Usando a mancha da imunofluorescência da cara do en para observar diretamente pilhas endothelial vasculares

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a coloração da imunofluorescência para observar diretamente as pilhas endothelial da aorta do rato. Esta técnica é útil ao estudar o phenotype celular e molecular de pilhas endothelial em testes padrões de fluxo diferentes e no desenvolvimento da aterosclerose.

Resumo

As mudanças aberrantes no phenotype e na morfologia endothelial são consideradas ser eventos iniciais na patogénese da aterosclerose. A observação direta do endotélio intacto fornecerá informações valiosas para a compreensão dos eventos celulares e moleculares nas células endoteliais disfuncionais. Aqui, nós descrevemos uma técnica modificada da mancha da imunofluorescência do en-cara que permita que os cientistas obtenham imagens desobstruídas da superfície endothelial intacta e analisem os testes padrões da expressão da molécula in situ. O método é simples e confiável para observar toda a monocamada endotelial em diferentes sítios da aorta. Esta técnica pode ser uma ferramenta promissora para a compreensão da fisiopatologia da aterosclerose, especialmente em um estágio inicial.

Introdução

As primeiras alterações na vasculatura iniciam-se primariamente no endotélio, que funciona como uma barreira seletiva entre o sangue e a parede do vaso com seus complexos juncionais apertados intercelulares¹. Evidências substanciais apontam para um papel crítico para os efeitos mecânicos do fluxo sanguíneo na função endotelial moduladora². O estresse de cisalhamento fluido, uma força de atrito gerada pelo fluxo sanguíneo, diferencia diferencialmente a morfologia e a função da célula endotelial, dependendo dos paradigmas de fluxo específicos em diferentes sítios vasculares^2,3. As lesões ateroscleróticas ocorrem preferencialmente em sítios de fluxo sanguíneo perturbado (d-Flow), como curvaturas de vasos, divisores de fluxo e pontos de ramificação, em comparação às regiões de fluxo constante (s-Flow), como o segmento reto da artéria. Portanto, a observação direta da morfologia endotelial e dos padrões de expressão da molécula deve fornecer insights importantes sobre os fenótipos estruturais e funcionais das células endoteliais diferentes paradigmas de fluxo.

As pilhas endothelial cultivadas não podem expressar o phenotype real como fazem in vivo em parte devido à perda de impacto do esforço de tesoura fluido, das citocinas circunvizinhas, e das interações Cell-Cell ou Cell-extracellular da matriz. Para ajudar a isso, a monocamada de células endoteliais intactas pode ser estudada em seções transversais usando imunohistoquímica clássica. No entanto, a monocamada endotelial é tão fina e frágil que geralmente não pode ser observada claramente. A immunohistochemistry do en da cara foi usada para observar a superfície interna do endotélio mas é complicada ou errático em seus resultados porque o endotélio é descascado fàcilmente do tecido subjacente, ou apenas parte da parede arterial dos ratos ou dos coelhos, cujas paredes são grossas, é montado^4,5.

Modelos de mouse têm vantagens consideráveis sobre outros animais em muitos aspectos. Aqui, nós empregamos uma técnica modificada da imunofluorescência do en-cara para analisar pilhas endothelial do arco aórtico e da aorta torácica no rato de C57BL/6. Essa técnica tem sido amplamente utilizada para estudar a fisiopatologia endotelial em diferentes padrões de fluxo e no desenvolvimento da aterosclerose^6,7,8,9,10. Este método permite que os cientistas observem a superfície inteira do endotélio claramente e comparem os testes padrões da expressão de uma proteína dada nas regiões o esforço de cisalhamento fluido diferente.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos experimentais aprovados pela Comissão de recursos animais da Universidade Shanghai Jiao Tong.

1. perfusão da aorta do rato

1. Momentaneamente, anestesiam os ratos 12 week-old C57BL/6 com injeções intraperitoneal do pentobarbital do sódio (50 mgs/quilograma de peso de corpo). Confirme a anestesia apropriada delicadamente beliscando a cauda.
   Nota: se não for observado nenhum movimento, o animal é suficientemente anestesiado para iniciar os experimentos.
2. Tape as patas do mouse para uma pilha de toalhas de papel com fitas adesivas.
3. Segure a pele do mouse com fórceps e corte a pele com um par de tesouras do abdômen para o topo do tórax.
4. Abra a cavidade abdominal abaixo da nervgaiola com um par afiado de tesouras.
5. Levante o esterno com fórceps e corte o diafragma; em seguida, cortar a nervcage para expor a cavidade torácica.
6. Corte a veia cava logo acima do fígado, com tesouras.
7. Perfuse da pressão (100 mmHg) a árvore arterial por 5 minutos com o soro fisiológico pré-refrigerado normal que contem 40 unidades/mL heparina através do ventrículo esquerdo até que os pulmões e o fígado fiquem pálidos. Em seguida, perfuse com paraformaldeído pré-refrigerado a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) por 3 min.
8. Remova todos os músculos, órgãos e gordura até que a aorta seja exposta.
9. Coloque o rato um microscópio de dissecação.

2. dissecção e abertura longitudinalmente da aorta

1. Expor a aorta claramente um microscópio dissecando e remover os tecidos conectivos ao longo da aorta tão limpo quanto possível, com fórceps delicado e um par de tesouras delicadas (Figura 1).
2. Dissecar a aorta torácica do coração ao tronco celíaco com um par de tesouras delicadas e põr a aorta em um prato da cultura da pilha de 6 cm com PBS. Corte a aorta longitudinalmente, ao longo da curva menor, e ao longo da curva maior até que o segmento reto seja atendido. Corte aberto os três ramos do arco aórtico, incluindo o innominado, a carótida comum esquerda e a artéria subclávia esquerda, com Microtesoura, como mostra a Figura 2.

3. pré-tratamento e imunocoloração da aorta

1. Permeabilizar a aorta com 0,1% de éter de polioxietileno octil fenil em PBS por 10 min e bloqueá-lo com soro de cabra 10% normal em soro fisiológico com tampão Tris (TBS) contendo 2,5% de polissorbato 20 por 1 h à temperatura ambiente em uma placa de cultura de 12 poços.
2. Em seguida, incubar a aorta com 5 g/mL de coelho anti-VCAM-1 e 5 g/mL rato anti-VE-caderina no tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° c.
3. Depois de enxaguar a amostra 3x com solução de lavagem (TBS contendo 2,5% de polissorbato 20), aplique os anticorpos secundários conjugados por fluorescência (1:1000 diluição, Alexa fluor 555-rotulado IgG anti-coelho e Alexa fluor 488-rotulado IgG anti-Rat) para 1 h no quarto Temperatura. Enxague 3x na solução de lavagem.
4. Contratura a aorta com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 μg/mL) por 10 min e enxague-a 3x na solução de lavagem.

4. montagem da aorta na corrediça de vidro

1. Coloc a aorta em um lamela com a superfície Luminal para baixo e mova-a lentamente à solução de montagem do Antifade deixada cair previamente na lamínula. Esticar suavemente a aorta para manter a amostra plana.
2. Inverte a lamínula e coloque-a no vidro deslizante. Deve-se tomar cuidado para não permitir que quaisquer bolhas de ar permaneçam entre a amostra e o vidro.

5. observação da aorta

1. Examine a aorta com um microscópio confocal da laser-exploração.
2. Analise intensidades de cores de diferentes canais a partir da região desejada nas imagens da face en com o software Image-Pro Plus.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Um rato de 12 semanas de idade C57Bl/6 foi eutanasiado e perfundidos com soro fisiológico normal contendo 40 unidades/ml de heparina e, em seguida, pré-refrigerados 4% paraformaldeído. A aorta do camundongo foi exposta um microscópio de dissecação (Figura 1), dissecada e cortada longitudinalmente (Figura 2). A coloração da imunofluorescência da face do en das pilhas endothelial vasculares foi executada como ilustrado na ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O endotélio é exposto a inúmeros fatores pró-aterogênicos, incluindo lipídios, mediadores inflamatórios e estresse de cisalhamento fluido^1,11,12. A observação direta de células endoteliais in situ fornece as vantagens especiais para analisar alterações na morfologia celular, junções intercelulares e padrões de expressão de moléculas em resposta aos estímulos de lesão.

Estudos prévi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mountant	Servicebio	G1401
Delicate Forceps	RWD Life Science	F11001-11
Delicate Scissors	RWD Life Science	S12003-09
Dissecting Forceps	RWD Life Science	F12005-10
Mciro Spring Scissors	RWD Life Science	S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)	Amresco	M143
Polysorbate 20 (Tween 20)	Amresco	0777
VCAM-1 antibody	Abcam	ab134047
VE-Cadherin antibody	BD Biosciences	555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG	invitrogen	A-21208
Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss