Uso de la tinción de inmunofluorescencia en la cara para observar directamente las células endoteliales vasculares

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la tinción de inmunofluorescencia para observar las células endoteliales de la aorta del ratón directamente. Esta técnica es útil cuando se estudia el fenotipo celular y molecular de las células endoteliales en diferentes patrones de flujo y en el desarrollo de la aterosclerosis.

Resumen

Los cambios aberrantes en el fenotipo endotelial y la morfología se consideran eventos iniciales en la patogénesis de la aterosclerosis. La observación directa del endotelio intacto proporcionará información valiosa para comprender los eventos celulares y moleculares en las células endoteliales disfuncionales. Aquí, describimos una técnica de tinción de inmunofluorescencia en la cara modificada que permite a los científicos obtener imágenes claras de la superficie endotelial intacta y analizar los patrones de expresión de moléculas in situ. El método es simple y confiable para observar toda la monocapa endotelial en diferentes sitios de la aorta. Esta técnica puede ser una herramienta prometedora para entender la fisiopatología de la aterosclerosis, especialmente en una etapa temprana.

Introducción

Los primeros cambios en la vasculatura se inician principalmente en el endotelio, que funciona como una barrera selectiva entre la sangre y la pared del vaso con sus complejos de unión hermética intercelular¹. La evidencia sustancial apunta a un papel crítico para los efectos mecánicos del flujo sanguíneo en la modulación de la función endotelial². Tensión de cizallamiento fluido, fuerza de fricción generada por el flujo sanguíneo, da forma diferencial a lamorfología y función celular endotelial, dependiendo de los paradigmas de flujo específicos en diferentes sitios vasculares 2,^3. Las lesiones ateroscleróticas ocurren preferentemente en sitios de flujo sanguíneo alterado (flujo d), como curvaturas de vasos, divisores de flujo y puntos de rama, en comparación con regiones de flujo constante (flujo s), como el segmento recto de la arteria. Por lo tanto, la observación directa de la morfología endotelial y los patrones de expresión de moléculas debe proporcionar información importante sobre los fenotipos estructurales y funcionales de las células endoteliales bajo diferentes paradigmas de flujo.

Las células endoteliales cultivadas pueden no expresar el fenotipo real como lo hacen in vivo en parte debido a la pérdida de impacto de tensión de cizallamiento de líquido, citoquinas circundantes e interacciones de matriz celular o celular-extracelular. Para ayudar a esto, la monocapa de células endoteliales intacta se puede estudiar en secciones transversales utilizando inmunohistoquímica clásica. Sin embargo, la monocapa endotelial es tan delgada y frágil que por lo general no se puede observar claramente. En face inmunohistochemistry se ha utilizado para observar la superficie interna del endotelio, pero es complicado o errático en sus resultados porque el endotelio se despoja fácilmente del tejido subyacente, o sólo parte de la pared arterial de ratas o conejos, cuyas paredes son gruesas, está montada^4,5.

Los modelos de ratón tienen considerables ventajas sobre otros animales en muchos aspectos. Aquí, empleamos una técnica de inmunofluorescencia en la cara modificada para analizar las células endoteliales del arco aórtico y la aorta torácica en el ratón C57BL/6. Tal técnica ha sido ampliamente utilizada para estudiar la fisiopatología endotelial en diferentes patrones de flujo y en el desarrollo de la aterosclerosis^6,7,8,9,10. Este método permite a los científicos observar claramente toda la superficie del endotelio y comparar los patrones de expresión de una proteína dada en regiones bajo diferentes tensiones de cizallamiento de fluidos.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad Jiao Tong de Shanghái.

1. Perfusión del ratón aorta

1. Brevemente, anestesia ratones C57BL/6 de 12 semanas de edad con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal). Confirme la anestesia adecuada pellizcando suavemente la cola.
   NOTA: Si no se observa ningún movimiento, el animal está lo suficientemente anestesiado para iniciar los experimentos.
2. Pegue las patas del ratón a una pila de toallas de papel con cintas adhesivas.
3. Sostenga la piel del ratón con fórceps y corte la piel con un par de tijeras desde el abdomen hasta la parte superior del tórax.
4. Abra la cavidad abdominal debajo de la caja torácica con un par de tijeras afiladas.
5. Levante el esternón con fórceps y corte el diafragma; luego, corte la caja torácica para exponer la cavidad torácica.
6. Corta la vena cava justo encima del hígado, con tijeras.
7. Pervertificar la presión (100 mmHg) del árbol arterial durante 5 min con salina normal prechillada que contiene 40 unidades/ml de heparina a través del ventrículo izquierdo hasta que los pulmones y el hígado se palalen. Luego, perperme con paraformaldehida precalada del 4% en solución salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7.4) durante 3 min.
8. Retire todos los músculos, órganos y grasa hasta que la aorta esté expuesta.
9. Coloque el ratón bajo un microscopio de disección.

2. Disección y apertura longitudinal de la aorta

1. Exponer la aorta claramente bajo un microscopio de disección y eliminar los tejidos conectivos a lo largo de la aorta lo más limpio posible, con fórceps delicados y un par de tijeras delicadas (Figura1).
2. Disecciona la aorta torácica del corazón al tronco celíaco con un par de tijeras delicadas y coloca la aorta en un plato de cultivo celular de 6 cm con PBS. Cortar la aorta longitudinalmente, a lo largo de la curva inferior, y a lo largo de la curva mayor hasta que se encuentre el segmento recto. Cortar las tres ramas del arco aórtico, incluyendo la carótida común izquierda y la arteria subclavia izquierda, con microtijeras, como se muestra en la Figura2.

3. Pretratamiento e inmunomanchación de la aorta

1. Permeabilizar la aorta con 0.1% de éter de fenil de octil exietil en PBS durante 10 min y bloquearla con 10% de suero de cabra normal en salina tris tamponada (TBS) que contiene 2.5% polisorbato 20 para 1 h a temperatura ambiente en una placa de cultivo celular de 12 pocillos.
2. A continuación, incubar la aorta con 5 g/mL de conejo anti-VCAM-1 y 5 g/ml de rata anti-VE-cadherina en el tampón de bloqueo, durante la noche a 4oC.
3. Después de enjuagar la muestra 3x con solución de lavado (TBS que contiene 2.5% polisorbato 20), aplique los anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia (1:1.000 dilución, Alexa Fluor 555-etiquetado anticonejo IgG y Alexa Fluor 488-etiquetado anti-rat IgG) durante 1 h en la habitación Temperatura. Enjuague 3x en la solución de lavado.
4. Contratesta la aorta con 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1 g/ml) durante 10 min y enjuáguela 3 veces en la solución de lavado.

4. Montaje de la aorta en el portaobjetos de vidrio

1. Coloque la aorta en un cubreobjetos con la superficie luminal hacia abajo y muévala lentamente a la solución de montaje antidescolora que se dejó caer previamente en la cubierta. Estire suavemente la aorta para mantener la muestra plana.
2. Invitro el cubreobjetos y colóquelo en el cristal deslizante. Se debe tener cuidado de no permitir que quequeden burbujas de aire entre la muestra y el vidrio.

5. Observación de la aorta

1. Examine la aorta con un microscopio confocal de escaneo láser.
2. Analice las intensidades de color de diferentes canales de la región deseada en las imágenes en face con el software Image-Pro Plus.

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Resultados

Un ratón C57BL/6 de 12 semanas de edad fue eutanasiado y perfundido con salina normal que contenía 40 unidades/ml de heparina y, entonces, preenfriado 4% paraformaldehyde. La aorta del ratón se expuso bajo un microscopio de disección (Figura1), diseccionada y cortada longitudinalmente (Figura2). En face la tinción de inmunofluorescencia de las células endoteliales vasculares se realizó como se ilustra en

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Discusión

El endotelio está expuesto a numerosos factores proaterogénicos, incluyendo lípidos, mediadores inflamatorios, y tensión de cizallamiento fluido^1,11,12. La observación directa de las células endoteliales in situ proporciona las ventajas especiales para analizar los cambios en la morfología celular, las uniones intercelulares y los patrones de expresión de moléculas en respuesta a los estímulos de lesión.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mountant	Servicebio	G1401
Delicate Forceps	RWD Life Science	F11001-11
Delicate Scissors	RWD Life Science	S12003-09
Dissecting Forceps	RWD Life Science	F12005-10
Mciro Spring Scissors	RWD Life Science	S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)	Amresco	M143
Polysorbate 20 (Tween 20)	Amresco	0777
VCAM-1 antibody	Abcam	ab134047
VE-Cadherin antibody	BD Biosciences	555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG	invitrogen	A-21208
Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss