Uso dell'immunofluorescenza en faccia per osservare direttamente le cellule endoteliali vascolari

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'immunofluorescenza colorazione per osservare direttamente le cellule endoteliali dell'aorta del topo. Questa tecnica è utile quando si studia il fenotipo cellulare e molecolare delle cellule endoteliali in diversi modelli di flusso e nello sviluppo dell'aterosclerosi.

Abstract

I cambiamenti aberranti nel fenotipo endoteliale e nella morfologia sono considerati eventi iniziali nella patogenesi dell'aterosclerosi. L'osservazione diretta dell'endotelio intatto fornirà preziose informazioni per comprendere gli eventi cellulari e molecolari nelle cellule endoteliali disfunzionali. Qui, descriviamo una tecnica di colorazione dell'immunofluorescenza modificata che consente agli scienziati di ottenere immagini chiare della superficie endoteliale intatta e analizzare i modelli di espressione molecolare in situ. Il metodo è semplice e affidabile per osservare l'intero mostrato endoteliale in diversi siti dell'aorta. Questa tecnica può essere uno strumento promettente per comprendere la fisiopatologia dell'aterosclerosi, soprattutto in una fase precoce.

Introduzione

I primi cambiamenti nella vascolatura iniziano principalmente nell'endotelio, che funziona come una barriera selettiva tra il sangue e la parete del vaso con i suoi complessi giunzionali stretti intercellulari¹. Prove sostanziali indicano un ruolo critico per gli effetti meccanici del flusso sanguigno nella modulazione della funzione endoteliale². Lo stress da taglio fluido, una forza d'attrito generata dal flusso sanguigno, modella in modo differenziale la morfologia e la funzione delle cellule endoteliali, a seconda dei paradigmi di flusso specifici nei diversi siti vascolari^2,3. Le lesioni aterosclerotiche si verificano preferibilmente in siti di flusso sanguigno disturbato (d-flow), come le curve dei vasi, i divisori di flusso e i punti di diramazione, rispetto alle regioni di flusso costante (flusso di s), come il segmento retto dell'arteria. Pertanto, l'osservazione diretta dei modelli di morfologia endoteliale e di espressione molecolare dovrebbe fornire importanti informazioni sui fenotipi strutturali e funzionali delle cellule endoteliali sotto diversi paradigmi di flusso.

Le cellule endoteliali coltivate non possono esprimere il fenotipo effettivo come fanno in vivo in parte a causa della perdita di impatto dello stress di taglio fluido, delle citochine circostanti e delle interazioni tra cellule o cellule extracellulari. Per aiutare questo, il monostrato di cellule endoteliali intatte può essere studiato su sezioni trasversali utilizzando l'immunohistochimica classica. Tuttavia, il monostrato endoteliale è così sottile e fragile che di solito non può essere osservato chiaramente. En viso immunohistochimica è stato utilizzato per osservare la superficie interna dell'endotelio, ma è sia complicato o irregolare nei suoi risultati perché l'endotelio è facilmente spogliato dal tessuto sottostante, o solo una parte della parete arteriosa di ratti o conigli, le cui pareti sono spesse, è montato^4,5.

I modelli murini hanno notevoli vantaggi rispetto agli altri animali sotto molti aspetti. Qui, impieghiamo una tecnica di immunofluorescenza en face modificata per analizzare le cellule endoteliali dell'arco aortico e dell'aorta toracica nel topo C57BL/6. Tale tecnica è stata ampiamente utilizzata per studiare la fisiofisiologia endoteliale in diversi modelli di flusso e nello sviluppo dell'aterosclerosi^6,7,8,9^,10. Questo metodo consente agli scienziati di osservare chiaramente l'intera superficie dell'endotelio e di confrontare i modelli di espressione di una determinata proteina in regioni sotto stress da taglio fluido diverso.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con protocolli sperimentali approvati dal Comitato per le risorse animali della Shanghai Jiao Tong University.

1. Perfusione dell'aorta del topo

1. In breve, anestesizzare 12 settimane-vecchio C57BL/ 6 topi con iniezioni intraperitoneali di sodio pentobarbital (50 mg/kg peso corporeo). Confermare l'anestesizzazione corretta pizzicando delicatamente la coda.
   NOTA: Se non si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anetizzato per avviare gli esperimenti.
2. Nastro le zampe del mouse a una pila di asciugamani di carta con nastri adesivi.
3. Alza la pelle del topo con pinze e taglia la pelle con un paio di forbici dall'addome alla parte superiore del torace.
4. Aprire la cavità addominale sotto la gabbia toracica con un paio di forbici affilate.
5. Sollevare lo sterno con pinze e tagliare il diaframma; quindi, tagliare la gabbia toracica per esporre la cavità toracica.
6. Tagliare la vena cava appena sopra il fegato, con le forbici.
7. Perfusidio di pressione (100 mmHg) l'albero arterioso per 5 min con salina normale precellata contenente 40 unità/mL di eparina attraverso il ventricolo sinistro fino a quando i polmoni e il fegato diventano pallidi. Quindi, perfuso con prechilled 4% paraformaldeide in salina fosfata-buffered (PBS, pH 7.4) per 3 min.
8. Rimuovere tutti i muscoli, gli organi e il grasso fino a quando l'aorta è esposta.
9. Posizionare il mouse sotto un microscopio sezionato.

2. Dissezione e apertura longitudinale dell'aorta

1. Esporre l'aorta chiaramente sotto un microscopio dissettivo e rimuovere i tessuti connettivi lungo l'aorta il più pulito possibile, con pinze delicate e un paio di forbici delicate (Figura 1).
2. Dissezionare l'aorta toracica dal cuore al tronco celiaco con un paio di forbici delicate e mettere l'aorta in un piatto di coltura cellulare 6 cm con PBS. Tagliare l'aorta longitudinalmente, lungo la curva minore e lungo la curva maggiore fino a quando non viene raggiunto il segmento rettilineo. Tagliare aprire i tre rami dell'arco aortico, tra cui l'innominate, lasciato carotide comune e l'arteria subclaviana sinistra, con microscecca, come mostrato Figura 2.

3. Pretrattamento e immunostaining dell'aorta

1. Permeabilizzare l'aorta con 0,1% di polioxyethylene ottile etere in PBS per 10 min e bloccarlo con il 10% di siero di capra normale in tris-buffered saline (TBS) contenente 2.5% polisorbate 20 per 1 h alla temperatura ambiente in una piastra di coltura cellulare 12-well.
2. Successivamente, incubare l'aorta con 5 g/mL coniglio anti-VCAM-1 e 5 g/mL ratto anti-VE-cadherin nel buffer di blocco, pernottando a 4 gradi centigradi.
3. Dopo aver sciacquato il campione 3x con soluzione di lavaggio (TBS contenente 2,5% polisorbate 20), applicare gli anticorpi secondari coniugati a fluorescenza (1:1.000 diluizione, Alexa Fluor 555-labeled anti-coniglio Ig G e Alexa Fluor 488-labeled anti-rat IgG) per 1 h nella stanza temperatura. Risciacquare 3x nella soluzione di lavaggio.
4. Controstain l'aorta con 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (1 g/mL) per 10 min e sciacquarla 3x nella soluzione di lavaggio.

4. Montaggio dell'aorta sullo scivolo di vetro

1. Posizionare l'aorta su un coperchio con la superficie luminosa verso il basso e spostarlo lentamente nella soluzione di montaggio antisbiordino precedentemente caduta sul coperchio. Allungare delicatamente l'aorta per mantenere l'esemplare piatto.
2. Inversare il coperchio e metterlo sul vetro scorrevole. Occorre prestare attenzione a non lasciare che rimangano bolle d'aria tra il campione e il vetro.

5. Osservazione dell'aorta

1. Esaminare l'aorta con un microscopio confocale a scansione laser.
2. Analizzare le intensità di colore dei diversi canali dalla regione desiderata nelle immagini en face con il software Image-Pro Plus.

Risultati

Un topo C57BL/6 di 12 settimane è stato eutanasia e perfuso con normale salina contenente 40 unità/mL di eparina e, quindi, precellato 4% paraformaldeide. L'aorta del topo è stato esposto al microscopio dissezioso (Figura 1), sezionato e aperto longitudinalmente (Figura 2). La colorazione dell'immunofluorescenza integrale delle cellule endoteliali vascolari è stata eseguita come illustrato nella Figura 3<...

Discussione

L'endotelio è esposto a numerosi fattori proatherogenici, tra cui lipidi, mediatori infiammatori e stress da taglio fluido^1,11,12. L'osservazione diretta delle cellule endoteliali in situ fornisce i vantaggi speciali per analizzare i cambiamenti nella morfologia cellulare, nelle giunzioni intercellulari e nei modelli di espressione molecolare in risposta agli stimoli da lesione.

Studi precedenti hann...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mountant	Servicebio	G1401
Delicate Forceps	RWD Life Science	F11001-11
Delicate Scissors	RWD Life Science	S12003-09
Dissecting Forceps	RWD Life Science	F12005-10
Mciro Spring Scissors	RWD Life Science	S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)	Amresco	M143
Polysorbate 20 (Tween 20)	Amresco	0777
VCAM-1 antibody	Abcam	ab134047
VE-Cadherin antibody	BD Biosciences	555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG	invitrogen	A-21208
Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss