神経疾患におけるリピドミクスとトランスクリプトミクス

要約

この記事では、炎症およびニューロン活性の根底にある脂質、膜脂質、下流メッセンジャー、および脂質機能の根底にあるmRNAコード酵素/受容体を標的とする神経疾患マウスモデルにおける組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクス、および血漿リピドミクスのためのモジュラープロトコルを提示する。サンプリング、サンプル処理、抽出、および定量の手順が概説されています。

要約

脂質は、神経学的疾患を助長する脳の侮辱または刺激に対する主要なインターフェースとして機能し、疾患の発症および進行を強調することができる様々なシグナル伝達またはリガンド機能を有する脂質の合成のための貯蔵庫である。多くの場合、未症候性レベルで変化する脂質は、薬物標的およびバイオマーカーの新たな供給源である。多くの神経学的疾患は、神経炎症、神経変性、および神経細胞興奮性を共通の特徴として示し、部分的には特定の脂質シグナル伝達系によって調節される。様々な脂質の合成の相互依存性および相互関係は、神経学的文脈の共通性および特異性を導き出し、疾患の発症および進行の機構的側面の解明を促進するために、多脂質、多酵素、および多受容体分析を促す。脂質の役割を異なる脳領域に帰属させることは、神経学的疾患に関連する脂質分子表現型および形態の決定を前進させる。

ここでは、膜脂質および下流脂質シグナルの分析に適したモジュラープロトコルを、その機能の根底にある酵素およびメディエーターのmRNAとともに、特定の神経学的疾患および/または状態に関連する個別の脳領域から抽出する。正確な比較リピドミープロファイリングを確実にするために、ワークフローと操作基準は、i)関心領域の脳サンプリングと解剖、ii)複数の脂質シグナルと膜脂質の共抽出、iii)二重脂質/mRNA抽出、iv)液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング(LC / MRM)による定量、およびv)標準mRNAプロファイリングのために最適化され標準化されました。このワークフローは、機能的に離散的な脳サブ領域のサンプリング(すなわち、脳パンチングによる)によって得られる低組織量に対して順応性であり、したがって、組織の不均一性および/または動物の変動性による多分子分析におけるバイアスを防止する。神経疾患の末梢結果を明らかにし、神経学的疾患状態の翻訳分子読み出しを確立するために、末梢器官サンプリング、プロセシング、およびその後のリピドミクス分析、ならびに血漿リピドミクスも追求され、記述される。このプロトコルは、急性てんかんマウスモデルで実証される。

概要

近年の脂質の機能の進歩と神経疾患の発症・進行における脂質の役割は、新たな治療標的や疾患メカニズム解明の新たな研究開発の場を切り拓いています¹。質量分析イメージングや高度な質量分析プロファイリングなどの現代の分子イメージング技術によって強調された、異なる脳領域における脂質組成の文書化された違いは、脂質調査のパラダイムを全脳から機能的に別個の脳領域へとシフトさせる。脂質組成が異なる脳領域で変化するという事実は、機能的に異なる脳領域にわたる脳の侮辱または刺激に応答して、膜脂質感受性および下流脂質シグナル伝達の両方の新しい概念化を促す。したがって、脂質プロトコルは、より高い空間分解能の検出および定量化のための低組織量の課題に対処するための新しい開発を必要とし、同時に、細胞膜およびシグナル伝達経路の複数の脂質成分の分析を必要とする。また、それらのレベルおよび機能の調節に関与する酵素、脂質リガンド、および受容体の決定は、神経学的疾患において影響を受けるシグナル伝達経路を解明し、病態生理学的文脈における新しい機構的研究を導くために最も重要である。

脳の空間分解能の向上に加えて、新しい神経リピドミーアプローチの開発に挑戦する2つの大きな困難があります。第1に、脂質シグナル伝達分子は、典型的には、膜構成脂質と比較して非常に低い存在量のものである。第2に、リピドームは高い構造的不均一性を示し、単一の分析アプローチを用いて解剖することは困難である。したがって、抽出および分析方法は、異なる脂質カテゴリーに合わせて調整され、異なる組織サンプルで一般的に実行されます。².ショットガンリピドミクス法³ 膜脂質の広範なプロファイルを迅速に明らかにするための優れたツールであり、標的化された発見および定量化質量分析法によってもたらされる感度および選択性の増加は、i)炎症性脂質およびii)エンドカンナビノイド(eCB)、アミノ酸結合脂質などのニューロン活性の調節に関与する脂質を含む、低豊富シグナル伝達脂質の調査に利用され、 等。^4,5.神経学的疾患モデルの脳領域において生じる細胞膜およびシグナル伝達レベルの両方における脂質変化を包含するために、典型的には、脂質抽出および分析は、別個の組織試料において、別個の動物バッチから、または異なる半球から得られ、またはより大きな組織領域を複数の断片に解剖することによって行われる。酵素受容体のmRNAレベルも興味深い場合、それらの調査は通常、別個の組織サンプルの調達を必要とする。例えば、膜脂質、内因性カンナビノイド、およびmRNAの調査には、3つの異なる組織サンプル(例えば、2つの脂質抽出方法(膜脂質およびシグナル伝達脂質)のための2つのサンプル、およびその後の2つの脂質分析方法およびmRNA分析のための1つのサンプル)が必要である。炎症性脂質および内因性カンナビノイドの調査には、それぞれ2つの異なる組織サンプル、抽出方法、および分析方法が必要です。別の例は、脳パンチまたはレーザー微小解剖サンプル中のmRNAおよび脂質カテゴリーの調査であり、その結果、脳(サブ)領域ごとに2つのサンプルを調達するために2つの異なる動物が必要である。このような場合、結果の実質的な程度の変動性および/または再現性の悪さが、生物学的変動性および/または組織の不均一性に起因することが多い。特に脳内で高い空間分解能で起こる多分子分析のこれらの実用的な限界に導かれて、1)LC/MRMによる炎症性脂質(例えば、エイコサノイド(eiCs))およびeCBなどのニューロン活動の調節に関与する脂質の共抽出および共分析を含む3モジュールのニューロリピドミクスプロトコルが設計されました。²;2)リン脂質(PL)とeCBの共抽出とその後のマルチスキャンLC/MRMおよび前駆体/中性損失スキャン分析²;3)膜(リン)脂質およびeCBならびにmRNAの二重抽出、その後のLC/MRMおよびqPCRまたはRNAシーケンシング分析⁶.神経学的疾患および関心のある脳領域において対処されるべき生物学的問題に応じて、第1および第2のプロトコル、または第1および第3のプロトコルの組み合わせを、約4mgの重さの組織について同じ組織標本に適用することができる。第1および第3のプロトコールは、2mg前後の組織に対して独立して適用することができる。第2のプロトコルは、わずか0.5mgの重さの組織に適用することができる。選択された神経リピドームプロトコルモジュールに関係なく、組織サンプリングおよび前分析処理、脳単離および領域解剖、ならびに動物モデルを犠牲にする手順は、プロトコルの3つのモジュールすべてについて標準化され、同一である。神経学的疾患の調査では、疾患の病理学的結果に関連する末梢器官も常に収集され、これらのモジュラープロトコルを使用して分析されます。さらに、血漿リピドミクスのために血液が定期的にサンプリングされ、将来の翻訳アプリケーションの観点から神経学的疾患の読み出しツールとして機能します。ここで提示されたモジュラーリピドミクスプロトコルは非常に汎用性が高く、より大きな組織量に拡張可能であり、事実上あらゆる組織タイプおよび疾患に容易に適用可能である。モジュラープロトコル(図1)神経学的疾患において、外傷性脳損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはてんかんなどの神経学的障害の発症および進行の任意の標準化されたげっ歯類モデルが許容される。

これらのプロトコルは、ヒト側頭葉てんかん(TLE)8,9,10,11に類似しているため、前臨床試験で広く使用されているてんかんのカイニン酸(KA)誘導マウスモデルにおけるてんかんの急性期における組織リピドームおよび/またはトランスクリプトームの変化の研究に広く適用されている^2,7。これらのプロトコールを用いて、パルミトイルエタノールアミド(PEA)^12,13などの薬物の治療可能性を、てんかんの同じマウスモデルにおいて評価した。この研究では、脳および末梢における高分解能および低空間分解能での脂質およびmRNAの変化、最大急性発作強度の時点(発作誘発後60分)、およびKA発作誘発後の4つの異なる時点(20分、60分、120分、および180分)におけるPEAによる亜慢性および急性治療時、てんかんの急性期をカバーする時間窓が同定された。未処理のKA注射マウス、急性および亜慢性PEA処置マウス、ならびにビヒクルおよびPEAビヒクル対照マウスの血漿、脳、および末梢器官を、各時点で収集し^12、13、およびこの分子分析を用いて調査した。分子データは、急性てんかん期の進行およびそれを緩和するPEAの可能性を解明するために、発作スコアリングによって得られた行動表現型、ならびに神経変性プロセスに関する免疫組織化学由来のデータと相関していた。

プロトコル

ここに記載されているすべての実験手順は、2010年9月22日の欧州共同体理事会指令(2010/63EU)に準拠しており、ドイツのラインラントプファルツ州の地元の動物委員会によって承認されました(ファイル参照:23 177-07/G16-1-075)。

1. 急性および予防的に治療されたKA誘発てんかんの動物モデル

1. 発作誘発、治療、および行動スコアリングを実行する。
   1. 別々のマウス(1群あたり最小n=6匹のマウス)を単一のケージに入れる。
   2. 発作誘導注射液および対応するビヒクル(表 1参照)、ならびに治療用注射液および対応するビヒクル( 表2参照)を調製する。
   3. マウスの腹腔内(i.p.)(10mL/kgマウス体重)を、疾患、治療済み、またはビヒクル治療済み(すなわち、KA、PEA処理KA、および2つのビヒクル群)のグループの同一性に従って麻酔なしで注射する。 図 2、表 1、および 表 2 を参照してください。
   4. 次の標準化された発作強度スケールに従って行動を監視し、スコアリングする:0 = 応答なし;1 = 不動と凝視;2 = 前肢および/または尾の伸展、硬い姿勢;3 = 反復的な動き、頭のボブリング。4 = 飼育と転倒;5 = 連続的な飼育と落下;6 = 重度のクローン強直性発作;7 = 死亡^14,15(図3)。
2. リピドミクスおよびトランスクリプトーム分析のための犠牲手順を実行します。
   1. 4つの時点(すなわち、KA−またはビヒクル注射後それぞれ20分、60分、120分、および180分)に、IACUC承認プロトコルに従って、PEA処置、PEA未処置てんかんビヒクル1、およびビヒクル2の各群から6匹のマウスを屠殺する。
   2. 各時点に到達してから10秒後に、ガラスチャンバーにイソフルラン浸漬した組織を用いてマウスを麻酔する。右反射の喪失による麻酔を確認し、ガラスチャンバをゆっくりとひっくり返しながら移動できないことによって示される。外科用はさみを使用してマウスを斬首し、血漿、脳、および末梢器官を採取する(ステップ2.2.2−2.2.4参照)。
      注意: 犠牲の手続きに関する倫理規定は、地元の動物委員会によって異なります。地元の動物委員会が発行した規則を確認し、それに従ってください。
3. 免疫組織化学分析のための犠牲手順に従ってください。
   1. 免疫組織化学染色¹³について、全時間経過(180分)にわたって、以下の各群から3匹のマウスを行動スコアリングした:PEA処置、PEA未処置てんかん、およびビヒクル群。
   2. 5日後にマウスを屠殺し、灌流する。麻薬としてペントバルビタール(100mg/kg)およびブプレノルフィン(0.1mg/kg)をip.注射することにより、マウスを深く麻酔する(マウス群についてはステップ1.3.1を参照)。つま先の間の反射の喪失によって深い麻酔を確認する。
   3. マウスをポリスチレンプレートに固定し、すぐに細かいはさみと標準的な鉗子を使って胸郭を開きます。蝶を左心室にセットし、細かいハサミで右心房をカットします。
   4. ポンプの速度と圧力を、2-3mL/minの速度で一定の蠕動流に調整します。氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で約5分間灌流する。必要に応じて、蝶を交換してください。
      注:適切な灌流では、内臓(脾臓を除く)は1〜2分以内に漂白し始めます。
   5. 灌流を氷冷4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に約5分間切り替えます。ステップ2.2.2で説明したように脳全体を単離し、4°Cの4%PFA溶液中で24時間固定する。
   6. 脳を30%スクロース溶液中で4°Cで48時間インキュベートする。 残ったスクロースを乾いたティッシュペーパーで取り除き、金属板(-80°C)で脳を凍結させた。染色手順¹³のために脳を-80°Cで保存する。

2. リピドミクス/トランスクリプトーム解析のためのサンプリング手順

1. サンプリングの準備をします。
   1. プラズマサンプリング用のEDTAチューブを4°Cに予冷します。 遠心分離機及びボルテックス装置を4°Cに予冷する。 アルミホイルで覆った金属板をドライアイス (-80 °C) で予冷します (凍った脳やその他の目的の組織をスナップするため)。標識した 2 mL チューブと 5 mL チューブをドライアイス (-80 °C) で予冷し、血漿アリコート、凍結組織、および脳コレクションをそれぞれ行います。琥珀色のチューブを使用して、eiCなどの光に敏感な分子を保護します。
   2. 組織サンプリングおよび単離装置(外科用はさみ、まっすぐな鋭い細かいはさみ、まっすぐな滑らかな標準鉗子、鏡面仕上げの細かい鉗子、湾曲した鉗子とヘラ、発泡スチロールプレート、および固定用の針)を消毒剤(例えば、70%エタノール)で洗浄する。
2. サンプリングプロトコル
   1. サンプリングの順序を決定します。
      1. 断頭直後の血液を予め冷却した1mLのEDTAチューブに採取する(工程2.2.3参照)。
      2. 脳全体を取り外し、取り外し直後にスナップフリーズします。このステップには1〜2分かかります。凍結した脳を-80°Cで保存し、さらに処理します(ステップ2.2.2を参照)。
      3. 目的の末梢器官(例えば、肺、心臓、肝臓)を除去し、脳除去後5分以内に、スナップ凍結し、さらなる処理のために-80°Cで保存する(ステップ2.2.4参照)。
   2. 解剖またはパンチング手順のために脳を除去します。この手順は、1-2分/脳を取ります。
      1. 断頭後(ステップ1.2参照)、細かいはさみを使って皮膚に正中線切開を開始します。目の上の皮膚をひっくり返して頭蓋骨を解放します。頭蓋骨の上部に到達し、頭頂骨のレベルから始まる小さな尾部切開を行う。脳を切断しないでください。
      2. 頭蓋骨の最も前部を目の間にしっかりと切り込み、脳の除去を容易にします。湾曲した狭いパターンの鉗子を使用して頭頂骨の片側を傾け、切断します。反対側について最後の手順を繰り返します。
      3. 脳髄膜を除去します.脳の前部(すなわち、嗅球)の下にヘラをスライドさせ、脳を静かに上に傾ける。ヘラをさらに下にスライドさせて、視神経やその他の脳神経を壊します。
      4. 頭蓋骨から脳を持ち上げ、腹側が金属板に面した予冷(-80°C)金属板(背側を上)ですぐに脳全体をスナップ凍結します。
      5. 脳を完全に凍結させ、予冷した5mLチューブに移し、脳領域の解剖またはパンチング手順まで-80°Cで保存する(ステップ3.1および3.2を参照)。
   3. プラズマサンプリングを実行します。
      1. スパイクは、10μMの標的濃度に調製された10μLのインドメタシン希釈液でEDTAチューブを予冷した。
      2. 断頭直後の体幹血液を、最大血液量1mLになるまで予冷したEDTAチューブに身体を穏やかに絞って採取する。
         注:適切な血圧の場合、圧搾は必要ありません。血液量が1mL未満の場合は、イソフルランのインキュベーション時間を短くして、適切な血流を有効にします。
      3. 直ちに血液チューブを2,000 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
      4. 得られた上部血漿相を除去し、多脂質分析の目的で、eCBs/eiCs分析用に50μL、PLs分析用に30μL、および残りの血漿体積をバックアップサンプルまたは他のタイプの分析用に、予冷却された2mLチューブでアリコート定義した血漿体積。
      5. 血漿サンプルを-80°Cで保存してさらに抽出します(ステップ4.1.2および4.1.4を参照)。
   4. 末梢臓器サンプリングを行う。
      注:マウス解剖学の参考文献¹⁶ と、動物研究者が出席する必須コース(FELASA)に提供された文書を使用して、個々の臓器、その結合組織、および/または血管を特定します。
      1. マウスの胴体を固定して、針を使用して臓器の除去を容易にします。恥骨の高さでまっすぐな鋭いはさみを使って腹側正中線切開を行います。鈍い標準鉗子を使用して腹壁を固定し、腹腔を開くために切断します。
      2. 鈍い鉗子を使用して腹部の臓器除去を可能にするために皮膚を固定化する。心臓または肺を除去するために、乳房洞の方向に内側切断を続ける。細かい鉗子を使用して肺および/または心臓を取り除きます。
      3. 出血を避けるために乳房腔を慎重に開きます。臓器を切断することなく、それぞれの臓器を固定する結合組織および血管を切断する。
      4. 組織片を直ちに予冷した金属板(-80°C)に移し、完全に凍結させる。組織片を予冷却チューブに移し、さらなる処理のために-80°Cで保存する(ステップ4.1参照)。

3. 生物材料加工

注:eCB / eiCの共抽出には、抽出チューブとして2 mLのアンバーチューブを使用し、各チューブに7つの予冷鋼球を追加します。PL/eCBの共抽出、および脂質とRNAの二重共抽出には、セラミックビーズでスパイクした2 mLのRNAseフリー抽出チューブを使用してください(材料表)。

1. 脳解剖および末梢器官処理を行う。
   注:解剖のための脳の視認性を高めるために拡大ランプを使用してください。
   1. 超微細な先端を持つ鉗子を含む手術器具を、70%エタノールで2倍に清掃する。
   2. 凍結した脳を-80°Cから予冷した生理学的緩衝液(pH5.5)を含むシャーレに移し、シャーレが4°Cであることを確認する。 解剖を可能にするために、脳が完全に凍結解除されるようにします。鉗子を使用して慎重にテストします。
      注意: 脳を解凍に必要な時間を超えて 4 °C に保たないでください。
   3. 氷(4°C)上の金属板を予冷し、氷冷生理学的緩衝液(pH5.5)に浸した湿組織で覆い、腹側を上にして脳を氷上の予冷却(4°C)金属板上に慎重に移す。氷冷生理学的緩衝液(pH 5.5)に浸したウェットティッシュで覆う。
   4. 超微細先端鉗子を用いて最大5分以内に脳領域を解剖する。視床下部(HYP)から始めて、背側を上に回して右側に進みます。海馬(HCr)、前頭前野(PFCr)、線条体(STRr)、および大脳皮質(cCTXr)を単離する。次に、左側を解剖します。海馬(HCl)、前頭前野(PFCl)、線条体(STRl)、および大脳皮質(cCTXl)を単離する。小脳と視床領域を解剖する。脳領域の同定には、公表された解剖学的参考文献^16,17を使用してください。
   5. 解剖した各片を、アルミ箔で覆われた予冷金属板(-80°C)に直接移します。凍結を可能にし、単離された脳領域を標識された予冷2mLチューブに移す。
   6. 組織粉砕機を用いて組織片を粉砕し(-80°Cで)、組織の融解を避ける。冷蔵室では、組織粉末をセラミックビーズまたは鋼球を含む標識された予冷抽出管にアリコートする。デュアルリピドミクス/トランスクリプトミクス分析では、低温室で組織粉末アリコートを計量します。リピドミクスのみの分析の場合は、組織重量またはタンパク質含有量への正規化のいずれかを選択します。後者の場合は、組織計量を行わずにさらに進めます。
   7. 末梢器官組織を最大重量20mgで細かく切断する。ステップ3.1.6のように組織粉砕を進める。
   8. 組織サンプルの抽出を続行するか(ステップ4.1.1、4.1.3、または4.1.5を参照)、後で抽出するためにチューブを-80°Cで保存します。
      注:脳マトリックスは、研究デザインが許す限り、使用することもできます。しかしながら、この方法は、離散的で限られた数の脳領域に対してより適しており、設定された時間枠内で上記の脳領域のすべてを解剖および単離することは実用的ではない。
2. 脳パンチングを行います。
   1. 凍結した脳全体をクライオスタットの取り付けシステム(材料表)に取り付けます。厚さを50μmに設定し、関心領域の近くでトリムモードでスライスします。
   2. トルイジンブルー(0.1%-1%)を基準として使用して脳スライス(18−20μm)を染色し、目的のサブ領域を局在化させる。顕微鏡を用いて染色されたスライスを検査し、打ち抜く関心のある領域を特定する。マウスアトラスを参考にして、適切な脳解剖学的領域を見つけます¹⁶。予冷チューブのサンプルコアラーを使用して、直径0.8-1.0mmのパンチを取ります。
   3. 冷凍パンチを、セラミックビーズまたはスチールボールを含むラベル付き、予冷された2mL抽出チューブで冷蔵室内で秤量する。eCBとeiCsの共抽出には琥珀色のチューブを使用してください。
   4. 抽出を開始するか(ステップ4.1.1、4.1.3、または4.1.5を参照)、またはチューブを-80°Cで保存してさらに抽出します。
3. プラズマ処理を行います。
   1. 凍結した血漿サンプルを氷(4°C)の上に置き、それらを解凍(〜20分)させる。
   2. 抽出を開始する前に、プラズマが完全に凍結されていないことを確認してください。
   3. 血漿抽出手順を続行します(ステップ4.1.2または4.1.4を参照)。
      注:血漿サンプルは、抽出まで-80°Cにとどまる必要があります。解凍と再凍結のサイクルを避けてください。

4. 抽出手順

1. 液体 - 液体(LLE)脂質共抽出プロトコルを実行します。
   1. 脳片、パンチ、または組織粉末サンプルからeCBとeiCの共抽出を実行します。
      メモ: 手順全体を通して、正確なピペッティングが必要です。
      1. 組織サンプルと7個の鋼球を入れた抽出チューブを氷上(4°C)に置く。内部標準物質を含む600 μLの氷冷MTBEおよび50 μLのACN/_H2O(1:1; v/v)を加える。分析の最終容量(50 μL)中の内部標準物質の標的濃度は以下の通りである:1 ng/mL AEA-d4、125 ng/mL 2-AG-d5、3,000 ng/mL AA-d8、2 ng/mL OEA-d4;PEA-d4, 12.5 ng/mL 1-AG-d5, 2.5 ng/mL PGF2α-d4 および 5 ng/mL (PGD2-d4 用);PGE2-d9;5(S)-HETE-d8;12(S)-HETE-d8;20-HETE-d6、およびTXB2-d4をそれぞれ示す。
      2. 400 μLの0.1 Mギ酸を加え、組織ライザー(30 s-1分)でホモジナイズする。ホモジネートを4°Cで5,000 x g で15分間遠心分離する。 水下相の凍結を-80°Cで10分間許可し、上部有機相の移動を容易にする。
      3. 有機相を新しいチューブに移す。37 °C で _N2 の穏やかな流れの下で蒸発させ、さらなる分析のために 50 μL の ACN/_H2O (1:1; v/v) で再構成します。
      4. 水相を-20°Cまたは-80°Cで保存し、さらなるタンパク質含量分析を行う。
   2. 血漿サンプルからeCBとeiCの共抽出を行います。
      1. 血漿アリコートを4°Cで融解する。 内部標準物質を含む MTBE 800 μL および ACN/_H2O (1:1; v/v) を 500 μL 加えます (組織分析に使用したものに類似しています、ステップ 5.1.1 を参照)。参照血漿サンプルを使用してスパイクするための内部標準濃度を最適化します。
      2. 600 μLの0.1 Mギ酸とボルテックスサンプルを4°Cで2分間加える。サンプルを 4,000 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離します。
      3. 有機相を新しいチューブに移し、37°Cで_N2 の穏やかな流れの下で蒸発させ、LC/MRM分析のために50μLのACN/_H2O(1:1; v/v)で再構成する。
         注:可能であれば、eiCsの乾燥抽出物の保存を避け、直ちにLC/MRM分析に進んでください。保管が避けられない場合は、LC注入溶媒中のサンプルを使用して、4°Cでわずか2〜3日間の短時間保管に頼ってください。
   3. 脳領域、パンチ、または他の組織粉末サンプルからPLおよびeCBの共抽出を実行します。
      1. 組織サンプルおよびセラミックビーズを含む抽出チューブを氷上(4°C)に置く。内部標準物質を含む MTBE/MeOH 800 μL (10:3; v/v) および MeOH 10 μL を加える。分析の最終量(100 μL)中の内部標準物質の目標濃度は以下の通りである:PC 17:0/14:1、PE 17:0/14:1、PA 17:0/14:1、100 ng/mL PG 17:0/14:1;詩篇17:0/14:1;PI 17:0/14:1;LPC 17:0;LPA 17:0;SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4,000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 および 3 ng/mL PEA-d4 それぞれ。
      2. 25 μM テトラヒドロリプスタチン/URB597 および 50 μg/mL BHT を含む 0.1% ギ酸 200 μL を加えます。組織ホモジナイザー(材料表)で均質化し、5,000 x g および4°Cで15分間遠心分離する。
      3. 上部の有機相を新しいチューブで回収し、37°Cで_N2 の穏やかな流れの下で蒸発させる。 90 μL の MeOH で再構成し、-20 °C または -80 °C で保存するか、次のステップに進みます。
      4. 脂質抽出物のアリコート(4.1.3.3)に10%_H2Oを加え、PLs分析のためにLC/MSに10μLを注入する。さらに eCB 分析を行うには、ステップ 4.3.5 に進みます。
      5. 抽出物のアリコート(4.1.3.3)を取り、蒸発して乾燥させ、ACN / _H2O(1:1; v / v)で再構成する。eCB 分析用の LC/MS 注射には 20 μL を使用します。
   4. 血漿サンプルからPLとeCBの共抽出を行います。
      1. 血漿アリコートを4°Cで融解し、1,000μLのMTBE/メタノール(10:3;v/v)および内部標準物質を含む10μLのMeOH(ステップ4.1.3に類似)を加え、4°Cで1分間ボルテックスする。
      2. 250 μLの_H2Oとボルテックスを4°Cで45分間加える。 サンプルを5,000 x g および4°Cで15分間遠心分離する。 上部の有機相を回収し、37°Cで_N2 の穏やかな流れ下で蒸発させ、さらにLC / MS分析のために90μLのメタノール中で再構成する。-20 °C または -80 °C で保存するか、次の手順に進みます。
      3. PLs分析のために、脂質抽出物のアリコート(4.1.2.2)に10%の水を加える。
      4. eCB分析のために、脂質抽出物のアリコートに10%の水を加え(4.1.4.3参照)、蒸発乾固させ、50%ACN/_H2O(1:1;v/v)で再構成する。
   5. 組織サンプルからRNAと脂質の二重抽出(PLとeCBの共抽出)を実行します。
      警告: RNA の分解を避けるため、必ず RNA フリーの条件下で作業してください。
      1. 組織粉末アリコートまたは脳房を(4°Cで)解凍し、5μM THL/URB597、10μg/mL BHT、および1%βメルカプトエタノール(ホモジナイズバッファーの最終容量の百分率については、ステップ4.1を参照)を含む600μLのRLTバッファーを、凍結脳パンチおよびセラミックビーズを含む抽出チューブに200 μLのクロロホルムとともに加える。
      2. PLおよびeCB共抽出用の10μLの内部標準混合物でサンプルをスパイクし(ステップ4.1.3を参照)、組織ホモジナイザーを介してホモジナイズします(高速、20秒)。
      3. 溶解物を新しい遠沈管に移し、全速力および4°Cで5分間遠心分離して相分離を可能にする。
      4. 標準のRNA抽出手順キット(材料表)を使用してRNA抽出のために上相を回収し、使用する。RNaseを含まない水の全量50 μLでRNAを溶出し、-80°Cで保存する。
         注: ステップ 4.1.5.4 のサンプルは、適切な方法とインストゥルメンテーションを使用した RNA シーケンシングと qPCR の両方に適しています。
      5. 下部クロロホルム含有相を脂質抽出に使用してください。800 μL の MTBE/メタノール (10:3; v/v) と 200 μL の 0.1% ギ酸と渦を 4 °C で 45 分間加えます。 上部の有機相を回収し、37°Cで_N2 の穏やかな流れ下で蒸発させる。
      6. 90 μL のメタノールで再構成し、さらに LC/MS 分析を行います。-20 °C または -80 °C で保管するか、手順 5 に進みます。
      7. 脂質抽出物のアリコートに10%_H2Oを加え(上記のステップ4.1.5.6を参照)、PLs分析のためにLC/MSに10μLを注入する。さらに eCB 分析を行うには、ステップ 5.7 に進みます。
      8. 抽出物のアリコート(上記のステップ4.1.5.6を参照)を取り、蒸発乾固させ、ACN / _H2O(1:1; v / v)で再構成する。eCB 分析用の LC/MS 注射には 20 μL を使用します(ステップ 4.3.5 に類似)。

5. LC/MRM定性的および定量的プロファイリング

1. LC溶媒システム、校正溶液、および品質管理サンプルを準備します。
   1. PLについては、7.5mMギ酸アンモニウムおよび0.1%TEAを含むメタノール/水(1:1;v/v)の移動相Aを調製する。移動相Bを調製する:7.5mMギ酸アンモニウムおよび0.1%TEAを含むメタノール/イソプロパノール(2:8;v/v)。LCボトルに溶剤を保管してください。
   2. eCBおよびeiC分離のために、以下のLC溶媒を調製する:移動相Aとして0.1%ギ酸、および移動相Bとして0.1%ギ酸を含む100%ACNは、LCボトルに溶媒を保管する。
   3. 校正標準および内部標準物質(表3)を使用して、等モル濃度またはユーザー定義濃度で品質管理を準備します。
   4. 7つの濃度ポイントで検量線を作成します。同じ内部標準バッチを使用して、検量線溶液および分析対象のサンプルでスパイクします。
2. 定性的および定量的な脂質プロファイリングにはLC-MRM法を使用してください。
   1. 商用ソフトウェア(アナリストなど)の ビルド取得方法 タブを開き、極性切り替え付きのLC/MRMモードを選択します。イオン遷移を定量的プロファイリングのために( 表3に与えられるように)本方法に設定する。セトリング時間を50ミリ秒に設定します。
   2. PLsプロファイリングの場合、次のイオン源パラメータを設定します:カーテンガス= 40psi;ソースヒーター温度= 550°C;イオンスプレー電圧 = マイナスイオンモードで-4,500 V、プラスイオンモードで= +5,200 V。
   3. eCBとeiCsの共分析のために、次のパラメータを設定します:カーテンガス= 40psi;ソースヒーター温度= 550°C;イオンスプレー電圧 = マイナスイオンモードで-4,500 V、プラスイオンモードで = +4,500 V。
   4. PL 分析では、カラム加熱を 45 °C、流速を 200 μL/分に設定し、次の勾配を設定します。最小3 = 40%B;最小 42 = 90% B;分43 = 99%B;最小 50 = 99% B、最小 52 = 40% B。注入量を 10 μL に設定します。
   5. eCBおよびeiCs分析の場合、カラム温度を室温に設定し、次の勾配を設定します:最小0 = 20%B;最小 1 = 20% B;最小 5 = 50% B、最小 12 = 50% B;最小 13 = 90% B、最小 17 = 90% B;最小 17.5 = 20% B;分20 = 20% B. 注入量を20μLに設定する。
      注:MRM条件は機器プラットフォームによって異なる可能性があるため、フラグメンテーションおよびMRM条件を実験的に推測し、最大の感度と選択性を得るために必要に応じてイオン化パラメータをテストおよび調整する必要があります。
3. バッチ分析を実行します。
   1. ビルド集録バッチを開き、サンプルの説明、オートサンプラーのサンプルラック内の位置、および取得方法(ステップ5.2として設定)に必要なパラメータを入力します。
   2. 分析の開始時と終了時、およびバッチ内には常に品質管理を含めます。25−30サンプルごとに、バッチ内に少なくとも3つの検量線を含め、すべての品質管理サンプル、検量線、およびサンプルバッチの最後に、選択した溶媒による洗浄ステップを含めます。
   3. ステップ4で得られたサンプルをLC/MSバイアルに移す。バッチで定義された位置に従ってサンプルをLCオートサンプラーのローディングラックに入れ、LCオートサンプラーにサンプルラックをロードします。
   4. バッチを送信し、キュー分析を開始します。
4. 脂質定量
   1. eCBおよびeiCs定量化には商用ソフトウェア(Analystなど)と組み込み定量モジュールを使用し、PLs定量には商用ソフトウェア(Multiquantなど)を使用します。
      注:2番目のソフトウェアは、特に1つの内部標準が複数の分析物の定量に使用される場合、eCBおよびeiCにも使用できます。
   2. ビルド定量方法を開き、分析物、内部標準、MRM 遷移のパラメータを入力し、内部標準を定量する分析種に帰属させます(表 3)。最小ピーク高さを 500 cps に設定します。
   3. 脂質同一性の割り当ておよびその後の定量⁶のために、以下の基準またはその組み合わせを使用する:脂質内因性分析物と較正標準物質、および/または重水素化内部標準物質(利用可能な場合)との保持時間マッチング;標準が提供されていない脂質分析物の所与のm / zに対する正および負のイオンモード断片化による断片イオンマッチング;異性体および/または異圧構造を解剖するために同様に採用されたLC条件下での脂質の文献推定溶出挙動;また、利用可能な場合は、標的分析(LC/MRMを使用)と同様のLC条件を使用して、高分解能質量分析によるLC/MSおよびMS/MS分析を行い、目的の内因性脂質の同一性および溶出挙動を正確に同定します^18,19。
   4. バッチ分析の検証には、次の基準を使用します:定量化の精度≤ ±20%;回帰係数≥0.97(理想的には≥0.99)です。
      注: バイオ分析法の開発と検証に関するガイドラインに従って、標的分子の信頼性と再現性のある分析を保証します。

結果

記載されたプロトコルのセットは、動物モデルの選択、サンプリングの経路、抽出およびプロファイリングの方法など、目的に固有の方法で異なるレベルで組み合わせることができる(図1)。

急性てんかん発作状態の経時変化に伴う脳および末梢の脂質レベル変化を決定し、PEAの潜在的な抗てんかん?...

ディスカッション

ここで説明する神経リピドミーおよびトランスクリプトーム方法論は、脳および末梢器官におけるあらゆる疾患または健康な発達を高および低空間分解能で調査するための実行可能な手段である。最適化された血漿サンプリングおよび取り扱い手順により、組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクスのために屠殺されたのと同じ動物から血漿リピドミクス分析を行うこともできるため?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017	Microscopy
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Lipid Std
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth	FST	11016-17	Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern	FST	14130-17	Surgical Tools
T3000 Thermocycler	Biometra		Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2	Biomol	Cay19030-5	Lipid Std
Thromboxane B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Lipid Std
Tissue Lyser II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek	Sakura Finetek	4583	Microscopy
Toluidinblau	Roth	0300.2	Microscopy
Vapotherm	Barkey	4004734	Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	Solvent/LCMS