神经系统疾病中的脂质组学和转录组学

摘要

本文提出了一种模块化方案，用于神经系统疾病小鼠模型中的组织脂质组学和转录组学以及血浆脂质组学，靶向炎症和神经元活性下的脂质，膜脂质，下游信使以及脂质功能下的mRNA编码酶/受体。概述了采样，样品处理，提取和定量程序。

摘要

脂质是大脑损伤或刺激的主要接口，有利于神经系统疾病，是合成具有各种信号或配体功能的脂质的储存库，可以强调疾病的发作和进展。脂质通常在症状前水平发生变化，是药物靶标和生物标志物的新兴来源。许多神经系统疾病表现出神经炎症，神经变性和神经元兴奋性作为共同的标志，部分由特定的脂质信号系统调节。各种脂质合成的相互依赖性和相互关系促使进行多脂，多酶和多受体分析，以推导出神经学背景的共性和特异性，并加速疾病发作和进展的机制方面的解体。将脂质作用归因于不同的大脑区域，可以促进与神经系统疾病相关的脂质分子表型和形态的测定。

这里介绍的是一个模块化方案，适用于分析膜脂质和下游脂质信号以及酶和介体的mRNA，这些酶和介质的基础是其功能，从与特定神经系统疾病和/或病症相关的离散大脑区域中提取。为确保准确的比较脂质组学分析，工作流程和操作标准进行了优化和标准化，以实现:i）脑采样和感兴趣区域的解剖，ii）多种脂质信号和膜脂质的共同提取，iii）双重脂质/mRNA提取，iv）通过液相色谱多重反应监测（LC / MRM）定量，以及v）标准mRNA分析。该工作流程适用于通过对功能离散的大脑子区域（即通过脑打孔）进行采样而获得的低组织量，从而防止由于组织异质性和/或动物变异性而导致的多分子分析中的偏差。为了揭示神经系统疾病的外周后果并建立神经系统疾病状态的翻译分子读数，还进行了周围器官采样，处理及其随后的脂质组学分析以及血浆脂质组学。该协议在急性癫痫小鼠模型上得到验证。

引言

脂质功能及其在神经系统疾病发病和进展中的作用的最新进展为新治疗靶点和疾病机制的阐明开辟了新的研究和开发场所¹。现代分子成像技术（如质谱成像和高级质谱分析）强调了不同大脑区域脂质组成的记录差异，将脂质研究的范式从整个大脑转向功能上不同和离散的大脑区域。脂质组成在不同大脑区域变化的事实促使人们对膜脂质敏感性和下游脂质信号传导的新概念化，以响应功能上不同的大脑区域的脑损伤或刺激。因此，脂质方案需要新的发展来解决低组织量的挑战，以进行更高的空间分辨率检测和定量，同时分析细胞膜和信号通路的多种脂质成分。此外，测定参与调节其水平和功能的酶、脂质配体和受体对于阐明神经系统疾病中受影响的信号通路和指导病理生理学背景下的新机制研究至关重要。

除了增加的大脑空间分辨率外，还有两个主要困难挑战着新的神经脂质组学方法的发展。首先，与膜构成性脂质相比，脂质信号分子的丰度通常非常低。其次，脂质组表现出很高的结构异质性，难以使用单一的分析方法进行解剖。因此，提取和分析方法针对不同的脂质类别量身定制，通常在不同的组织样品中进行².霰弹枪脂质组学方法³ 是快速揭示膜脂质的广泛特征的极好工具，而靶向发现和定量质谱方法提供的增强灵敏度和选择性被用于研究低丰度信号脂质，包括:i）炎症脂质和ii）参与调节神经元活性的脂质，如内源性大麻素（eCBs），氨基酸连接脂质， 等。^4,5.为了涵盖神经系统疾病模型的大脑区域中发生的细胞膜和信号传导水平的脂质变化，通常脂质提取和分析在不同的组织样品中进行，从不同的动物批次或不同的半球获得，或者通过将较大的组织区域解剖成多个部分。当酶受体的mRNA水平也令人感兴趣时，他们的研究通常需要采购不同的组织样本。例如，膜脂质、内源性大麻素和mRNA的研究将需要三种不同的组织样品（例如，两种脂质提取方法的两个样品 - 膜脂质和信号脂质 - 以及随后的两种脂质分析方法 - 以及一种用于mRNA分析的样品）。炎症性脂质和内源性大麻素的研究需要两种不同的组织样本，分别是提取方法和分析方法。另一个例子是脑冲床或激光显微切割样品中mRNA和任何脂质类别的研究，因此需要两个不同的动物在每个大脑（子）区域采购两个样品。在这种情况下，由于生物变异性和/或组织异质性，结果的可变性和/或可重复性差经常发生。在多分子分析的这些实际局限性的指导下，特别是在大脑中的高空间分辨率下，设计了一个三模块神经脂质组学方案，包括:1）通过LC / MRM共吸和共分析炎症脂质（例如，类二十烷酸（eiCs））和参与调节神经元活性的脂质，例如eCBs²;2）磷脂（PLs）和eCB的共萃取，随后进行多重扫描LC / MRM和前体/中性损失扫描分析²;3）膜（磷酸）脂质和eCBs以及mRNA的双重提取，随后进行LC / MRM和qPCR或RNA测序分析⁶.根据神经系统疾病中要解决的生物学问题和感兴趣的大脑区域，第一和第二方案的组合，或第一和第三方案的组合，可以应用于重量约为4mg的组织的同一组织标本。第一和第三方案可以独立应用于2mg左右的组织。第二种方案可应用于重量低至0.5mg的组织。无论选择哪种神经脂质组方案模块，组织采样和预分析处理、脑分离和区域解剖以及牺牲动物模型的程序对于方案的所有三个模块都是标准化和相同的。在我们对神经系统疾病的调查中，与疾病的病理后果相关的外周器官也总是使用这些模块化方案进行收集和分析。此外，定期对血液进行血浆脂质组学采样，以作为神经系统疾病的读数工具，以期进行前瞻性的转化应用。这里提出的模块化脂质组学方案非常通用:可扩展到更大的组织量，并且易于适用于几乎任何组织类型和疾病。用于模块化协议（图 1在神经系统疾病中，任何神经系统疾病（如创伤性脑损伤，帕金森病，阿尔茨海默病或癫痫）的发病和进展的标准化啮齿动物模型都是可以接受的。

这些方案已被广泛用于研究凯尼克酸（KA）诱导的癫痫小鼠模型中癫痫急性期组织脂质组和/或转录组的变化^2，7，由于与人类颞叶癫痫（^{TLE）相似，}该模型广泛用于临床前研究8，^9，10，11。使用这些方案，在同一个癫痫小鼠模型中评估了棕榈酰乙醇酰胺（PEA）^12，13等药物的治疗潜力。该研究确定了大脑和外周，在最大急性癫痫发作强度的时间点（在癫痫发作后60分钟诱导时）以及在KA癫痫发作诱导后的四个不同时间点（20，60，120和180分钟）用PEA进行亚慢性和急性治疗时，脂质和mRNA在高空间分辨率和低空间分辨率下的变化，这是一个覆盖癫痫急性期的时间窗口。在每个时间点收集未经处理的KA注射小鼠，急性和亚慢性PEA处理小鼠以及载体和PEA载体对照小鼠的血浆，大脑和外周器官^12，13，并通过该分子分析进行研究。分子数据与通过癫痫发作评分获得的行为表型以及神经退行过程的免疫组织化学衍生数据相关，以揭示急性癫痫期的进展和PEA缓解它的潜力。

研究方案

此处描述的所有实验程序均符合2010年9月22日欧洲共同体理事会指令（2010/63EU），并已获得德国莱茵兰 - 普法尔茨州当地动物委员会的批准（文件参考:23 177-07 / G16-1-075）。

1. 急性和预防性治疗KA诱导癫痫的动物模型

1. 进行癫痫发作诱导、治疗和行为评分。
   1. 将小鼠（每组最少n = 6只小鼠）分开在单个笼子中。
   2. 制备诱导癫痫发作注射液和相应的载体（见 表1），以及治疗注射液和相应的载体（见 表2）。
   3. 根据小鼠的组身份（即疾病、治疗或载体治疗（即 KA、PEA 处理的 KA 和两个载体组）在不麻醉的情况下腹膜内注射小鼠（ip.p.）（10 mL/kg 小鼠体重）。请参见 图 2、 表 1 和 表 2。
   4. 根据以下标准化癫痫发作强度量表监测和评分行为:0 =无反应;1 = 静止不动和凝视;2 =前肢和/或尾巴伸展，僵硬姿势;3 =重复动作，头部摆动;4 = 饲养和跌落;5 = 连续饲养和下降;6 =严重的阵挛性强直发作;7 = 死亡^14，15 （图3）。
2. 执行脂质组学和转录组学分析的牺牲程序。
   1. 在四个时间点（即分别在KA或载体注射后20，60，120和180分钟）处死来自以下每组的6只小鼠:PEA处理，PEA未治疗的癫痫载体1和载体2，遵循IACUC批准的协议。
   2. 到达每个时间点后十秒，在玻璃室中使用异氟醚浸泡的组织麻醉小鼠。通过失去矫正反射来确认麻醉，这表现为在缓慢翻转玻璃室时无法移动。使用手术剪刀斩首小鼠并收集血浆，大脑和外周器官（见步骤2.2.2-2.2.4）。
      注意:当地动物委员会对牺牲程序的道德规定各不相同。请务必检查并遵守当地动物委员会颁布的规定。
3. 遵循牺牲程序进行免疫组织化学分析。
   1. 对于免疫组织化学染色¹³，在整个疗程（180分钟）内，对来自以下每组的三只小鼠进行行为评分:PEA治疗，PEA未治疗的癫痫和载体组。
   2. 5天后处死并灌注小鼠。通过静脉注射戊巴比妥（100mg / kg）和丁丙诺啡（0.1mg / kg）作为麻醉药物对小鼠进行深度麻醉（小鼠组见步骤1.3.1）。通过脚趾间反射丧失来确认深度麻醉。
   3. 将鼠标固定在聚苯乙烯板上，然后立即使用细剪刀和标准镊子打开胸部。将蝴蝶放在左心室，用细剪刀切开右心房。
   4. 将泵的速度和压力调节到恒定的蠕动流量，速率为2-3 mL/min。用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注约5分钟。如有必要，请更换蝴蝶。
      注意:通过适当的灌注，内脏（脾脏除外）在1-2分钟内开始漂白。
   5. 将灌注切换到冰冷的4%多聚甲醛（PFA）溶液约5分钟。按照步骤2.2.2中所述分离整个大脑，并在4°C下在4%PFA溶液中固定24小时。
   6. 在4°C下将大脑在30%蔗糖溶液中孵育48小时。 用干纸巾除去剩余的蔗糖，并将大脑冷冻在金属板（-80°C）上。将大脑储存在-80°C以进行染色程序¹³。

2. 脂质组学/转录组学分析的采样程序

1. 准备采样。
   1. 用于血浆采样的预冷EDTA管至4°C。 将离心机和涡流装置预冷至4°C。 将覆盖有铝箔的金属板（以捕捉冷冻的大脑和/或其他感兴趣的组织）在干冰（-80°C）上预冷。将标记的2 mL和5 mL管分别在干冰（-80°C）上预冷，用于血浆等分试样，冷冻组织和脑收集。使用琥珀色管来保护光敏分子，如eiCs。
   2. 用消毒剂（例如，70%乙醇）清洁组织取样和隔离设备（手术剪刀，直锋利细剪，直光滑标准镊子，带镜面光洁度的精细镊子，弯曲的镊子和刮刀，聚苯乙烯泡沫板和固定针）。
2. 采样协议
   1. 确定采样顺序。
      1. 斩首后立即在预冷的1 mL EDTA管中收集血液（见步骤2.2.3）。
      2. 取出整个大脑，取出后立即快速冻结。此步骤需要 1−2 分钟。将冷冻的大脑储存在-80°C以进行进一步处理（见步骤2.2.2）。
      3. 切除脑后5分钟内切除感兴趣的外周器官（例如肺，心脏，肝脏），并快速冷冻并储存在-80°C下进行进一步处理（参见步骤2.2.4）。
   2. 取出大脑进行解剖或打孔手术。这个过程需要1-2分钟/脑。
      1. 斩首后（见步骤1.2），开始用细剪刀在皮肤上做一个中线切口。通过将皮肤翻转在眼睛上来释放头骨。到达颅骨顶部，从顶骨水平开始做一个小的尾部切口。避免切穿大脑。
      2. 用力切开眼睛之间颅骨的最前部，以方便切除大脑。使用弯曲的窄型镊子倾斜顶骨的一侧并断裂。对另一端重复最后一步。
      3. 切除脑膜。在大脑前部（即嗅球）下方滑动刮刀，然后轻轻向上倾斜大脑。将刮刀进一步向下滑动以破坏视神经和其他颅神经。
      4. 将大脑从颅骨中抬起，并立即将整个大脑冻结在预冷（-80°C）金属板上，腹侧面向金属板（背向上）。
      5. 让大脑完全冻结并转移到预冷的5 mL管中，并储存在-80°C，直到解剖大脑区域或打孔程序（见步骤3.1.和3.2）。
   3. 执行血浆采样。
      1. 用10μL新鲜制备的吲哚美辛稀释至10μM的目标浓度的预冷EDTA管。
      2. 斩首后立即收集躯干血液，方法是将身体轻轻挤压到预冷的EDTA管中，最大血容量为1 mL。
         注意:在适当的血压的情况下，不需要挤压。如果血容量小于 1 mL，请缩短异氟醚孵育时间，以实现适当的血流。
      3. 立即在4°C下以2，000× g 离心血管10分钟。
      4. 除去所得的上血浆相，并用于多脂分析，在预冷的2 mL管中等分试样定义的血浆体积如下:50μL用于eCBs / eiCs分析，30μL用于PL分析，剩余的血浆体积作为备用样品或其他类型的分析。
      5. 将血浆样品储存在-80°C下以进一步提取（参见步骤4.1.2和4.1.4）。
   4. 进行外周器官采样。
      注意:使用小鼠解剖学参考文献¹⁶ 和为动物研究人员参加的必修课程（FELASA）提供的文档来识别单个器官，其结缔组织和/或血管。
      1. 固定小鼠躯干，以使用针头轻松切除器官。在耻骨高度使用直的锋利剪刀做一个腹侧中线切口。使用钝的标准镊子固定腹壁，同时切割以打开腹腔。
      2. 固定皮肤，以便使用钝钳切除腹部器官。对于心脏或肺部切除，继续沿乳房洞穴的方向进行内侧切除。使用细镊子去除肺和/或心脏。
      3. 小心打开乳腔以避免出血。切除结缔组织和锚定相应器官的血管，而不切开器官。
      4. 立即将组织块转移到预冷的金属板（-80°C）上，并使其完全冷冻。将组织块转移到预冷管中并储存在-80°C以进行进一步处理（见步骤4.1）。

3. 生物材料加工

注意:对于eCBs/eiC的共萃取，请使用2 mL琥珀色管作为萃取管，并在每个管中加入七个预冷钢球。对于PL / eCBs的共提取以及双脂质和RNA共提取，使用2 mL不含RN酶的提取管，并加有陶瓷珠（材料表）。

1. 进行脑部解剖和外周器官处理。
   注意:使用放大灯增加大脑的可视性以进行解剖。
   1. 清洁手术工具，包括带有超细尖端的镊子，用70%乙醇清洁2x。
   2. 将冷冻的大脑从-80°C转移到含有预冷生理缓冲液（pH 5.5）的培养皿中，确保培养皿处于4°C。 让大脑完全解冻以允许解剖。使用镊子仔细测试。
      注意:不要将大脑保持在4°C的时间超过解冻所需的时间。
   3. 在冰上预冷金属板（4°C），并用浸泡在冰冷的生理缓冲液（pH 5.5）中的湿组织覆盖它，并将大脑腹侧小心地转移到冰上的预冷（4°C）金属板上。用浸泡在冰冷的生理缓冲液（pH 5.5）中的湿纸巾覆盖。
   4. 使用超细尖端镊子在最多5分钟内解剖大脑区域。从下丘脑（HYP）开始，将背侧向上转动以继续右侧。隔离海马体 （HCr）、前额叶皮层 （PFCr）、纹状体 （STRr） 和大脑皮层 （cCTXr）。然后解剖左侧。分离海马体 （HCl）、前额叶皮层 （PFCl）、纹状体 （STRl） 和大脑皮层 （cCTXl）。解剖小脑和丘脑区域。使用已发表的解剖学参考文献^16，17 进行大脑区域识别。
   5. 将每个解剖的碎片直接转移到铝箔覆盖的预冷金属板（-80°C）上。允许冷冻并转移标记的预冷2 mL管中的孤立大脑区域。
   6. 使用组织粉碎器（在-80°C下）粉碎组织块，避免组织解冻。在冷室中，将组织粉末等分在含有陶瓷珠或钢球的标记预冷提取管中。对于双脂质组学/转录组学分析，在冷室中称量组织粉末等分试样。对于仅脂质组学分析，在归一化到组织重量或蛋白质含量之间进行选择。对于后者，在不进行组织称量的情况下继续。
   7. 将外周器官组织切成块，最大重量为20mg。继续组织粉碎，如步骤3.1.6所示。
   8. 继续提取组织样品（参见步骤4.1.1，4.1.3或4.1.5）或将管储存在-80°C以供以后提取。
      注意:如果研究设计允许，也可以使用大脑矩阵。然而，该方法更适合于离散且数量有限的大脑区域，并且在设定的时间范围内解剖和分离上述所有大脑区域是不切实际的。
2. 执行脑部拳击。
   1. 将整个冻结的大脑安装到低温恒温器的安装系统（材料表）上。将厚度设置为 50 μm，并在靠近感兴趣区域的修剪模式下切片。
   2. 使用甲苯胺蓝（0.1%−1%）作为参考来定位感兴趣的子区域，对脑切片（18-20μm）进行染色。使用显微镜检查染色的切片，以确定要打孔的感兴趣区域。使用小鼠图谱作为参考，找到合适的大脑解剖区域¹⁶。使用预冷管中的样品取芯器，以0.8−1.0 mm的直径进行冲孔。
   3. 在含有陶瓷珠或钢球的带标签的预冷 2 mL 提取管中称量冷冻冲头。使用琥珀色管进行 eCB 和 eiC 共萃取。
   4. 开始提取（参见步骤4.1.1，4.1.3或4.1.5）或将管储存在-80°C以进行进一步提取。
3. 执行等离子体处理。
   1. 将冷冻血浆样品放在冰（4°C）上，让它们解冻（〜20分钟）。
   2. 在开始提取之前，确保血浆完全解冻。
   3. 继续进行血浆提取程序（参见步骤4.1.2或4.1.4）。
      注意:等离子体样品应保持在-80°C直至提取。避免解冻和再冷冻的循环。

4. 提取程序

1. 执行液-液（LLE）脂质共萃取方案。
   1. 从脑片、冲头或组织粉末样品中共提取 eCB 和 eiC。
      注意:整个过程中需要准确的移液。
      1. 将含有组织样品和七个钢球的提取管放在冰（4°C）上。加入600 μL冰冷的MTBE和50 μL含有内标的ACN /_H2O（1:1; v / v）。用于分析的最终体积（50μL）中内标物的目标浓度如下:1 ng / mL AEA-d4，125 ng / mL 2-AG-d5，3，000 ng / mL AA-d8，2 ng / mL OEA-d4;PEA-d4， 12.5 ng/mL 1-AG-d5， 2.5 ng/mL PGF2α-d4 和 5 ng/mL 用于PGD2-d4;PGE2-d9;5（S）-HETE-D8;12-二叔丁基-D8;分别为 20-HETE-d6 和 TXB2-d4。
      2. 加入400μL0.1M甲酸，并用组织裂解器匀浆（30 s-1分钟）。在4°C下以5，000× g 离心匀浆15分钟。 允许在-80°C下冷冻水性下相10分钟，以缓解上层有机相的转移。
      3. 将有机相转移到新管中。在37°C的温和_N2 流下蒸发，并在50μL的ACN / _H2O（1:1; v / v）中重建以进行进一步分析。
      4. 将水相储存在-20°C或-80°C，用于进一步的蛋白质含量分析。
   2. 从血浆样品中共提取eCB和eiC。
      1. 在4°C下解冻血浆等分试样。 加入含有内标的800μL甲基叔丁基醚和50μLAC / _H2O（1:1; v / v）（类似于用于组织分析的那些，见步骤5.1.1）。优化内标浓度，以便使用参比血浆样品进行峰值。
      2. 在4°C下加入600μL0.1M甲酸和涡旋样品2分钟。在4°C下以4，000× g 离心样品15分钟。
      3. 将有机相转移到新管中，在37°C的温和_N2 流下蒸发，然后在50μL的ACN / _H2O（1:1; v / v）中重建以进行LC / MRM分析。
         注意:如果可能，避免储存干燥的 EIC 提取物，并立即进行 LC/MRM 分析。如果无法避免储存，请在4°C下将样品在LC注射溶剂中短时间储存2-3天。
   3. 从大脑区域、冲头或其他组织粉末样品中共提取PL和eCB。
      1. 将含有组织样品和陶瓷珠的提取管放在冰（4°C）上。加入800μLMTBE / MeOH（10:3; v / v）和10μL含有内标的MeOH。用于分析的最终体积（100μL）中内标物的目标浓度如下:PC 17:0 / 14:1，PE 17:0 / 14:1，PA 17:0 / 14:1，100 ng / mL PG 17:0 / 14:1，100 ng / mL PG 17:0 / 14:1;诗篇 17:0/14:1;PI 17:0/14:1;LPC 17:0;LPA 17:0;SM d18:1/12: 分别为 0，1 ng/mL AEA-d4、60 ng/mL 2-AG-d5、4，000 ng/mL AA-d8、2 ng/mL OEA-d2 和 3 ng/mL PEA-d4。
      2. 加入200μL含有25μM四氢列匹他汀/ URB597和50μg/ mL BHT的0.1%甲酸。用组织均质器（材料表）均质，并在5，000× g 和4°C下离心15分钟。
      3. 在新管中回收上层有机相，并在37°C的_N2 温和流下蒸发。 在90μLMeOH中重组，储存在-20°C或-80°C或继续下一步。
      4. 将10%H ₂ O加入脂质提取物等分试样（4.1.3.3）中，并在LC / MS中注射10μL用于PL分析。要进行进一步的eCB分析，请继续执行步骤4.3.5。
      5. 取等分试样提取物（4.1.3.3），蒸发至干并在ACN / _H2O（1:1; v / v）中重建。使用20μL进行LC / MS进样以进行eCB分析。
   4. 从血浆样品中共萃取PL和eCB。
      1. 在4°C下解冻血浆等分试样，加入1，000μLMTBE /甲醇（10:3; v / v）和10μL含内标的MeOH（类似于步骤4.1.3），并在4°C下涡旋1分钟。
      2. 加入250μL H ₂ O，在4°C下涡旋45分钟。 将样品在5，000× g 和4°C下离心15分钟。 回收上层有机相，在37°C的温和_N2 流下蒸发，并在90μL甲醇中重建以进行进一步的LC / MS分析。储存在-20°C或-80°C或继续下一步。
      3. 对于PL分析，将10%的水加入脂质提取物等分试样（4.1.2.2）。
      4. 对于eCB分析，将10%的水加入脂质提取物的等分试样中（参见4.1.4.3），蒸发至干，并在50%ACN / _H2O（1:1; v / v）中重建。
   5. 从组织样本中执行RNA和脂质的双重提取（PLs和eCBs的共提取）。
      注意:确保在无RNA的条件下工作，以避免RNA降解。
      1. 解冻组织粉末等分试样或脑束（在4°C下），并将含有5μM THL / URB597，10μg/ mL BHT和1%β巯基乙醇的600μLRLT缓冲液与200μL氯仿一起加入含有冷冻脑冲头和陶瓷珠的提取管中。
      2. 用10μL内标混合物刺取样品，用于PL和eCB共萃取（参见步骤4.1.3），并通过组织均质器（高速，20 s）均质化。
      3. 将裂解物转移到新的离心管中，并在全速和4°C下离心5分钟，以实现相分离。
      4. 使用标准RNA提取程序试剂盒回收并使用上相进行RNA提取（材料表）。在总体积为50μL的无RNase水中洗脱RNA并储存在-80°C。
         注意:步骤4.1.5.4中的样品适合使用适当的方法和仪器进行RNA测序和qPCR。
      5. 使用含氯仿的下部相进行脂质提取。加入800μLMTBE /甲醇（10:3; v / v）和200μL0.1%甲酸，并在4°C下涡旋45分钟。 回收上层有机相，并在37°C的_N2 温和流动下蒸发。
      6. 在90μL甲醇中重构，用于进一步的LC / MS分析。储存在-20°C或-80°C或继续步骤5。
      7. 将10%H ₂ O加入脂质提取物等分试样中（参见上述步骤4.1.5.6），并在LC / MS中注射10μL用于PL分析。要进行进一步的eCB分析，请继续执行步骤5.7。
      8. 取等分试样的提取物（见上文步骤4.1.5.6）蒸发至干，并在ACN / _H2O（1:1; v / v）中重建。使用20μL进行LC / MS进样以进行eCB分析（类似于步骤4.3.5）。

5. LC/MRM 定性和定量分析

1. 准备LC溶剂系统，校准溶液和质量控制样品。
   1. 对于PL，制备流动相A:含有7.5mM甲酸铵和0.1%TEA的甲醇/水（1:1;v / v）。制备流动相B:含有7.5mM甲酸铵和0.1%TEA的甲醇/异丙醇（2:8;v/ v）。将溶剂储存在LC瓶中。
   2. 对于eCB和eiC分离，准备以下LC溶剂:0.1%甲酸作为流动相A，100%ACN含有0.1%甲酸作为流动相B。
   3. 使用校准标准品和内标（表3）以等摩尔或用户定义的浓度准备质控品。
   4. 准备具有七个浓度点的校准曲线。使用相同的内部标准批次在校准曲线溶液和待分析样品中飙升。
2. 使用LC-MRM方法进行定性和定量血脂分析。
   1. 在商业软件（例如，分析软件）中打开" 构建采集方法 "选项卡，然后选择具有极性切换功能的 LC/MRM 模式。在方法中设置离子跃迁（如 表3所示）以进行定量分析。将建立时间设置为 50 ms。
   2. 对于PL分析，设置以下离子源参数:帘式气体= 40 psi;源加热器温度=550°C;负离子模式下离子喷射电压 = -4，500 V，正离子模式下 = +5，200 V。
   3. 对于 eCB 和 eiC 的协同分析，请设置以下参数:帘式气体 = 40 psi;源加热器温度=550°C;负离子模式下离子喷射电压 = -4，500 V，正离子模式下 = +4，500 V。
   4. 对于PL分析，将色谱柱加热设置为45°C，流速设置为200μL/min，并设置以下梯度:最小值0 = 40%B;最小值 3 = 40% B;最小 42 = 90% B;最小 43 = 99% B;最小50 = 99%B，最小52 = 40%B.将进样体积设置为10μL。
   5. 对于eCBs和eiCs分析，将色谱柱温度设置为室温并设置以下梯度:最小0 = 20%B;最小值 1 = 20% B;最小值 5 = 50% B， 最小值 12 = 50% B;最小 13 = 90% B， 最小 17 = 90% B;最小值 17.5 = 20% B;最小20 = 20%B.将进样体积设置为20μL。
      注意:MRM条件可能因仪器平台而异，因此必须通过实验推断碎片和MRM条件，并应根据需要测试和调整电离参数，以获得最大的灵敏度和选择性。
3. 执行批次分析。
   1. 打开 构建采集 批处理，并填写样品描述、在自动进样器样品架中的位置和采集方法所需的参数（设置为步骤 5.2）。
   2. 始终在分析的开始和结束时以及批次中包括质量控制。每25-30个样品后，在批次中至少包括三条校准曲线，并在每个质量控制样品，校准曲线和样品批次结束时使用所选溶剂进行洗涤步骤。
   3. 将步骤4获得的样品转移到LC / MS小瓶中。根据批次中定义的位置将样品放入LC自动进样器的装载架中，并将样品架装载到LC自动进样器中。
   4. 提交批处理并启动队列分析。
4. 脂质定量
   1. 使用商业软件（例如，分析师）和嵌入式定量模块进行eCB和eiC定量，并使用商业软件（例如，多级）进行PL定量。
      注:第二个软件也可用于eCB和eIC，特别是当一个内标用于多种分析物的定量时。
   2. 打开 构建定量方法 ，填写分析物、内部标准品、MRM 转换的参数，并将内部标准品归因于要量化的分析物（表 3）。将最小峰值高度设置为 500 cps。
   3. 使用以下标准或其组合进行脂质鉴定和随后的定量⁶:脂质内源性分析物与校准标准品和/或氘代内标的保留时间匹配（如果可用）;通过正负离子模式碎片匹配的片段离子，用于给定 的m / z 脂质分析物，没有提供标准品;文献推断脂质在类似使用的LC条件下的洗脱行为，以解剖异构体和/或等压结构;并且，在可能的情况下，使用高分辨率质谱法进行LC / MS和MS / MS分析，使用与靶向分析（使用LC / MRM）相似的LC条件，以准确识别感兴趣的内源性脂质的身份和洗脱行为^18，19。
   4. 对于批次分析的验证，请使用以下标准:定量精度≤ ±20%;回归系数≥0.97（理想情况下为≥0.99）。
      注意:遵循生物分析方法开发和验证指南，以确保对目标分子进行可靠，可重复的分析。

结果

所描述的方案集可以以特定目的的方式在不同水平上组合，例如动物模型的选择，采样途径，提取和剖析方法（图1）。

为了确定急性癫痫发作状态一段时间内大脑和外周的脂质水平变化，并揭示PEA的潜在抗癫痫作用¹³ 及其对脑和外周脂质组变化的影响，对3个实验动物组进行了载体治疗...

讨论

这里描述的神经脂质组学和转录组学方法是一种可行的方法，用于研究大脑和外周器官中以高和低空间分辨率的任何疾病或健康发育。由于优化了血浆采样和处理程序，血浆脂质组学分析也可以从相同的动物处死进行组织脂质组学和转录组学，从而提高组织血液分子相关性和生物标志物发现的可靠性。通过应用三种方案中的任何一种或其组合来提供广泛的数据集，不仅对于在上下文中（动物模型?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017	Microscopy
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Lipid Std
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth	FST	11016-17	Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern	FST	14130-17	Surgical Tools
T3000 Thermocycler	Biometra		Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2	Biomol	Cay19030-5	Lipid Std
Thromboxane B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Lipid Std
Tissue Lyser II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek	Sakura Finetek	4583	Microscopy
Toluidinblau	Roth	0300.2	Microscopy
Vapotherm	Barkey	4004734	Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	Solvent/LCMS