ворота, открыть другой участок точка значения параметров FL1 (ось x) против FL2 (ось y). Нарисуйте первоначальный штанге ворот. Отрегулируйте квадрант ворота, таким образом, что события появляются на нижнем левом квадранте заговора против FL2 значения параметров FL1.
  10. Запуск образца «зеленый + индуктором». Отрегулируйте напряжение, таким образом, что события отображаются на нижней левой и правой квадраты заговор против FL2 значения параметров FL1. Применить эту матрицу компенсации для всех 3 образцы файлов.
  11. Запуск образца «оранжевый + индуктором». Отрегулировать напряжение, таким образом, что события появляются на верхней и нижней оставил квадрантах заговора против FL2 значения параметров FL1. Применить эту матрицу компенсации для всех 3 образцы файлов.
  12. Проверить каждый файл компенсации и обеспечить «незапятнанное, лечить» события отображаются на нижнем левом квадранте, события «зеленый + индуктором» появляются на нижний левый и правый квадраты, и события «оранжевый + индуктором» появляются на верхней и нижней оставил квадрантах значения параметров FL1 vs FL2 сюжет. Применять матрицы компенсации всем экспериментальные образцы файлов.
    1. Обеспечить применение надлежащей компенсации ко всем файлам образец элемента управления перед применением матрицы компенсации всем экспериментальные образцы файлов. Для репрезентативных данных показаны безвозмездное и правильно компенсируется образцы обратитесь к рис .
      Примечание: Многие цитофлуориметрами назначать значения параметров FL1 как стандартный канал FITC/GFP (возбужденные синий 488 нм лазер и обнаружено с набором фильтров 530/30) и FL2 как стандартный канал PE (возбужденные синий 488 нм лазер и обнаружено с набором фильтров 585/40). Мы используем этой же Конвенции, но осторожность нового потока цитометрии пользователям проконсультироваться с их менеджером ядро цитометрии потока для обеспечения что их цитометр аналогичным образом настроен и что соответствующие каналы используются для обнаружения этих датчиков. В зависимости от модели проточный цитометр и сопровождения программного обеспечения может быть возможно для выполнения компенсации до или после того, как образцы были приобретены. Если после факта компенсация возможна, шаг компенсации могут выполняться после всех экспериментальных образцов были приобретены цитометр. Для цитофлуориметрами с динамическим диапазоном, где ПЛТ напряжения изменения не требуются, эксперимент компенсации могут также выполняться на отдельный день и экспериментальной шаблон (включая компенсацию матрица) могут быть сохранены для сокращения времени, необходимого для выполнения ручной компенсации.
  13. После того, как была выполнена ручная компенсация и экспериментальной шаблон получается, начните лечение экспериментальных образцов. Перед обработкой с позитивным индуктором или стимуляции клеток FcγR, Марк, какие трубы получить ROS ингибитора. Лечить эти клетки с ROS ингибитор по крайней мере 30 минут до положительных индуктором или FcγR стимуляции.
  14. Для добавления ингибитора ROS, подготовьте окончательный концентрации 5 мм, добавив 1 мкл ингибитор 200 мкл ресуспензированы клеток (без anti-BSA IgG1).
  15. Лечить клетки с стимул (или позитивного индуктором) и загрузить клетки с зондами ROS следующим:
    1. Для кератоз клетки: 200 мкл 2 x зонд решение без каких-либо стимулов для 200 мкл суспензии клеток маркировку «витражи, кератоз».
    2. Для положительных элементов управления: 200 мкл 2 x позитивные индуктором решение (подготовленных на шаге 6.1) до 200 мкл суспензии клеток маркировку «позитивные индуктором» или «позитивные индуктором + ингибитор».
    3. Для ячеек, стимулируется FcγR сшивки (конкретный раздражитель): 200 мкл 2 x BSA решение (подготовлен в 6.2) для 200 мкл суспензии клеток маркировку «Fcγr XL» или «FcγR XL + ингибитор».
      Примечание: Не забудьте включить время запаздывания между анализа проб, добавив стимул каждые x мин, где x — время запаздывания между приобретение одного образца и далее.
  16. Инкубируйте клетки для 30 минут при 37 ° C, 5% CO2 в темноте. Анализируйте примеры в порядке, в котором они были стимулируется с помощью проточный цитометр оборудованы с Автоматический пробоотборник. Используйте шаблоны анализа, созданных в период действия первоначального компенсации. Не мойте клетки до анализа.

7. поток cytometry анализ данных и ожидаемые результаты

  1. В рамках программного обеспечения цитометрия потоков, открыть ранее сгенерированный анализ файлов для экспериментальных образцов (шаблоны были созданы в шагах 6,7-6.12 и образцы были запущены в шаге 6,16). Убедитесь, что матрица компенсации от выполнения ручной компенсации правильно применены для экспериментальных образцов.
    Примечание: Для цитофлуориметрами потока и потока цитометрии программного обеспечения способны after факт компенсации, если матрица компенсации не был ранее применен к экспериментальные образцы файлов, применять его на данный момент.
  2. Подобные проверки правильной ручной компенсации, убедитесь, что элементы управления в рамках экспериментальных образцов ведут себя как ожидалось.
    1. Убедитесь, что события «безупречная, неочищенные» появится на нижнем левом квадранте значения параметров FL1 против FL2 сюжета, что «позитивные индуктором» события показать рост флуоресценции в верхнем левом углу, верхнее право и снизить правый квадраты FL2 заговор против значения параметров FL1, и что» позитивные индуктором + ингибитор Рось» события показывают снижение флуоресценции в верхнем левом углу, верхнее право и Нижняя право квадрантах против значения параметров FL1, FL2 участок, по сравнению с флуоресцентным наблюдается с образцом «позитивные индуктором».
    2. Если элементы управления в рамках экспериментальных образцов не показывают любое увеличение флуоресценции, проверьте, что были выполнены все шаги анализа, проверить соответствующие поколения и грунтовки костного мозга, полученных макрофагов (2.7-2.19) и повторить эксперимент. Если элементы управления в рамках экспериментальных образцов показывают ожидаемые тенденции, провести анализ экспериментальных образцов стимулируется через FcγR (рис. 3A).
  3. Убедитесь, что FcγR конкретных стимулов работает надлежащим образом. Запустите следующие образцы из C57BL/6J WT мыши: «незапятнанное, кератоз», «витражи, кератоз», «витражи, стимулируется через FcγR» и «витражи, стимулировала через FcγR + ROS ингибитор». Они соответствуют образцы 4.2a, 4.2b, 4.2e и 4.2f в разделе 4, соответственно.
    1. Убедитесь, что события «незапятнанное, кератоз» появится на нижнем левом квадранте заговор против FL2 значения параметров FL1, что «витражи, кератоз» события также появятся на нижнем левом квадранте заговор против FL2 значения параметров FL1, что «витражи, стимулируется через FcγR» события Показать рост флуоресценции в верхнем левом углу, верхнее право и Нижняя право квадрантах заговор против FL2 значения параметров FL1, и что «витражи, стимулировала через FcγR + ROS ингибитор» события покажет снижение флуоресценции в верхний левый, верхний правый и нижний правый Квадранты участка FL2 против значения параметров FL1, по сравнению с «витражи, стимулируется через FcγR» образца (рис. 3A).
    2. Если эти ожидания не оправдываются, например, «витражи, стимулируется через FcγR» образец показывает минимальный или не увеличение флуоресценции по сравнению с «витражи, кератоз» образца или образца «витражи, кератоз» уже показывает заметно повышение уровня флуоресценции, по сравнению с «безупречная, кератоз» образца, проверьте, что все пробирного шаги были выполнены должным образом, проверьте соответствующие поколения, грунтовка и обработка BMDMs (2.7-2.19) и повторить эксперимент. Если выполнены эти ожидания, приступить к анализу остальной части экспериментальных образцов.
      Примечание: Клетки, вырабатывающие ROS, которые реагируют с зеленой зонд (перекись водорода, пероксинитрита, гидроксильных радикалов, оксид азота, перокси радикалы и т.д.) появится в правой верхней части и ниже правый квадраты журнала значения параметров FL1 (ось x) против журнала FL2 участок точка (ось y). Клетки, вырабатывающие ROS, которые реагируют с оранжевой зонда (в основном, но не исключительно супероксиддисмутаза) будет отображаться в двух верхних квадрантах журнала значения параметров FL1 (ось x) против журнала FL2 участок точка (ось y).
  4. Генерировать индивидуальные гистограммы, закрытом на клетки интерес, для анализа значения параметров FL1 и FL2 флуоресценции. С помощью «безупречная, кератоз» образцы, генерировать маркер гистограммы, таким образом, что все «безупречная, кератоз» события отображаются слева от этого маркера. Применить этот участок с маркером с остальной частью экспериментальных образцов (рис. 3B).
  5. Представлены результаты эксперимента как процент положительных клеток для каждого ROS зондов или показывая интенсивность средняя флуоресцирования (MFI) стимулируется образцов по сравнению с контролем (рис. 3 c).

8. клеточной поверхности, пятнать в сочетании с анализа потока гранулярных ROS производства (опционально)

Примечание: Этот шаг обеспечивает протокол для окрашивания макрофагов с маркером клетк поверхности до стимуляции измерения FcγR и рос. Это может оказаться полезным при оценке производства рос в смешанных клеточных популяций. Важно выбрать антитело для макрофагов поверхности маркера конъюгированных соответствующие Флуор, что не вмешиваться с флуоресценцией от окислительного стресса или супероксид обнаружения реагентов. В этом протоколе антитело для мыши, F4/80 спрягаются по Alexa Флуор 647 используется.

  1. Создание BMDMs, урожай и премьер их, как описано ранее (разделы 1 и 2).
    Примечание: Как минимум трех 6 см пластины необходимы для того, чтобы выполнять все экспериментальные элементы управления и условия, как описано ниже. Одна пластина будет рассматриваться с anti-BSA IgG1 время голодали в то время как другие две пластины останется сыворотка не лечить.
    1. Включает 4 экспериментальных элементов управления, которые будут использоваться для компенсации гранулярных потока (за эксперимент):
      ) клетки безупречный и кератоз.
      b) клетки относиться с Оксидативный стресс обнаружения реагента (зеленый реагент) и индуктором рос.
      c) клетки относиться с супероксид обнаружения реагента (оранжевый реагент) и индуктором рос.
      d) клетки окрашивали только анти мыши, которые F4/80 спрягаются по Alexa 647.
    2. Для каждой мыши или биологических репликации включают в себя 3 следующих условий:
      ) окрашенных с F4/80 и слева кератоз
      Витражи с F4/80 b) и активации через FcγR
      c) окрашенных с F4/80 и активирована через FcγR и лечили ингибитором ROS
  2. После грунтования макрофаги в одночасье, аспирационная супернатант. Вымойте клетки один раз с 1-2 мл ФСБ. Сыворотка голодать клетки, заменив СМИ с такой же объем низким сыворотки DMEM. Для каждой мыши одна пластина будет рассматриваться с anti-BSA IgG1 а сыворотка голодающие, в то время как другие две пластины будет быть выйдено необработанный. Инкубируйте пластины для 4 ч при 37 ° C, 5% CO2.
  3. После сыворотки голодали урожай клетки с нежным очищая или с помощью 0,2 мм ЭДТА в PBS. Собирать каждой пластины в обозначенные 5 мл вокруг нижней трубы и центрифуги, их на 750 x g для 5 минут держать за какие клетки обрабатывали мышиных IgG anti-BSA1.
  4. Вымойте клетки гранулы раз с 1-2 мл PBS избавиться от каких-либо остаточных anti-BSA от обработанной клеток.
  5. Ресуспензируйте один из клеток окатышей из пластины, которая не получить IgG anti-BSA1 в 600 мкл низкой сыворотки DMEM. Эти клетки будут не подвергаться клеток поверхности окраски. Используйте эти для компенсации элементов управления. Аликвота 200 мкл этой суспензии клеток в (3) 5 мл раунд нижней трубки помечены) безупречная, кератоз b) зеленый Оксидативный стресс реагент + ROS индуктором, c) оранжевый супероксид обнаружения реагент + ROS индуктором.
  6. Ресуспензируйте одной ячейки гранулы от пластины, которые не получают anti-BSA IgG1, в 300 мкл проточной цитометрии пятнать буфера (PBS + 0.1% FBS). Аликвота 100 мкл этой суспензии клеток в (2) 5 мл раунд нижней трубы для окрашивания с Alexa 647 анти мыши F4/80.
  7. Ресуспензируйте клетки гранулы от пластины, который получил anti-BSA IgG1 300 мкл потока цитометрии окрашивание буфера. Аликвота 100 мкл этой суспензии клеток в (2) 5 мл раунд нижней трубы для окрашивания с Alexa 647 анти мыши F4/80.
  8. Пятно клетки, которые были aliquoted в 8.6 и 8.7, с 5 мкл Alexa 647 анти мыши F4/80 за 30 минут на льду, в темноте.
  9. После окрашивания, мыть ячейки, добавив 2 мл PBS и центрифуги на 750 x g, аспирационная супернатанта и Ресуспензируйте каждую пробирку в 200 мкл низкой сыворотки DMEM без фенола красного. Отложите в сторону одной из необработанных труб служить поодиночке окрашенных FL4 управления. Подготовьте зондов, индуктор, FcγR стимул и ингибиторы рос, как указано в разделах 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 и 6.14.
    1. Для клетки не получают anti-BSA IgG1, метки трубы следующим текстом:) не стимул или b) рос индуктором.
    2. Для клеток, которые получили anti-BSA IgG1, этикетка с следующее:) ФК XL или b) ФК XL + ингибитор.
  10. Стимулировать образцы использоваться для компенсации согласно их соответствующих процедур, как указано в 6,5-6.6, в порядке, в котором они будут читаться на проточный цитометр, включающих время запаздывания между приобретение одного образца и далее.
  11. Инкубируйте клетки для 30 минут при 37 ° C, 5% CO2 в темноте. Анализируйте примеры в порядке, в котором они были стимулируется с помощью проточный цитометр оборудованы с Автоматический пробоотборник.
  12. Выполните ручное компенсации как описано в 6,7-6.12 и анализ данных как описано в разделе 7.
  13. С помощью программного обеспечения цитометрия потоков, генерировать и метка 4 образцы файлов для элемента управления «незапятнанное, лечить», «зеленый + индуктором», «оранжевый + индуктором» и «F4/80 витражи» образцы, убедившись в том указать каналы/параметры быть проанализированы (FSC, ККК, значения параметров FL1, FL2, FL4) и условия желаемой остановке (100 мкл, 3 мин, и т.д.).
  14. Выполнение примеров и генерировать точка участков для выполнения ручной компенсации.
    1. Для окрашивания клеток поверхности, создают два дополнительных участков: значения параметров FL1 (ось x) против FL4 (ось y) и FL2 (ось x) против FL4 (ось y). Отрегулируйте напряжение для обеспечения применения надлежащей компенсации как показано на Рисунок 7а. После того, как все компенсации была выполнена должным образом, применить матрице компенсации всем экспериментальные образцы файлов.
  15. После того, как была выполнена ручная компенсация и экспериментальной шаблон получается, начать лечение экспериментальных образцов, как указано в 6.13-6.15.3 и приобрести образцы на проточный цитометр, как описано в 6.16.

Результаты

С помощью протокола, изложенные в рамках, мы представляем репрезентативных данных, демонстрируя потока гранулярных обнаружение производства рос в результате стимуляции WT C57BL/6J BMDMs через FcγR. Как и ожидалось, мы наблюдаем минимальные изменения в значения параметров FL1 и FL2 флуоресценции ?...

Обсуждение

DCFH2-да и на основе DHE обнаружения рос является широко используется техника14,15. Простота использования и адаптации этих ROS зонды для кинетического Гонав форматов, флуоресцентной микроскопии или потока гранулярных анализа способствовала их популярн?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить других членов Tigno-Аранхуэс лаборатории, включая Madelyn Миллер, Омар Кардона, Andjie Jeudy и Roopin Сингха за их помощь в лабораторной мыши и ведением колонии обслуживания. Была оказана поддержка для этого исследования Грант R00 HL122365 и начальных средств для J.T.T-A.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-BSA IgG1Innovative ResearchIBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400626
Anti-mouse CD16/32BioLegend101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647BD Biosciences565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITCBioLegend123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 BioLegend101218
beta-mercaptoethanol (BME)SigmaM3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionVFisherBP1600-100
C57BL/6J Jackson labsStock No.000664
CM-H2DCFDAMolecular ProbesC6827Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE)Molecular ProbesD11347Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1xCorning10-013-CV
DMEM no phenol redGibco31053-028
DMF Anhydrous Acros Organics61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS)VWR97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400506
HEPES (1M)Gibco15630-080
L glutamineGibco25030-081
LADMAC cellsATCCCRL-2420
MEMCorning10-010-CV
mouse IFN-gGoldBio1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteineEMD Milipore106425Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosamplerAcea2060R
Pyocyanin (ROS inducer)Cayman chemical10009594Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kitENZOENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM)Gibco11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200-056

Ссылки

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

145Fc Fc RFc

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены