혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용

요약

여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.

초록

내피형및 형태학에 있는 비정상적인 변경은 동맥 경화증의 병인에 있는 초기 사건으로 여겨져. 본래 내피의 직접적인 관찰은 기능 장애 내피 세포에서 세포 및 분자 사건을 이해하는 귀중한 정보를 제공 할 것이다. 여기에서, 우리는 과학자들이 손상되지 않은 내피 표면의 명확한 심상을 얻고 그 자리에서 분자 발현 패턴을 분석하는 것을 가능하게 하는 변형된 en face 면역형광 염색 기술을 기술합니다. 이 방법은 대공의 다른 부위에서 전체 내피 단층을 관찰하기위한 간단하고 신뢰할 수 있습니다. 이 기술은 특히 초기 단계에서 동맥 경화증의 병리생리학을 이해하는 유망한 도구가 될 수 있습니다.

서문

혈관 구조의 초기 변화는 주로 내피에서 시작되며, 이는 세포 간 단단한 접합 복합체와 함께 혈액과 혈관 벽 사이의선택적 장벽으로 기능합니다 1. 실질적인 증거는 내피 기능 조절에 혈류의 기계적 효과에 대한 중요한역할을 가리킵니다 2. 유체 전단 응력, 혈류에 의해 생성되는 마찰력, 상이한 혈관 부위의 특정 흐름 패러다임에 따라내피 세포 형태 및 기능을 차별화하여 형성한다 2,^3. 죽상 경화성 병변은 동맥의 직선 세그먼트와 같은 꾸준한 흐름 (s-flow)의 영역과 비교하여 혈관 곡률, 흐름 분배기 및 분기 점과 같은 방해 된 혈류 (d-flow)의 부위에서 우선적으로 발생합니다. 따라서, 내피 형태와 분자 발현 패턴의 직접적인 관찰은 다양한 흐름 패러다임하에서 내피 세포의 구조적 및 기능적 표현형에 대한 중요한 통찰력을 제공해야합니다.

배양된 내피 세포는 유체 전단 스트레스, 주변 사이토카인, 세포 세포 또는 세포 외 매트릭스 상호작용의 충격의 손실로 인해 생체 내에서 부분적으로 수행되는 것처럼 실제 표현형을 발현하지 않을 수 있다. 이를 돕기 위해, 본래 내피 세포 단층은 고전적인 면역 조직 화학을 사용하여 횡절편에서 연구 될 수있다. 그러나, 내피 단층은 일반적으로 명확하게 관찰될 수 없을 정도로 얇고 깨지기 쉽습니다. En face 면역조직화학은 내피의 내벽을 관찰하는데 사용되어 왔지만, 내피가 쥐 나 토끼의 동맥 벽의 일부 또는 기본 조직에서 쉽게 벗겨지기 때문에 그 결과에 복잡하거나 불규칙합니다. 그 벽은 두꺼운,^4,5를 장착됩니다 .

마우스 모델은 여러 면에서 다른 동물에 비해 상당한 장점을 갖는다. 여기에서, 우리는 C57BL/6 마우스에 있는 대동맥 아치 및 흉부 대동맥의 내피 세포를 분석하기 위하여 수정된 en face 면역 형광 기술을 채택합니다. 이러한 기술은 상이한 흐름 패턴의 내피 병리생리학을 연구하고 동맥경화증^6,7,8,^9,10의발달에 널리 사용되어 왔다. 이 방법을 통해 과학자들은 내피의 전체 표면을 명확하게 관찰하고 다른 유체 전단 응력 하에서 주어진 단백질의 발현 패턴을 비교할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 상하이 자오퉁 대학의 동물 자원위원회가 승인한 실험 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 마우스 대류의 관류

1. 간단히, 12 주 된 C57BL/6 쥐 나트륨 pentobarbital의 복 강 주사와 쥐를 마 사 (50 mg/kg 체중). 꼬리를 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다.
   참고: 움직임이 관찰되지 않으면 동물은 충분히 마취되어 실험을 시작합니다.
2. 마우스의 발을 접착제 테이프로 종이 타월 더미에 테이프로 바힙니다.
3. 포셉으로 마우스의 피부를 잡고 복부에서 흉부 의 상단까지 가위로 피부를 잘라.
4. 날카로운 가위로 흉곽 아래복 구멍을 엽니다.
5. 포인원으로 흉골을 들어 올리고 횡격막을 잘라; 그런 다음 흉곽을 잘라 흉강을 노출시하십시오.
6. 가위로 간 바로 위의 베나 카바를 잘라냅니다.
7. 압력 응과 (100 mmHg) 폐와 간이 창백해질 때까지 좌심실을 통해 40 단위 / mL 헤파린을 포함하는 미리 냉각 된 정상 식염수로 5 분 동안 동맥 나무를. 이어서, 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)에서 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드를 3분 동안 응비한다.
8. 대반이 노출될 때까지 모든 근육, 장기 및 지방을 제거합니다.
9. 해부 현미경 아래에 마우스를 놓습니다.

2. 대동맥의 해부 및 세로 개방

1. 해부 현미경으로 대불을 명확하게 노출하고 섬세한 집게와 섬세한 가위 한 쌍으로 대불을 가능한 한 깨끗하게 따라 결합 조직을 제거하십시오(그림1).
2. 심장에서 체강 트렁크로 흉부 대인을 섬세한 가위로 해부하고 대강을 PBS와 함께 6cm 세포 배양 접시에 넣습니다. 대공의 를 세로방향으로 열고, 더 낮은 곡선을 따라, 직선 세그먼트가 충족될 때까지 더 큰 곡선을 따라 잘라냅니다. 그림2와 같이 인노미, 좌측 공통 경동맥 및 좌측 쇄골 동맥을 포함한 대동맥 아치의 세 가지를 마이크로시저와 함께 열어.

3. 대불의 전처리 및 면역 염색

1. 대류를 PBS에서 0.1% 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르로 10분 동안 퍼메아빌화하고 12웰 셀 배양플레이트에서 실온에서 1시간 동안 2.5% 폴리소르베이트 20을 함유하는 트리스 완충식염수(TBS)에서 10% 정상 염소 혈청으로 차단한다.
2. 다음으로, 대류를 5 g/mL 토끼 안티 VCAM-1 및 5 g/mL 래트 안티-VE-카데린을 블로킹 버퍼에 밤새 4°C에서 인큐베이션한다.
3. 샘플을 세척 용액 (2.5 % 폴리 소르베이트 20을 포함하는 TBS)으로 샘플을 헹구고 형광 접합 이차 항체 (1 : 1,000 희석, 알렉사 플루어 555 표지 된 항 토끼 IgG 및 알렉사 플루어 488 표지 된 항 쥐 IgG)를 1 시간 동안 적용하십시오. 온도. 세척 용액에서 3x 헹입니다.
4. 대왕을 4',6-디아미디노-2-페니린돌(DAPI)(1 μg/mL)으로 10분 동안 대류에 대류하고 세척용액에서 3배 헹구어 보겠습니다.

4. 유리 슬라이드에 대류의 장착

1. 대자리를 발광면이 아래쪽으로 커버슬립에 놓고 이전에 커버슬립에 떨어뜨린 안티페이드 장착 용액으로 천천히 이동합니다. 대공을 부드럽게 펴서 시편을 평평하게 유지합니다.
2. 커버 슬립을 반전하고 슬라이드 유리에 놓습니다. 시편과 유리 사이에 기포가 남아 있지 않도록 주의해야 합니다.

5. 대반의 관찰

1. 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 대류를 검사합니다.
2. Image-Pro Plus 소프트웨어를 통해 en face 이미지에서 원하는 영역의 다양한 채널의 색상 강도를 분석할 수 있습니다.

결과

12주 된 C57BL/6 마우스를 안락사시키고 40 단위/mL 헤파린을 함유한 일반 식염수로 주입한 다음, 4% 파라포름알데히드를 미리 냉각시켰습니다. 마우스 대공은 해부 현미경(도 1)에노출되었고, 해부하고, 세로로 절단하였다(도2). 혈관 내피 세포의 En 얼굴 면역형광 염색은 도 3 및 표1에 예시된 바와...

토론

내피는 지질, 염증성 매개체 및 유체 전단 응력^1,11,12를포함하는 수많은 프로테로겐성 인자에 노출된다. 이 소동에서 내피 세포를 직접 관찰하는 것은 부상 자극에 반응하여 세포 형태, 세포 간 접합부 및 분자 발현 패턴의 변화를 분석하는 특별한 이점을 제공한다.

이전 연구는 동맥 벽의 내피를 관찰하기 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mountant	Servicebio	G1401
Delicate Forceps	RWD Life Science	F11001-11
Delicate Scissors	RWD Life Science	S12003-09
Dissecting Forceps	RWD Life Science	F12005-10
Mciro Spring Scissors	RWD Life Science	S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)	Amresco	M143
Polysorbate 20 (Tween 20)	Amresco	0777
VCAM-1 antibody	Abcam	ab134047
VE-Cadherin antibody	BD Biosciences	555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG	invitrogen	A-21208
Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss