Utilisation de la coloration en immunofluorescence pour observer directement les cellules endothéliales vasculaires

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la coloration d'immunofluorescence pour observer les cellules endothéliales de l'aorte de souris directement. Cette technique est utile lors de l'étude du phénotype cellulaire et moléculaire des cellules endothéliales dans différents schémas de flux et dans le développement de l'athérosclérose.

Résumé

Des changements aberrants dans le phénotype et la morphologie endothéliales sont considérés comme des événements initiaux dans la pathogénie de l'athérosclérose. L'observation directe de l'endothélium intact fournira des informations précieuses pour comprendre les événements cellulaires et moléculaires dans les cellules endothéliales dysfonctionnelles. Ici, nous décrivons une technique modifiée de coloration d'immunofluorescence d'en face qui permet aux scientifiques d'obtenir des images claires de la surface endothéliale intacte et d'analyser les modèles d'expression de molécule in situ. La méthode est simple et fiable pour observer l'ensemble de la monocouche endothéliale à différents sites de l'aorte. Cette technique peut être un outil prometteur pour comprendre la pathophysiologie de l'athérosclérose, particulièrement à un stade précoce.

Introduction

Les premiers changements dans la vascularisation commencent principalement dans l'endothélium, qui fonctionne comme une barrière sélective entre le sang et la paroi du vaisseau avec ses^complexesintercellulaires de jonction serré 1 . Des preuves substantielles indiquent un rôle critique pour les effets mécaniques du flux sanguin dans la modulation de la fonction endothéliale². Le stress de cisaillement de fluide, une force de frottement produite par le flux sanguin, forme différentiellement la morphologie et la fonction des cellules endothéliales, selon les paradigmes spécifiques de flux à différents emplacements vasculaires^2,3. Les lésions athérosclérotiques se produisent préférentiellement aux emplacements du flux sanguin perturbé (d-flow), tels que les courbures de navire, les diviseurs d'écoulement, et les points de branche, comparés aux régions de flux régulier (s-flux), telles que le segment droit de l'artère. Par conséquent, l'observation directe de la morphologie endothéliale et des modèles d'expression de molécule devrait fournir des perspicacités importantes dans les phénotypes structurels et fonctionnels des cellules endothéliales sous des paradigmes variables de flux.

Les cellules endothéliales cultivées peuvent ne pas exprimer le phénotype réel comme elles le font in vivo en partie en raison de la perte de l'impact du stress de cisaillement de fluide, des cytokines environnantes, et des interactions de cellules-cellules-extracellulaires de matrice. Pour faciliter ceci, la monocouche endothéliale intacte de cellules peut être étudiée sur des sections transversales utilisant l'immunohistochemistry classique. Cependant, la monocouche endothéliale est si mince et fragile qu'elle ne peut généralement pas être observée clairement. En face immunohistochemistry a été utilisé pour observer la surface intérieure de l'endothélium, mais est soit compliqué ou erratique dans ses résultats parce que l'endothélium est facilement dépouillé du tissu sous-jacent, ou juste une partie de la paroi artérielle des rats ou des lapins, dont les murs sont épais, est monté^4,5.

Les modèles de souris ont des avantages considérables par rapport aux autres animaux à bien des égards. Ici, nous employons une technique modifiée d'immunofluorescence en face pour analyser les cellules endothéliales de l'arc aortique et de l'aorte thoracique dans la souris C57BL/6. Une telle technique a été largement utilisée pour étudier la pathophysiologie endothéliale dans différents schémas de flux et dans le développement de l'athérosclérose^6,7,8,9,10. Cette méthode permet aux scientifiques d'observer clairement toute la surface de l'endothélium et de comparer les modèles d'expression d'une protéine donnée dans des régions soumises à différents stress de cisaillement des fluides.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles expérimentaux approuvés par le Comité des ressources animales de l'Université Jiao Tong de Shanghai.

1. Perfusion de l'aorte de souris

1. En bref, anesthésier les souris C57BL/6 de 12 semaines avec des injections intrapéritonéales de pentobarbital de sodium (50 mg/kg de poids corporel). Confirmer l'anesthésie appropriée en pinçant doucement la queue.
   REMARQUE : Si aucun mouvement n'est observé, l'animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
2. Tapez les pattes de la souris sur une pile de papier essuie-tout avec des rubans adhésifs.
3. Maintenez la peau de la souris avec des forceps et coupez la peau avec une paire de ciseaux de l'abdomen jusqu'au sommet du thorax.
4. Ouvrez la cavité abdominale sous la cage thoracique avec une paire de ciseaux pointues.
5. Soulevez le sternum avec des forceps et coupez le diaphragme; puis, couper la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique.
6. Couper le veau cava juste au-dessus du foie, avec des ciseaux.
7. Perfuse de pression (100 mmHg) l'artériel pendant 5 min avec saline normale préréfrigérée contenant 40 unités/mL d'héparine par le ventricule gauche jusqu'à ce que les poumons et le foie deviennent pâles. Ensuite, perfuser avec du paraformaldéhyde préréfrigéré de 4 % dans de la saline tamponnée par phosphate (PBS, pH 7,4) pendant 3 min.
8. Enlever tous les muscles, organes et graisses jusqu'à ce que l'aorte soit exposée.
9. Placez la souris sous un microscope à disséquer.

2. Dissection et ouverture longitudinale de l'aorte

1. Exposer clairement l'aorte sous un microscope à disséquer et enlever les tissus conjonctifs le long de l'aorte aussi propre que possible, avec des forceps délicats et une paire de ciseaux délicats (Figure 1).
2. Disséquer l'aorte thoracique du cœur au tronc coeliaque avec une paire de ciseaux délicats et mettre l'aorte dans un plat de culture cellulaire de 6 cm avec PBS. Coupez l'aorte longitudinalement, le long de la courbe inférieure, et le long de la plus grande courbe jusqu'à ce que le segment droit soit rencontré. Ouvrez les trois branches de l'arc aortique, y compris l'innominate, la carotide commune gauche et l'artère sous-clavière gauche, avec des microscissors, comme le montre la figure 2.

3. Prétraitement et immunostaining de l'aorte

1. Perméabilize l'aorte avec 0,1% polyoxyéthylène octyl étheroudile dans PBS pendant 10 min et le bloquer avec 10% de sérum de chèvre normal dans Tris tamponné saline (TBS) contenant 2,5% polysorbate 20 pour 1 h à température ambiante dans une plaque de culture de cellules de 12 puits.
2. Ensuite, incubez l'aorte avec 5 g/mL lapin anti-VCAM-1 et 5 g/mL rat anti-VE-cadherin dans le tampon de blocage, pendant la nuit à 4 oC.
3. Après avoir rincé l'échantillon 3x avec une solution de lavage (TBS contenant 2,5% de polysorbate 20), appliquer les anticorps secondaires conjugués à la fluorescence (1:1,000 dilution, Alexa Fluor 555-étiqueté anti-lapin IgG et Alexa Fluor 488-étiqueté anti-rat IgG) pendant 1 h à la chambre température. Rincer 3x dans la solution de lavage.
4. Counterstain l'aorte avec 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 'g/mL) pendant 10 min et le rincer 3x dans la solution de lavage.

4. Montage de l'aorte sur la glissière de verre

1. Placez l'aorte sur un bordereau avec la surface luminale vers le bas et déplacez-la lentement vers la solution de montage antifade précédemment tombée sur le bordereau. Étirez délicatement l'aorte pour garder le spécimen à plat.
2. Inversez le bordereau et mettez-le sur le verre coulissant. Il faut prendre soin de ne pas laisser les bulles d'air rester entre le spécimen et le verre.

5. Observation de l'aorte

1. Examinez l'aorte à l'utilisation d'un microscope confocal à balayage laser.
2. Analysez les intensités de couleur de différents canaux de la région souhaitée dans les images en face avec le logiciel Image-Pro Plus.

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Résultats

Une souris C57BL/6 de 12 semaines a été euthanasiée et perfisée avec la saline normale contenant 40 unités/mL d'héparine et, ensuite, le paraformaldéhyde préréfrigéré de 4%. L'aorte de souris a été exposée sous un microscope disséquant (Figure 1), disséqué, et coupée longitudinalement ouverte (Figure 2). La coloration d'immunofluorescence de visage des cellules endothéliales vasculaires a été exécutée comme...

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Discussion

L'endothélium est exposé à de nombreux facteurs proathérogènes, y compris les lipides, les médiateurs inflammatoires, et le stress de cisaillement des fluides^1,11,12. L'observation directe des cellules endothéliales in situ fournit les avantages spéciaux pour analyser des changements dans la morphologie de cellules, les jonctions intercellulaires, et les modèles d'expression de molécule en réponse aux stimulus de bles...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mountant	Servicebio	G1401
Delicate Forceps	RWD Life Science	F11001-11
Delicate Scissors	RWD Life Science	S12003-09
Dissecting Forceps	RWD Life Science	F12005-10
Mciro Spring Scissors	RWD Life Science	S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)	Amresco	M143
Polysorbate 20 (Tween 20)	Amresco	0777
VCAM-1 antibody	Abcam	ab134047
VE-Cadherin antibody	BD Biosciences	555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG	invitrogen	A-21208
Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss