신경 질환의 리피도혈 및 전사학

요약

이 기사에서는 지질학 및 전사학, 그리고 지질의 근본적인 염증 및 신경 활동, 막 지질, 다운스트림 메신저 및 mRNA 인코딩 효소/수용체를 대상으로 하는 신경 질환 마우스 모델의 혈장 지질학에 대한 모듈식 프로토콜을 제시합니다. 샘플링, 샘플 처리, 추출 및 정량화 절차가 설명되어 있습니다.

초록

지질은 신경 질환에 도움이되는 뇌 모욕이나 자극에 대한 기본 인터페이스 역할을하며 질병의 발병 및 진행을 강조 할 수있는 다양한 신호 또는 리간드 기능을 가진 지질 합성을위한 저수지입니다. 종종 전증상 수준에서 변화, 지질은 약물 표적과 바이오 마커의 신흥 소스입니다. 많은 신경 질환은 신경 염증을 전시, 신경 변성, 일반적인 특징으로 신경 흥분성, 부분적으로 특정 지질 신호 시스템에 의해 변조. 다양한 지질의 합성의 상호 의존성 및 상호 관계는 신경학적 맥락의 공통점과 특이성을 도출하고 질병 발병 및 진행의 기계적 측면의 해명속도를 촉진하기 위해 다중 지질, 다효소 및 다수용체 분석을 자극한다. 뚜렷한 뇌 영역에 지질 역할을 아스포딩하는 것은 신경 질환과 관련된 지질 분자 표현형 및 형태학의 결정을 진행합니다.

여기에 제시된 모듈식 프로토콜은 특정 신경 질환 및/또는 조건에 관련있는 이산 뇌 영역에서 추출된 기능의 근간이 되는 효소 및 중재자의 mRNA와 함께 멤브레인 지질 및 하류 지질 신호의 분석에 적합한 모듈식 프로토콜이다. 정확한 비교 지질 프로파일링을 보장하기 위해, 워크플로우 및 운영 기준은 최적화 및 표준화되었다: i) 뇌 샘플링 및 관심 영역의 해부, ii) 다중 지질 신호 및 멤브레인 지질의 공동 추출, iii) 이중 지질/mRNA 추출, iv) 액체 크로마토그래피 다중 반응 모니터링(LC/MRM), 및 v) 표준 mRNA 프로파일링에 의한 정량화. 이러한 워크플로우는 기능적으로 이산뇌 하위 영역(즉, 뇌 펀칭에 의한)의 샘플링에 의해 얻어진 낮은 조직량에 대해 가능하므로 조직 이질성 및/또는 동물 적 변이성으로 인한 다분자 분석의 편견을 방지할 수 있습니다. 신경 질환의 말초 결과를 밝히고 신경 질환 상태의 번역 분자 판독을 확립하기 위해 말초 장기 샘플링, 처리 및 후속 지방 피도혈 분석뿐만 아니라 혈장 리피도믹도 추구되고 설명됩니다. 프로토콜은 급성 간질 마우스 모델에서 입증된다.

서문

지질의 기능과 신경 질환의 발병 및 진행에 대한 역할의 최근 발전은 새로운 치료 목표 및 질병 메커니즘 의 새로운 연구 및 개발 장소를 열어¹. 질량 분석 영상 및 고급 질량 분광 프로파일링과 같은 현대 분자 이미징 기술에 의해 강조되는 다른 뇌 영역에서 지질 조성에 대한 문서화 된 차이는 전체 뇌에서 지질 조사의 패러다임을 기능적으로 뚜렷하고 이산적인 뇌 영역으로 전환합니다. 지질 성분이 다른 뇌 영역에서 다르다는 사실은 기능적으로 뚜렷한 뇌 영역을 가로지르는 뇌 모욕이나 자극에 대응하여 멤브레인 지질 감수성과 하류 지질 신호의 새로운 개념화를 자극합니다. 따라서 지질 프로토콜은 더 높은 공간 분해능 검출 및 정량화, 그리고 동시에 세포막 및 신호 경로의 여러 지질 성분의 분석을 위해 낮은 조직 량의 과제를 해결하기 위해 새로운 개발이 필요합니다. 또한, 효소의 결정, 지질 리간드, 그들의 수준 및 기능의 조절에 관련 된 수용 체는 신경 질환에 영향을 받는 신호 경로를 해명 하 고 병리학적 맥락에서 새로운 기계분석 조사를 안내 하는 것이 가장 중요 하다.

증가 된 뇌 공간 해상도 뿐만 아니라, 새로운 신경 지질 도성 접근의 개발에 도전 하는 두 가지 주요 어려움이 있다. 첫째, 지질 신호 분자는 일반적으로 막 구성 지질에 비해 매우 낮은 풍부의. 둘째, 리피돔은 단일 분석 접근법을 사용하여 해부하기 어려운 높은 구조적 이질성을 나타낸다. 따라서 추출 및 분석 방법은 다른 지질 범주에 맞게 조정되며 일반적으로 뚜렷한 조직 샘플에서 수행됩니다.². 산탄총 리피도믹 방법³ 막 지질의 광범위한 프로파일을 빠르게 드러내는 우수한 도구이며, 표적 발견 및 정량화 질량 분광 방법에 의해 제공되는 감도와 선택성이 증가하면서: i) 염증지질 및 ii) 지질을 포함하는 낮은 풍부한 신호 지질의 조사를 위해 자본화되어 있습니다. 등.^4,5. 신경 질환 모델의 뇌 영역에서 발생하는 세포막 및 신호 수준 모두에서 지질 변화를 포괄하기 위해, 전형적으로 지질 추출 및 분석은 뚜렷한 조직 샘플에서 수행되며, 뚜렷한 동물 배치 또는 다른 반구로부터 얻어지거나, 더 큰 조직 영역을 여러 조각으로 해부함으로써 수행된다. 효소 수용체의 mRNA 수준이 또한 관심있는 때, 그들의 조사는 일반적으로 명백한 조직 견본의 조달을 요구합니다. 예를 들어, 막 지질, 내인성 카나비노이드 및 mRNA의 조사는 3개의 다른 조직 샘플(예를 들어, 2개의 지질 추출 방법-막 지질 및 신호 지질에 대한 2개의 샘플-및 mRNA 분석을 위한 1개의 샘플)을 요구할 것이다. 염증성 지질 및 내인성 카나비노이드에 대한 조사는 각각 두 가지 조직 샘플, 추출 방법 및 분석 방법을 필요로합니다. 또 다른 예는 mRNA와 뇌 펀치 또는 레이저 미세 절 샘플에서 임의의 지질 범주의 조사로, 결과적으로 뇌 (하위) 지역 당 두 개의 샘플을 조달하기 위해 두 개의 별개의 동물을 필요로합니다. 결과의 가변성 및/또는 나쁜 재현성의 상당한 정도는 생물학적 가변성 및/또는 조직 이질성에서 기인하는 그러한 경우에 자주 발생합니다. 특히 뇌의 높은 공간 해상도에서 발생하는 다분자 분석의 이러한 실질적인 한계에 의해 유도된 3모듈 신경지질학 프로토콜은 염증지질의 LC/MRM(예를 들어, eicosanoids(eiC)에 의한 코추출 및 공동 분석을 포괄하도록 설계되었으며, eCB와 같은 뉴런 활동의 변조에 관여하는 지질²; 2) 후속 멀티스캔 LC/MRM 및 전구체/중립 손실 스캔 분석을 통해 인지질(PL) 및 ECB의 공동 추출²; 및 3) 후속 LC/MRM 및 qPCR 또는 RNA 염기서열 분석과 함께 막(인)과 eCB뿐만 아니라 mRNA의 이중 추출⁶. 신경질환과 관심있는 뇌 영역에서 다루어야 할 생물학적 질문에 따라, 제1 및 제2 프로토콜의 조합, 또는 제 1 및 제 3 프로토콜의 조합은 약 4 mg의 조직을 위한 동일한 조직 표본에 적용될 수 있다. 첫 번째 및 세 번째 프로토콜은 약 2 mg의 조직에 독립적으로 적용할 수 있습니다. 두 번째 프로토콜은 0.5 mg의 무게 조직에 적용할 수 있습니다. 선택된 신경지질성 프로토콜 모듈에 관계없이, 조직 샘플링 및 사전 분석 처리, 뇌 격리 및 영역 해부뿐만 아니라 동물 모델을 희생하는 절차는 프로토콜의 세 모듈 모두에 대해 표준화되고 동일하다. 신경 질환에 대한 우리의 조사에서, 질병의 병리학적 결과에 관련있는 말초 기관은 항상 이러한 모듈형 프로토콜을 사용하여 수집및 분석됩니다. 또한, 혈액은 정기적으로 플라즈마 리피도믹스를 위해 샘플링되어 미래의 번역 응용 분야에 대한 견해를 가진 신경 질환의 판독 도구로 사용됩니다. 여기에 제시 된 모듈식 리피도믹스 프로토콜은 매우 다재다능합니다 : 더 큰 조직 양으로 확장 가능하고 거의 모든 조직 유형및 질병에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 모듈식 프로토콜의 적용을 위해(그림 1)) 신경질환에서는 외상성 뇌손상, 파킨슨병, 알츠하이머병, 간질 등 신경질환의 발병 및 진행의 표준화된 설치류 모델이 가능하다.

이러한 프로토콜은 kainic acid (KA)유도 마우스 모델인 간질의 급성 단계에서 조직 립피돔 및/또는 전사체의 변화를 연구하기 위해 광범위하게 적용^{되었으며, 인간} 측두엽 간질(TLE)과 유사하기 때문에 전임상 연구에서 널리 사용되는 모델이다.^8,911.11. 이러한 프로토콜을 이용하여, 팔미토일레탄올라미드(PEA)^12,13과 같은 약물의 치료 잠재력은 간질의 동일한 마우스 모델에서 평가되었다. 이 연구는 뇌와 주변의 높고 낮은 공간 해상도에서 지질 및 mRNA 의 변화를 확인, 최대 급성 발작 강도의 시점에서 (60 분 발작 유도), 4 개의 다른 시점에서 완두콩과 과급성 및 급성 치료에 (20, 60, 120, 180 분) 후 KA 발작 후 급성 시간 감이, 시간 감전. 치료되지 않은 KA 주입 마우스의 플라즈마, 뇌 및 말초 기관, 급성 및 하위 완두콩 처리 마우스뿐만 아니라 차량 및 완두콩 차량 제어 마우스는 매 시점 ^12,13에 수집되었으며, 이러한 분자 분석을 통해 조사하였다. 분자 데이터는 급성 간질 단계및 PEA의 잠재력의 진행을 해명하기 위해 발작 점수에 의해 얻어진 행동 표현형뿐만 아니라 신경 퇴행성 과정에 대한 면역 조직화학 유래 데이터와 상관관계가 있었다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 실험 절차는 2010년 9월 22일(2010/63EU)의 유럽 공동체 위원회 지침에 따라 독일 라인란트 팔츠 주 지역 동물위원회의 승인을 받았습니다(파일 참조: 23 177-07/G16-1-075).

1. 급성 및 예방 치료 KA 유도 간질의 동물 모델

1. 발작 유도, 치료 및 행동 점수를 수행합니다.
   1. 단일 케이지에서 분리 마우스(최소 n = 그룹당 6마우스).
   2. 발작 유도 주입 용액 및 해당 차량( 표 1 참조)과 치료 사출 용액 및 해당 차량을 준비합니다( 표 2 참조).
   3. 그들의 그룹 정체성에 따라 마취 없이 마우스 내회(즉, 10mL/kg 마우스 체질량)를 주입합니다: 질병, 치료 또는 차량 치료(즉, KA, PEA 처리된 KA 및 2개의 차량 그룹). 그림 2, 표 1 및 표 2를 참조하십시오.
   4. 다음 표준화된 발작 강도 척도에 따라 동작을 모니터링하고 점수를 매는 다: 0 = 응답 없음; 1 = 부동성 및 응시; 2 = 앞다리 및/또는 꼬리 확장, 경직된 자세; 3 = 반복적 인 움직임, 머리 보빙; 4 = 사육 및 낙하; 5 = 연속 사육 및 낙하; 6 = 심한 클로닉 토닉 발작; 7 = 데스^14,15 (그림 3).
2. 리피도믹 및 전사 분석을 위한 희생 절차를 수행합니다.
   1. 4개의 시점에서(즉, 20, 60, 120 및 180분 포스트 KA-또는 차량 주입) 각 그룹에서 6개의 마우스를 희생합니다: 완두콩 처리, 완두콩 처리되지 않은 간질 차량 1, 및 차량 2, IACUC 승인 프로토콜에 따라.
   2. 매 시간 점에 도달 한 후 10 초, 유리 챔버에서 이소플루란 에 젖은 조직을 사용하여 마우스를 마취. 유리 챔버를 천천히 뒤집으면서 움직일 수 없음으로 표시된 오른쪽 반사반사의 손실로 마취를 확인합니다. 외과 가위를 사용하여 쥐를 참수하고 플라즈마, 뇌 및 말초 장기를 수집합니다 (단계 2.2.2-2.2.4 참조).
      주의: 희생 절차에 대한 윤리 규정은 지역 동물 위원회마다 다릅니다. 지역 동물 위원회가 발행한 규정을 확인하고 준수해야 합니다.
3. 면역히스토화학 분석을 위한 희생 절차를 따르십시오.
   1. 면역조직화학 염색¹³의 경우, 완두콩 처리, 완두콩 처리되지 않은 간질 및 차량 그룹( 전체 시간 과정(180분)에서 행동적으로 다음 각 그룹에서 3개의 마우스를 득점한다.
   2. 5 일 후 마우스를 희생하고 퍼퓨즈하십시오. 심층 마취 마우스 (마우스 그룹에 대 한 단계 1.3.1 참조) i.p. 펜토 바르 비탈의 주입 (100 mg/kg) 및 buprenorphine (0.1 mg/kg) 마약 약물로. 발가락 사이의 반사의 손실에 의해 깊은 마취를 확인합니다.
   3. 폴리스티렌 플레이트에 마우스를 고정하고 즉시 미세 가위와 표준 집게를 사용하여 흉부를 엽니 다. 왼쪽 심장 심실에 나비를 설정하고 미세 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움을 잘라.
   4. 펌프의 속도와 압력을 2-3mL/min의 속도로 일정한 연동 흐름으로 조정합니다. 얼음 차가운 인산염 완충식식염(PBS)을 ~5분 동안 퍼퓨즈합니다. 필요한 경우 나비를 교체하십시오.
      참고 : 적절한 관혈으로 내부 장기 (비장을 제외한)는 1 -2 분 이내에 표백하기 시작합니다.
   5. -5 분 동안 얼음 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 솔루션으로 관류를 전환합니다. 단계 2.2.2에 설명된 대로 전체 뇌를 분리하고 4°C에서 4% PFA 용액에서 24시간 동안 수정합니다.
   6. 4°C에서 48h용 30% 자당 용액으로 뇌를 배양한다. 마른 조직 종이로 남은 자당을 제거하고 금속 판 (-80 °C)에 뇌를 동결. 염색 절차를 위해 뇌를 -80 °C에 저장¹³.

2. 리피도믹/전사 분석을 위한 샘플링 절차

1. 샘플링을 준비합니다.
   1. 플라즈마 샘플링을 위한 사전 냉각 EDTA-튜브를 4°C로 샘플링합니다. 원심분리기 및 소용돌이 장치를 4°C로 미리 식힙니다. 건조 얼음 (-80 °C)에 알루미늄 호일로 덮여 금속 판을 미리 식힙니다 (냉동 뇌 및 / 또는 관심의 다른 조직을 스냅). 플라즈마 알리쿼트, 냉동 조직 및 뇌 수집을 위해 드라이 아이스(-80°C)에 2mL 및 5mL 튜브를 미리 냉각시합니다. 호박색 튜브를 사용하여 eI와 같은 빛에 민감한 분자를 보호합니다.
   2. 조직 샘플링 및 격리 장비(수술 용 가위, 직선 미세 가위, 직선 매끄러운 표준 집게, 거울 마감, 곡선 집게 및 주걱, 폴리스티렌 폼 플레이트 및 고정바늘이 있는 미세한 집게, 폴리스티렌 폼 플레이트 및 고정바늘)을 소독제로 청소하십시오(예: 70% 에탄올).
2. 샘플링 프로토콜
   1. 샘플링 순서를 결정합니다.
      1. 미리 냉각된 1mL EDTA 튜브에서 참수 직후 혈액을 수집합니다(2.2.3단계 참조).
      2. 전체 뇌를 제거하고 제거 직후 동결을 스냅합니다. 이 단계는 1-2 분 정도 걸릴 것입니다. 추가 처리를 위해 -80 °C에 냉동 된 두뇌를 저장합니다 (2.2.2 단계 참조).
      3. 관심있는 주변 장기 (예 : 폐, 심장, 간)를 제거하고 5 분 이내에 뇌 제거를 제거하고 추가 처리를 위해 -80 °C에서 고정 및 저장하십시오 (단계 2.2.4 참조).
   2. 해부 또는 펀칭 절차에 대 한 뇌를 제거 합니다. 이 절차는 1-2 분 / 뇌를 취합니다.
      1. 참수 후 (단계 1.2 참조), 미세 가위를 사용하여 피부에 중간 절개를 만들기 시작합니다. 눈 위로 피부를 뒤집어 두개골을 풀어. 두개골 의 상단에 도달하고 함정 뼈의 수준에서 시작하는 작은 caudal 절개를합니다. 뇌를 절단하지 마십시오.
      2. 눈 사이에 두개골의 가장 앞쪽 부분을 단단히 잘라 뇌 제거를 용이하게합니다. 구부러진 좁은 패턴 집게를 사용하여 정수리 뼈의 한쪽을 기울이고 끊습니다. 다른 쪽의 마지막 단계를 반복합니다.
      3. 뇌 수막을 제거합니다. 뇌의 전방 부분(즉, 후각 전구)에서 주걱을 밀어 내고 뇌를 부드럽게 위쪽으로 기울입니다. 주걱을 더 아래로 밀어 광학 및 기타 두개골 신경을 분해합니다.
      4. 두개골에서 뇌를 들어 올리고 스냅은 금속 판 (등쪽 업)을 향한 복부 면이있는 미리 냉각 된 (-80 °C) 금속 판에 즉시 전체 뇌를 얼립니다.
      5. 뇌가 완전히 동결및 미리 냉각된 5mL 튜브로 옮기고 뇌 영역의 해부 또는 펀칭 시술까지 -80°C에 저장하도록 허용합니다(단계 3.1 및 3.2).
   3. 플라즈마 샘플링을 수행합니다.
      1. 스파이크는 10 μM의 목표 농도로 갓 준비된 10 μL의 EDTA-튜브를 미리 냉각시켰다.
      2. 몸을 부드럽게 압박하여 참수 직후 에쓰-1mL의 최대 혈액 부피로 몸을 부드럽게 압박하여 트렁크 혈액을 수집합니다.
         참고: 적절한 혈압의 경우 압박이 필요하지 않습니다. 혈액 부피가 1mL 미만인 경우 적절한 혈류를 가능하게하기 위해 이소플루란 인큐베이션 시간을 줄입니다.
      3. 즉시 원심 분리 혈액 튜브에 2,000 x g 에 10 분 4 °C에서.
      4. 생성된 상부 플라즈마 위상을 제거하고 다음과 같이 미리 냉각된 2mL 튜브에서 정의된 다중지질 분석 알리쿼트(aliquot)를 목적으로: eCB/eiC 분석을 위한 50μL, PLs 분석을 위한 30μL, 그리고 나머지 플라즈마 부피가 백업 샘플 또는 다른 유형의 분석으로.
      5. 플라즈마 샘플을 추가 추출을 위해 -80°C에 저장합니다(4.1.2 단계 및 4.1.4 단계 참조).
   4. 주변 기관 샘플링을 수행합니다.
      참고: 마우스 해부학 참조¹⁶ 및 동물 조사자가 참석한 의무 과정(FELASA)에 제공된 문서를 사용하여 개별 장기, 결합 조직 및/또는 혈관을 식별합니다.
      1. 바늘을 사용하여 장기 제거를 용이하게하기 위해 마우스 몸통을 고정. pubis 높이에서 직선 날카로운 가위를 사용하여 복부 중간 선 절개를합니다. 무딘 표준 집게를 사용하여 복강을 열도록 절단하는 동안 복벽을 고정하십시오.
      2. 무딘 집게를 사용하여 복부 기관 제거를 허용하기 위하여 피부를 움직이지 않습니다. 심장 또는 폐 제거를 위해 유방 동굴 방향으로 내측 절단을 계속하십시오. 미세 한 집게를 사용 하 여 폐 및/또는 심장을 제거 합니다.
      3. 출혈을 피하기 위해 유방 구멍을 조심스럽게 엽니다. 장기를 절단하지 않고 각 장기를 고정 결합 조직과 혈관을 잘라.
      4. 미리 냉각된 금속 판(-80°C)에 즉시 티슈 조각을 옮기고 완전히 동결할 수 있습니다. 조직 조각을 미리 냉각된 튜브로 옮기고 -80°C에 저장하여 추가 처리를 위해(4.1단계 참조).

3. 생물학적 재료 처리

참고: eCB/eiC의 공동 추출을 위해 2mL 호박관을 추출 튜브로 사용하고 각 튜브에 7개의 미리 냉각된 강철 공을 추가합니다. PLs/ECB의 공동 추출과 이중 지질 및 RNA 공동 추출을 위해 세라믹 구슬(재료 표)으로 스파이크된 RNA 가없는 추출 튜브 2mL을 사용하십시오.

1. 뇌 해부 및 주변 장기 처리를 수행합니다.
   참고: 돋보기 램프를 사용하여 해부에 대한 뇌의 가시성을 높입니다.
   1. 슈퍼 미세 한 팁과 집게를 포함 하 여 수술 도구를 청소, 2 x 와 70% 에탄올.
   2. 냉동 뇌를 -80°C에서 미리 냉각된 생리적 완충액(pH 5.5)을 함유한 페트리 접시로 옮기면 페트리 접시가 4°C에 있는지 확인합니다. 뇌가 완전히 동결 해제되어 해부를 허용하십시오. 집게를 사용하여 신중하게 테스트합니다.
      주의: 해빙에 필요한 것보다 뇌를 4°C 이상 유지하지 마십시오.
   3. 얼음(4°C)에 금속판을 미리 식히고 얼음냉이 생리완(pH 5.5)에 담근 젖은 조직으로 덮고, 뇌를 얼음 위에 미리 냉각된(4°C) 금속판에 조심스럽게 올려놓습니다. 얼음 차가운 생리완충(pH 5.5)에 담근 젖은 조직으로 덮습니다.
   4. 슈퍼 미세 팁 집게를 사용하여 최대 5 분 이내에 뇌 영역을 해부합니다. 시상 하부 (HYP)로 시작하고 오른쪽으로 진행하기 위해 등쪽을 위로 설정합니다. 해마 (HCr), 전두엽 피질 (PFCr), 스트트리아툼 (STR), 대뇌 피질 (cCTXr)을 분리합니다. 그런 다음 왼쪽을 해부합니다. 해마 (HCl), 전두엽 피질 (PFCl), 스트트리아툼 (STRl), 대뇌 피질 (cCTXl)을 분리합니다. 소뇌와 탈라믹 부위를 해부한다. 뇌 영역 식별을 위해 출판 된 해부학 적 참조^16,17을 사용합니다.
   5. 알루미늄 호일 덮인 미리 냉각된 금속 판(-80°C)에 직접 해부된 각 조각을 전달합니다. 표지된 2mL 튜브에서 격리된 뇌 영역을 동결하고 이송할 수 있습니다.
   6. 조직의 해동을 피하면서 조직 분쇄기(-80°C)를 사용하여 조직 조각을 분쇄합니다. 차가운 방에서, 세라믹 구슬 이나 강철 공을 포함 하는 라벨, 미리 냉각 추출 튜브에 알리 쿼트 조직 분말. 이중 리피도믹스/전사학 분석을 위해, 차가운 방에 있는 조직 분말 알리쿼트의 무게를 달아라. 리피도믹스 전용 분석의 경우 조직 중량 또는 단백질 함량으로의 정상화 중에서 선택하십시오. 후자의 경우, 조직 계량없이 더 진행하십시오.
   7. 20 mg의 최대 무게로 말초 장기 조직을 조각으로 잘라냅니다. 3.1.6 단계에서와 같이 조직 분쇄를 진행합니다.
   8. 조직 샘플의 추출을 진행 (단계 4.1.1, 4.1.3, 또는 4.1.5) 또는 나중에 추출을위한 -80 °C에서 튜브를 저장합니다.
      참고: 연구 설계가 허용하는 경우 뇌 매트릭스도 사용할 수 있습니다. 그러나, 이 방법은 이산 및 제한된 수의 뇌 영역에 더 적합하며, 설정된 시간 내에 위에서 언급한 모든 뇌 영역을 해부하고 격리하는 것은 실용적이지 않다.
2. 뇌 펀칭을 수행합니다.
   1. 냉동 된 뇌 전체를 냉동 된 뇌를 냉동 된 마운스트 (재료 표)에 장착하십시오. 두께를 50 μm로 설정하고 관심 영역과 가까운 트림 모드로 슬라이스합니다.
   2. 토루이딘 블루(0.1%-1%)를 이용한 스테인 브레인 브레인 슬라이스(18-20 μm)는 관심 있는 하위 영역을 국소화하는 기준이다. 현미경을 사용하여 얼룩진 조각을 검사하여 주먹으로 관심 있는 영역을 식별합니다. 마우스 아틀라스를 참조로 사용하여 적절한 뇌 해부학 영역을 찾습니다¹⁶. 미리 냉각된 튜브의 샘플 코러스를 사용하여 직경 0.8-1.0mm의 펀치를 사용하십시오.
   3. 세라믹 구슬이나 강철 공이 들어있는 2mL 추출 튜브로 표시된 콜드 룸에서 냉동 펀치의 무게를 측정합니다. EC및 eIC 공동 추출에 호박튜브를 사용합니다.
   4. 추출을 시작 (단계 4.1.1, 4.1.3 또는 4.1.5) 또는 추가 추출을 위해 -80 °C에서 튜브를 저장합니다.
3. 플라즈마 처리를 수행합니다.
   1. 얼어붙은 플라즈마 샘플을 얼음(4°C)에 놓고 해동(~20분)합니다.
   2. 추출을 시작하기 전에 플라즈마가 완전히 고정되지 않았는지 확인합니다.
   3. 플라즈마 추출 절차를 진행합니다(4.1.2 또는 4.1.4 단계 참조).
      참고: 플라즈마 샘플은 추출될 때까지 -80°C에 머물러야 합니다. 해동 및 동결주기를 피하십시오.

4. 추출 절차

1. 액체 액체 (LLE) 지질 공동 추출 프로토콜을 수행합니다.
   1. 뇌 조각, 펀치 또는 조직 분말 샘플에서 EC및 eIC의 공동 추출을 수행합니다.
      참고: 절차 전반에 걸쳐 정확한 파이펫팅이 필요합니다.
      1. 조직 샘플과 7개의 강철 공을 포함하는 추출 튜브를 얼음(4°C)에 놓습니다. 내부 표준을 포함하는 얼음 차가운 MTBE 600 μL과 ACN/_H2O(1:1; v/v)의 50 μL을 추가합니다. 분석(50 μL)에 대한 최종 부피에서 내부 표준의 표적 농도는 다음과 같습니다: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3,000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; 완두콩-d4, 12.5 ng/mL 1-AG-d5, 2.5 ng/mL PGF2α-d4 및 PGD2-d4용 5 ng/mL; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 각각 20-HETE-d6 및 TXB2-d4.
      2. 0.1M 포름산의 400 μL을 추가하고 티슈 서(30 s-1분)로 균질화합니다. 원심 분리기 4 °C에서 5,000 x g 에서 15 분 동안 동종. -80°C에서 10분 동안 수성 하층의 동결을 허용하여 상부 유기상의 전달을 용이하게 한다.
      3. 새로운 튜브에서 유기 상을 전송합니다. 37°C에서 _N2 의 부드러운 스트림 하에서 증발하고 추가 분석을 위해 ACN/_H2O(1:1; v/v)의 50μL로 재구성합니다.
      4. 추가 단백질 함량 분석을 위해 수성 상을 -20°C 또는 -80°C에 저장합니다.
   2. 플라즈마 샘플에서 EC및 eI의 공동 추출을 수행합니다.
      1. 4 °C에서 플라즈마 알리코를 해동하십시오. MTBE의 800 μL과 내부 표준을 포함하는 ACN/_H2O(1:1; v/v)의 50 μL을 추가합니다(조직 분석에 사용되는 것과 유사하며, 단계 5.1.1참조). 레퍼런스 플라즈마 샘플을 사용하여 스파이크에 대한 내부 표준 농도를 최적화합니다.
      2. 0.1M 포름산및 소용돌이 시료 600μL을 4°C에서 2분 동안 추가합니다. 원심분리기 샘플은 4°C에서 15분 동안 4,000 x g 에서 샘플링합니다.
      3. 유기상을 새로운 튜브로 옮기고, 37°C에서 _N2 의 부드러운 스트림 하에서 증발하고, LC/MRM 분석을 위해 50 μL의 ACN/_H2O(1:1; v/v)로 재구성한다.
         참고: 가능하면 말린 eiC 추출물을 보관하지 말고 LC/MRM 분석으로 즉시 진행하십시오. 저장을 피할 수 없는 경우 LC 사출 용매의 샘플과 함께 4° C에서 2-3일 동안만 짧은 저장에 의존하십시오.
   3. 뇌 영역, 펀치 또는 기타 조직 분말 샘플에서 PLs 및 ECB의 공동 추출을 수행합니다.
      1. 조직 샘플및 세라믹 구슬을 포함하는 추출 튜브를 얼음(4°C)에 놓습니다. MTBE/MeOH(10:3; v/v) 및 내부 표준을 포함하는 MeOH의 10 μL을 추가합니다. 분석(100 μL)에 대한 최종 부피에서 내부 표준의 목표 농도는 다음과 같습니다: PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; 추신수 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4,000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 및 3 ng/mL PEA-d4 각각.
      2. 25 μM 테트라하이드로립스타틴/URB597 및 50 μg/mL BHT를 함유한 0.1% 포름산의 200 μL을 추가합니다. 조직 균질화제(재료표) 및 원심분리기는 5,000 x g , 4°C에서 15분 동안 균질화한다.
      3. 새로운 튜브에서 상부 유기 상을 복구하고 37 °C에서 _N2 의 부드러운 스트림에서 증발. MeOH의 90 μL로 재구성하고 -20°C 또는 -80°C에 저장하거나 다음 단계를 진행한다.
      4. 지질 추출물(4.1.3.3)의 알리쿼트에 10% _H2O를 추가하고 LS 분석을 위해 LC/MS에 10 μL을 주입한다. 추가 eCB 분석을 위해 4.3.5 단계를 진행합니다.
      5. 추출물(4.1.3.3)의 알리쿼트(4.1.3.3)를 취하고, ACN/_H2O(1:1; v/v)에서 건조하고 재구성하기 위해 증발한다. eCB 분석을 위해 LC/MS 주입에 20 μL을 사용하십시오.
   4. 플라즈마 샘플에서 PLs 및 ECB의 공동 추출을 수행합니다.
      1. 4°C에서 플라즈마 알리쿼트해, MTBE/메탄올 1,000μL(10:3; v/v) 및 내부 표준(4.1.3단계과 유사)을 포함하는 10 μL MeOH를 추가하고 1분 동안 4°C에서 소용돌이를 함유한다.
      2. _H2O의 250 μL과 4 °C에서 45 분 동안 소용돌이를 추가하십시오. 원심분리기 샘플은 5,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 샘플링됩니다. 상부 유기 상을 복구하고, 37°C에서 _N2의 부드러운 스트림 하에서 증발하고, 추가 LC/MS 분석을 위해 메탄올의 90 μL로 재구성한다. -20°C 또는 -80°C에 보관하거나 다음 단계로 진행하십시오.
      3. PLs 분석을 위해 지질 추출물(4.1.2.2)의 알리쿼트에 10%의 물을 추가합니다.
      4. eCB 분석을 위해 지질 추출물의 알리쿼트에 10%의 물을 추가하고(4.1.4.3 참조), 건조로 증발하고 50% ACN/_H2O(1:1; v/v)로 재구성합니다.
   5. 조직 샘플에서 RNA 및 지질(PLs 및 eBC의 공동 추출)의 이중 추출을 수행합니다.
      주의: RNA 의 저하를 피하기 위해 RNA가 없는 조건에서 작동하도록 하십시오.
      1. 해동 조직 분말 알리쿼트 또는 뇌 다발 (4 °C에서) 5 μM THL / URB597, 10 μg / mL BHT, 1 % β -mercaptoethanol을 포함하는 RLT 버퍼의 600 μL을 추가 (균질화 완충의 최종 볼륨의 백분율에 대한, 200 μL 의 추출 및 추출 에 단계 4.1)와 함께.
      2. PLs 및 eCB 공동 추출을 위한 10 μL의 내부 표준 혼합물을 가진 스파이크 샘플(단계 4.1.3 참조) 조직 균질화(고속, 20s)를 통해 균질화한다.
      3. 리세이트를 새로운 원심분리기 튜브및 원심분리기로 최대 속도 5분, 상 분리를 가능하게 하는 4°C로 이송한다.
      4. 표준 RNA 추출 절차 키트(재료 표)를 사용하여 RNA 추출을 위한 상층을 회수하고 사용합니다. Elute RNA는 RNase가 없는 물의 총 부피 50 μL로 - 80°C에 저장합니다.
         참고: 4.1.5.4 단계의 샘플은 적절한 방법 및 계측을 사용하여 RNA 시퀀싱 및 qPCR 모두에 대해 가능합니다.
      5. 지질 추출을 위해 하부 클로로폼 함유 단계를 사용합니다. MTBE/메탄올(10:3; v/v) 800 μL과 4°C에서 45분 동안 0.1%의 포름산과 소용돌이의 200 μL을 추가합니다. 상부 유기 상을 복구하고 37 °C에서 _N2 의 부드러운 스트림에서 증발.
      6. 추가 LC/MS 분석을 위해 메탄올의 90 μL로 재구성합니다. -20°C 또는 -80°C에 보관하거나 5단계로 진행하십시오.
      7. 지질 추출물의 알리쿼트에 10% _H2O를 추가하고(위의 단계 4.1.5.6 참조) LS 분석을 위해 LC/MS에 10 μL을 주입합니다. 추가 eCB 분석을 위해 5.7 단계를 진행합니다.
      8. 추출물의 알리쿼트(위 단계 4.1.5.6 참조)를 사용하여 ACN/_H2O(1:1; v/v)에서 건조및 재구성으로 증발합니다. eCB 분석을 위해 LC/MS 주입에 20 μL을 사용하십시오(4.3.5 단계와 유사).

5. LC/MRM 정성적 및 정량적 프로파일링

1. LC 용매 시스템, 교정 솔루션 및 품질 관리 샘플을 준비합니다.
   1. PLs의 경우, 이동상 A: 메탄올/물(1:1; v/v)에 7.5mMM 암모늄을 함유하고 0.1% TEA를 준비한다. 이동상 B 준비: 메탄올/이소프로판올(2:8; v/v)은 7.5mM 암모늄과 0.1% 차를 함유하고 있다. LC 병에 용매를 보관하십시오.
   2. eCB 및 eiC 분리의 경우, 다음 LC-용매를 준비: 0.1% 포믹산 모바일 상 A로, 100% ACN은 0.1% 포믹산을 함유하고 있으며, 100% ACN은 LC 병에 용매로서 0.1%의 포믹산을 함유하고 있다.
   3. 교정 표준 및 내부 표준(표 3)을 사용하여 저구또는 사용자 정의 농도로 품질 제어를 준비합니다.
   4. 7개의 농도 점으로 교정 곡선을 준비합니다. 동일한 내부 표준 배치를 사용하여 캘리브레이션 곡선 솔루션과 분석할 샘플에서 스파이크합니다.
2. LC-MRM 방법을 사용하여 질적 및 정량적 지질 프로파일링을 하십시오.
   1. 상용 소프트웨어(예: 분석가)에서 빌드 획득 방법 탭을 열고 극성 전환이 있는 LC/MRM 모드를 선택합니다. 정량 프로파일링을 위해 이온 전환( 표 3에 지정된 대로)을 메서드에 설정합니다. 정착 시간을 50ms로 설정합니다.
   2. PLs 프로파일링의 경우 다음 이온 소스 매개 변수를 설정합니다: 커튼 가스 = 40 psi; 소스 히터 온도 = 550 °C; 이온 스프레이 전압 = -4,500 V 음이온 모드 및 = 양성 이온 모드에서 +5,200 V.
   3. ECB 및 eIC의 공동 분석을 위해 커튼 가스 = 40 psi; 소스 히터 온도 = 550 °C; 이온 스프레이 전압 = -4,500 V 음수 이온 모드 및 = 양성 이온 모드에서 +4,500 V.
   4. PL 분석을 위해, 기둥 가열을 45°C로 설정하고 유량은 200 μL/min으로 설정하고 다음 그라데이션을 설정합니다: 최소 0 = 40% B; 최소 3 = 40% B; 최소 42 = 90% B; 최소 43 = 99% B; 분 50 = 99% B, 분 52 = 40% B. 사출 부피를 10 μL로 설정합니다.
   5. eBC 및 eIC 분석의 경우, 실온에서 기둥 온도를 설정하고 다음 그라데이션을 설정합니다: 최소 0 = 20% B; 최소 1 = 20% B; 최소 5 = 50% B, 최소 12 = 50% B; 최소 13 = 90% B, 최소 17 = 90% B; 최소 17.5 = 20% B; 분 20 = 20% B. 사출 부피를 20 μL로 설정합니다.
      참고: MRM 조건은 기악 플랫폼마다 다를 수 있으므로 단편화 및 MRM 조건은 실험적으로 추론되어야 하며 최대 감도 및 선택성을 얻기 위해 필요한 경우 이온화 매개 변수를 테스트하고 조정해야 합니다.
3. 일괄 분석을 수행합니다.
   1. 빌드 수집 배치를 열고 샘플 설명에 필요한 매개 변수, 자동 샘플러의 샘플 랙의 위치 및 수집 방법(단계 5.2로 설정)을 입력합니다.
   2. 항상 분석의 시작과 끝에 및 배치 내에서 품질 관리를 포함합니다. 매 25-30 샘플 후, 배치 내에서 적어도 세 개의 교정 곡선을 포함하고 모든 품질 관리 샘플, 교정 곡선 및 샘플 배치의 끝에 후 선택의 용매와 세척 단계를 포함한다.
   3. LC/MS 바이알의 4단계에서 얻은 샘플을 전송합니다. 배치에 정의된 위치에 따라 LC 자동 샘플러의 로딩 랙에 샘플을 배치하고 LC 자동 샘플러에 샘플 랙을 로드합니다.
   4. 일괄 처리를 제출하고 큐 분석을 시작합니다.
4. 지질 정량화
   1. PLs 정량화에 대한 상용 소프트웨어(예: 분석가)와 EIC 정량화 및 상용 소프트웨어(예: 멀티퀀트)에 대한 임베디드 정량화 모듈을 사용합니다.
      참고: 두 번째 소프트웨어는 특히 여러 분석물의 정량화에 하나의 내부 표준을 사용하는 경우 EC및 eIC에도 사용할 수 있습니다.
   2. 개방형 빌드 정량화 방법을 열고 내부 표준, MRM 전환에 대한 매개 변수를 채우고 내부 표준을 정량화할 별립에 대한 결과물(표 3). 최소 피크 높이를 500 cps로 설정합니다.
   3. 지질 정체성 할당 및 후속 정량화⁶에 대한 다음 기준 또는 조합을 사용하십시오: 교정 표준과 지질 내인성 분석물의 보존 시간 매칭, 및/또는 유정된 내부 표준이 가능한 경우; 표준이 제공되지 않는 지질 분석물의 주어진 m/z에 대한 양수 및 음수 이온 모드 단편화에 의해 일치하는 조각 이온; 유사하게 사용되는 LC 조건하에서 지질의 문학 유추형 용출 거동은 이소성 및/또는 동소근 구조를 해부합니다. 그리고, 가능한 경우, 고해상도 질량 분석법으로 LC/MS 및 MS/MS 분석, 유사한 LC 조건을 사용하여 표적 분석(LC/MRM 사용), 관심 있는 내인성 지질의 신원 및 용출 거동을 정확하게 식별^18,19.
   4. 일괄 분석의 유효성 검사에 대 한 다음 기준을 사용 하 여: 정량화의 정확도 ≤ ±20%; 회귀 계수 ≥0.97 (이상적으로 ≥0.99).
      참고: 생체 분석 방법 개발 및 유효성 검사에 대한 지침을 따르면 표적 분자의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 분석을 보장합니다.

결과

기술 된 프로토콜의 집합은 동물 모델의 선택, 샘플링 경로, 추출 및 프로파일링 방법과 같은 목표 특정 방식으로 상이한 수준에서 결합 될 수있다 (그림 1).

급성 간질 발작 상태의 시간 과정 동안 뇌와 주변의 지질 수준 변화를 결정하고 완두콩의 잠재적 인 항 간질 효과를 해명하기 위해¹³

토론

여기에 설명된 신경 지질도혈 및 전사 방법론은 뇌 및 말초 장기의 높고 낮은 공간 해상도에서 질병이나 건강한 발달을 조사하는 실행 가능한 의미입니다. 최적화된 플라즈마 샘플링 및 취급 절차로 인해 혈장 리피도믹 분석은 조직 리피도믹스 및 전사학을 위해 희생된 동일한 동물로부터 수행될 수 있으므로 조직 혈액 분자 상관관계 및 바이오마커 발견의 신뢰성을 향상시킬 수 있습니다. 3개의 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017	Microscopy
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Lipid Std
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth	FST	11016-17	Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern	FST	14130-17	Surgical Tools
T3000 Thermocycler	Biometra		Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2	Biomol	Cay19030-5	Lipid Std
Thromboxane B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Lipid Std
Tissue Lyser II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek	Sakura Finetek	4583	Microscopy
Toluidinblau	Roth	0300.2	Microscopy
Vapotherm	Barkey	4004734	Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	Solvent/LCMS