使用 En 面免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞

摘要

在这里，我们提出了免疫荧光染色方案，以直接观察小鼠主尾的内皮细胞。该技术在研究不同流动模式的内皮细胞细胞和分子表型以及动脉粥样硬化的发展时非常有用。

摘要

内皮表型和形态的异常变化被认为是动脉粥样硬化发病机制的初始事件。直接观察完整的内皮，为了解功能失调的内皮细胞的细胞和分子事件提供有价值的信息。在这里，我们描述了一种经过修饰的面免疫荧光染色技术，使科学家能够获得完整的内皮表面的清晰图像，并原位分析分子表达模式。该方法简单可靠，用于观察主塔不同部位的整个内皮单层。这项技术可能是了解动脉粥样硬化病理生理学的有前途的工具，特别是在早期阶段。

引言

血管的早期变化主要在内皮内展开，内皮球在血液和血管壁之间具有选择性屏障，其细胞间紧密结复合物1。大量证据表明，血流在调节内皮^功能2中的机械作用起着关键作用。流体剪切应力，一种由血流产生的摩擦力，根据不同血管位点2、3的特定流动模式，不同形状内皮细胞形态和功能。与稳定流动（s-flow）区域（如动脉的直线段）相比，动脉粥样硬化病变优先发生在血流紊乱（d-flow）部位，如血管曲率、流量分频和分支点。因此，直接观察内皮形态和分子表达模式，应有助于深入了解不同流动范式下内皮细胞的结构和功能表型。

培养的内皮细胞可能无法像在体内那样表达实际表型，部分原因是流体剪切应力、周围细胞因子和细胞细胞细胞外基质相互作用的影响。为了达到这个目的，可以使用传统的免疫组织化学在横截面研究完整的内皮细胞单层。然而，内皮单层是如此薄和脆弱，它通常无法清楚地观察到。En 面部免疫组织化学已用于观察内皮内表面，但结果要么复杂或不稳定，因为内皮容易从底层组织剥离，或者只是大鼠或兔子动脉壁的一部分，其壁厚，安装4，5。

老鼠模型在许多方面比其他动物有相当大的优势。在这里，我们采用一种经过修饰的面内免疫荧光技术来分析C57BL/6小鼠的主动脉和胸主动脉的内皮细胞。这种技术已被广泛用于研究不同流动模式的内皮病理生理学，以及动脉粥样硬化6、7、8、9、10的发展。这种方法使科学家能够清楚地观察内皮的整个表面，并比较不同流体剪切应力下区域中特定蛋白质的表达模式。

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研究方案

所有动物实验均按照上海交通大学动物资源委员会批准的实验规程进行。

1. 灌注鼠标主塔

1. 简单地说，用五巴比妥钠（50毫克/千克体重）的腹内注射麻醉12周大的C57BL/6小鼠。轻轻捏紧尾巴，确认正确的麻醉。
   注:如果未观察到任何运动，动物被充分麻醉以开始实验。
2. 用胶带将鼠标的爪子粘在一叠纸巾上。
3. 用钳子抓住老鼠的皮肤，用剪刀把皮肤从腹部切到胸部顶部。
4. 用锋利的剪刀打开肋骨下面的腹腔。
5. 用钳子提起胸骨，并切开隔膜;然后，切掉肋骨，露出胸腔。
6. 用剪刀把肝脏正上方的卡瓦酒剪掉。
7. 压力注入（100毫米汞柱）动脉树5分钟与预冷的正常盐水含有40单位/mL肝素通过左心室，直到肺部和肝脏变苍白。然后，在磷酸盐缓冲盐水中注入预冷却的4%甲醛（PBS，pH 7.4）3分钟。
8. 去除所有的肌肉、器官和脂肪，直到主塔暴露。
9. 将鼠标放在解剖显微镜下。

2. 主塔的解剖和纵向打开

1. 在解剖显微镜下清晰地露出主塔，用细腻的钳子和一把细腻的剪刀将主塔沿主塔的结缔组织尽可能干净（图1）。
2. 用一把精致的剪刀将胸主腹从心脏解剖到腹腔主干，并将主塔放入带PBS的6厘米细胞培养盘中。纵向、沿较小的曲线和沿较大的曲线切割打开主塔，直到满足直线段。用微剪刀切开主动脉的三个分支，包括无主动脉、左公道和左下环动脉，如图2所示。

3. 主塔的预处理和免疫染色

1. 在PBS中用0.1%聚乙烯八苯基醚渗透主母，用10%正常山羊血清在Tris缓冲盐水（TBS）中将其阻断，在室温12孔细胞培养板中，在室温下1小时。
2. 接下来，在阻塞缓冲液中孵育5 g/mL兔子抗VCAM-1和5 g/mL大鼠抗VE-卡塞林，在4°C过夜。
3. 用洗涤溶液冲洗样品3x后（TBS含有2.5%聚二醇20），在房间内应用荧光结合二级抗体（1:1，000稀释、Alexa Fluor 555标记抗兔子IgG和Alexa Fluor 488标记抗鼠IgG）1小时温度。在洗涤溶液中冲洗 3 次。
4. 用4'，6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）（1微克/mL）对主塔进行10分钟的抗污，并在洗涤溶液中冲洗3次。

4. 主塔安装在玻璃滑块上

1. 将主盘放在与发光表面向下的盖玻上，然后缓慢地将其移动到先前掉落在盖玻片上的防褪色安装解决方案。轻轻伸展主塔以保持试样平整。
2. 将盖玻片反转，并放在滑动玻璃上。必须小心，不要让任何气泡留在试样和玻璃之间。

5. 主塔的观察

1. 使用激光扫描共聚焦显微镜检查主塔。
2. 使用 Image-Pro Plus 软件分析 en 人脸图像中所需区域不同通道的颜色强度。

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结果

一只12周大的C57BL/6小鼠被安乐死，并注入含有40单位/mL肝素的正常盐水，然后预冷冻4%的甲醛。小鼠主塔在解剖显微镜下暴露（图1），解剖，纵向切开（图2）。血管内皮细胞的En面免疫荧光染色，如图3和表1所示。血管细胞粘附蛋白-1（VCAM-1）表达的En面免疫荧光，以VE-卡塞林作为内皮标记物，...

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讨论

内皮液暴露于许多原生因子，包括脂质、炎症中介和流体剪切应激1，11，12。直接观察原位内皮细胞为分析细胞形态、细胞间结和分子表达模式的变化，以响应损伤刺激具有特殊优势。

以前的研究提供了两种不同的面免疫性化学技术来观察动脉壁4，5的内皮。其?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mountant	Servicebio	G1401
Delicate Forceps	RWD Life Science	F11001-11
Delicate Scissors	RWD Life Science	S12003-09
Dissecting Forceps	RWD Life Science	F12005-10
Mciro Spring Scissors	RWD Life Science	S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)	Amresco	M143
Polysorbate 20 (Tween 20)	Amresco	0777
VCAM-1 antibody	Abcam	ab134047
VE-Cadherin antibody	BD Biosciences	555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG	invitrogen	A-21208
Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss