Nörolojik Hastalıklarda Lipidomik ve Transkriptomik

Özet

Bu makalede doku lipidomik ve transkriptomik için modüler bir protokol ve inflamasyon ve nöronal aktivitenin altında kalan lipitleri, membran lipitlerini, aşağı akış habercilerini ve lipid fonksiyonu altında bulunan mRNA kodlayıcı enzimleri/reseptörleri hedefleyen nörolojik hastalık fare modellerinde plazma lipidomikleri sunulmaktadır. Örnekleme, numune işleme, ekstraksiyon ve nicelik prosedürleri özetlenmiştir.

Özet

Lipitler, nörolojik hastalıklara elverişli beyin hakaretleri veya uyaranlar için birincil arayüz görevi görür ve hastalıkların başlangıcını ve ilerlemesini altı çizebilecek çeşitli sinyal veya ligand işlevine sahip lipitlerin sentezi için bir rezervuardır. Genellikle presemptomatik düzeyde değişen lipitler, ortaya çıkan bir ilaç hedefi ve biyobelirteç kaynağıdır. Birçok nörolojik hastalık, kısmen spesifik lipid sinyal sistemleri tarafından modüle edilen yaygın ayırt edici özellikler olarak nöroinflamatikasyon, nörodejenerasyon ve nöronal uyarılabilirlik sergiler. Çeşitli lipitlerin sentezinin birbirine bağımlılığı ve birbiriyle olan ilgisi, nörolojik bağlamların ortak yönlerini ve özgüllüklerini türetmek ve hastalığın başlangıç ve ilerlemesinin mekanistik yönlerinin çözülmesini hızlandırmak için çok yıllı, multienzim ve multireceptor bir analize neden olur. Lipid rollerinin farklı beyin bölgelerine abone olmak, nörolojik bir hastalıkla ilişkili lipid moleküler fenotip ve morfolojinin belirlenmesini ilerletir.

Burada sunulan, belirli bir nörolojik hastalık ve/veya durumla ilgili ayrı beyin bölgelerinden çıkarılan, işlevselliğinin altında bulunan enzimlerin ve mediatörlerin mRNA'sı ile birlikte membran lipitlerinin ve aşağı akış lipit sinyallerinin analizi için uygun modüler bir protokoldür. Doğru karşılaştırmalı lipidomik profilleme sağlamak için, iş akışları ve çalışma kriterleri aşağıdakiler için optimize edilmiş ve standartlaştırılmıştır: i) ilgi alanlarının beyin örneklemesi ve diseksiyonu, ii) birden fazla lipit sinyalinin ve membran lipitlerinin birlikte çıkarılması, iii) çift lipid/mRNA ekstraksiyonu, iv) sıvı kromatografisi çoklu reaksiyon izleme (LC/MRM) ve v) standart mRNA profilleme ile niceleme. Bu iş akışı, fonksiyonel olarak ayrı beyin alt bölgelerinin örneklemesi (yani beyin delme yoluyla) ile elde edilen düşük doku miktarları için elverişlidir, böylece doku heterojenliği ve/ veya hayvan değişkenliği nedeniyle multimoleküler analizde önyargıyı önler. Nörolojik hastalıkların periferik sonuçlarını ortaya çıkarmak ve nörolojik hastalık durumlarının çevirisel moleküler okumalarını oluşturmak, periferik organ örneklemesi, işleme ve bunların sonraki lipidomik analizlerinin yanı sıra plazma lipidomikleri de takip edilir ve açıklanır. Protokol akut epilepsi fare modelinde gösterilmiştir.

Giriş

Lipitlerin işlevindeki son gelişmeler ve nörolojik hastalıkların başlangıcında ve ilerlemesinde rolleri, yeni terapötik hedeflerin ve hastalık mekanizmasının yeni araştırma ve geliştirme mekanlarını ^{açmaktadır1}. Kitle spektrometresi görüntüleme ve gelişmiş kütle spektrometresi profilleme gibi modern moleküler görüntüleme teknikleri ile vurgulanan farklı beyin bölgelerindeki lipid bileşimindeki belgelenmiş farklılıklar, lipid araştırması paradigmasını tüm beyinden fonksiyonel olarak farklı ve ayrık beyin bölgelerine kaydırır. Lipid bileşiminin farklı beyin bölgelerinde farklılık göstermesi, fonksiyonel olarak farklı beyin bölgelerinde bir beyin hakaretine veya uyaranlarına yanıt olarak hem membran lipid duyarlılığının hem de aşağı akış lipid sinyalinin yeni kavramsallaştırılmasına neden olmaktadır. Bu nedenle, lipid protokolleri, daha yüksek uzamsal çözünürlük tespiti ve nicelleştirme için düşük doku miktarlarının zorluğunu ele almak için yeni gelişmeler ve eş zamanlı olarak hücre zarlarının ve sinyal yollarının birden fazla lipit bileşeninin analizini gerektirir. Ayrıca, seviyelerinin ve işlevlerinin düzenlenmesinde rol oynayan enzimlerin, lipid ligandlarının ve reseptörlerin belirlenmesi, nörolojik bir hastalıkta etkilenen sinyal yollarını aydınlatmak ve patofizyolojik bağlamda yeni mekanistik araştırmalara rehberlik etmek için çok önemlidir.

Artan beyin mekansal çözünürlüğüne ek olarak, yeni nörolipidomik yaklaşımların geliştirilmesine meydan okuyan iki büyük zorluk vardır. İlk olarak, lipid sinyal molekülleri tipik olarak membran constitutive lipits ile karşılaştırıldığında çok düşük bolluğa sahip. İkincisi, lipidom yüksek yapısal heterojenlik sergiler, tek bir analitik yaklaşım kullanarak incelenerek zor. Bu nedenle, ekstraksiyon ve analitik yöntemler farklı lipit kategorilerine göre uyarlanır ve genellikle farklı doku örneklerinde gerçekleştirilir.². Av tüfeği lipidomik yöntemleri³ membran lipitlerin geniş bir profilini hızla ortaya çıkarmak için mükemmel araçlardır, hedeflenen keşif ve nicelik kütle spektrometrik yöntemlerinin sağladığı artan duyarlılık ve seçicilik, aşağıdakiler de dahil olmak üzere düşük bol sinyal lipitlerinin araştırılması için sermayelendirilir: i) enflamatuar lipitler ve ii) endocannabinoidler (eBB'ler), amino asit bağlantılı lipitler gibi nöronal aktivitenin modülasyonunda yer alan lipitler, ve saire.^4,5. Nörolojik hastalık modellerinin beyin bölgelerinde meydana gelen hem hücre zarındaki hem de sinyalizasyon seviyesindeki lipit değişikliklerini kapsamak için, tipik olarak lipid ekstraksiyonu ve analizi, farklı hayvan partilerinden veya farklı yarımkürelerden elde edilen veya daha büyük bir doku bölgesini birden fazla parçaya ayırarak farklı doku örneklerinde gerçekleştirilir. Enzim reseptörlerinin mRNA seviyeleri de ilgi çekici olduğunda, incelemeleri tipik olarak farklı bir doku örneğinin tedarikini gerektirir. Örneğin, membran lipitleri, endojen kannabinoidler ve mRNA'nın araştırılması üç farklı doku örneği gerektirir (örneğin, iki lipid ekstraksiyon yöntemi için iki örnek-membran lipitleri ve sinyal lipitleri- ve sonraki iki lipid analiz yöntemi- ve mRNA analizi için bir örnek). İnflamatuvar lipitlerin ve endojen kannabinoidlerin araştırılması sırasıyla iki farklı doku örneği, ekstraksiyon yöntemleri ve analiz yöntemleri gerektirir. Başka bir örnek, mRNA'nın ve bir beyin yumruğu veya lazer mikrodiseksiyon örneğindeki herhangi bir lipit kategorisinin araştırılmasıdır, bu da sonuç olarak beyin (alt) bölgesi başına iki farklı hayvanın iki örnek temin etmesini gerektirir. Biyolojik değişkenlik ve/veya doku heterojenliğinden kaynaklanan bu gibi durumlarda sonuçların değişkenliğinin ve/veya zayıf tekrarlanabilirliğinin önemli ölçüde sıklıkla ortaya çıkar. Özellikle beyindeki yüksek uzamsal çözünürlükte meydana gelen bu pratik multimoleküler analiz sınırlamaları tarafından yönlendirilen üç modüllü bir nörolipidomik protokol, şunları kapsayacak şekilde tasarlanmıştır: 1) enflamatuar lipitlerin (örneğin, eikosanoidler (eiCs)) ve eB'ler gibi nöronal aktivitenin modülasyonunda rol oynayan lipitlerin LC/MRM tarafından birlikte çıkarılması ve birlikte analiz²; 2) fosfolipidlerin (PL'ler) ve eB'lerin sonraki multiscan LC /MRM ve öncül/nötr kayıp tarama analizi ile birlikte çıkarılması²; ve 3) membran (fosfo)lipitler ve eB'lerin yanı sıra mRNA'nın çift ekstraksiyonu, sonraki LC / MRM ve qPCR veya RNA dizileme analizi ile⁶. Nörolojik bir hastalıkta ele alınacak biyolojik soruya ve ilgi çekici beyin bölgesine bağlı olarak, birinci ve ikinci protokolün veya birinci ve üçüncü protokolün bir kombinasyonu, yaklaşık 4 mg ağırlığındaki dokular için aynı doku örneğine uygulanabilir. Birinci ve üçüncü protokoller 2 mg civarındaki dokular için bağımsız olarak uygulanabilir. İkinci protokol 0,5 mg kadar hafif dokular için uygulanabilir. Seçilen nörolipidomik protokol modülünden bağımsız olarak, doku örneklemesi ve ön analitik işleme, beyin izolasyonu ve bölge diseksiyonu ve hayvan modelinden ödün vermek için prosedür protokolün üç modülü için de standartlaştırılmış ve aynıdır. Nörolojik hastalıkları araştırmamızda, hastalığın patolojik sonuçlarıyla ilgili periferik organlar da her zaman bu modüler protokoller kullanılarak toplanır ve analiz edilir. Ek olarak, plazma lipidomik için düzenli olarak kan örneklenerek, prospektif çeviri uygulamalarına yönelik nörolojik hastalıkların okuma aracı olarak hizmet edilir. Burada sunulan modüler lipidomik protokolü çok yönlüdür: daha büyük doku miktarlarına ölçeklendirilebilir ve hemen hemen her doku tipi ve hastalığı için kolayca uygulanabilir. Modüler protokolün uygulanması için (Şekil 1) nörolojik hastalıklarda, travmatik beyin hasarı, Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı veya epilepsi gibi nörolojik bozuklukların standartlaştırılmış kemirgen başlangıç ve ilerleme modeli uygundur.

Bu protokoller^{, insan} temporal lob epilepsisine (TLE)^8,9,10,11 benzerliği nedeniyle klinik öncesi çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir model ^{olan epilepsinin} kainik asit (KA) kaynaklı fare modelinde epilepsinin akut fazında doku lipidomu ve/veya transkriptom değişiklikleri üzerinde çalışmak için kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. Bu protokoller kullanılarak, Palmitoylethanolamide (PEA)^12,13 gibi ilaçların terapötik potansiyeli aynı epilepsi fare modelinde değerlendirildi. Çalışmada, beyin ve periferde yüksek ve düşük mekansal çözünürlükte, maksimal akut nöbet yoğunluklarının zaman noktasında (60 dk posteizür indüksiyonunda) ve PEA ile subkronik ve akut tedavide dört farklı zaman noktasında (20, 60, 120 ve 180 dk) lipid ve mRNA değişiklikleri belirlendi. Tedavi edilmemiş KA enjekte edilmiş farelerin plazma, beyin ve periferik organları, akut ve subkronik olarak BEZELYE ile tedavi edilen farelerin yanı sıra araç ve BEZELYE aracı kontrol fareleri her zaman ^12,13 noktasında toplanmış ve bu moleküler analiz ile araştırılmıştır. Moleküler veriler, akut epilepsi evresinin ilerlemesini ve PEA'nın hafifletme potansiyelini çözmek için nöbet skorlamasıyla elde edilen davranışsal fenotiplerin yanı sıra nörodejeneratif süreçler hakkında immünhistokinetri türetilmiş verilerle ilişkiliydi.

Protokol

Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler, Avrupa Topluluğu Konseyi'nin 22 Eylül 2010 (2010/63EU) direktifine uygundur ve Almanya'nın Rheinland-Palatinate eyaletinin yerel hayvan komitesi tarafından onaylanmıştır (dosya referansı: 23 177-07/G16-1-075).

1. Akut ve profilaktik olarak tedavi edilen KA kaynaklı epilepsinin hayvan modeli

1. Nöbet indüksiyonu, tedavisi ve davranışsal puanlama gerçekleştirin.
   1. Fareleri (grup başına minimum n = 6 fare) tek kafeslerde ayırır.
   2. Nöbet-indüksiyon enjeksiyon çözeltisini ve ilgili aracı hazırlayın (bkz. Tablo 1), ayrıca tedavi enjeksiyon çözeltisi ve ilgili araç (bkz. Tablo 2).
   3. Farelere grup kimliklerine göre anestezi olmadan intraperitoneal (yani) (10 mL/kg fare vücut kütlesi) enjekte edin: hastalık, tedavi veya tedavi edilen araç (örneğin, KA, BEZELYE ile tedavi edilen KA ve iki araç grubu). Bkz. Şekil 2, Tablo 1 ve Tablo 2.
   4. Davranışı aşağıdaki standart nöbet yoğunluğu ölçeğine göre izleyin ve puanlandırın: 0 = yanıt yok; 1 = hareketsizlik ve bakış; 2 = ön ayak ve/veya kuyruk uzatma, sert duruş; 3 = tekrarlayan hareketler, kafa sallama; 4 = yetiştirme ve düşme; 5 = sürekli yetiştirme ve düşme; 6 = şiddetli klonik tonik nöbetler; 7 = ^ölüm14,15 (Şekil 3).
2. Lipidomik ve transkriptomik analiz için fedakârlık prosedürü uygulayın.
   1. Dört zaman noktasında (örneğin, sırasıyla 20, 60, 120 ve 180 dk ka veya araç enjeksiyonu sonrası), aşağıdaki grupların her birinden altı fare kurban edin: PEA tedavi edilen, BEZELYE tedavisi görmeyen epileptik araç 1 ve araç 2, IACUC onaylı protokolleri izleyerek.
   2. Her zaman noktasına ulaşıldıktan on saniye sonra, fareleri bir cam bölmede izoflurane batırılmış bir doku kullanarak uyuşturun. Cam hazneyi yavaşça devirirken hareket edememe ile belirtilen sağ refleksin kaybı ile anesteziyi onaylayın. Cerrahi makas kullanarak farelerin kafasını kopar ve plazma, beyin ve periferik organları toplayın (bkz. adımlar 2.2.2−2.2.4).
      DİkKAT: İşlemlerden ödün vermek için etik düzenlemeler yerel hayvan komiteleri arasında farklılık gösterir. Yerel hayvan komitesi tarafından yayınlanan yönetmelikleri kontrol ettiği ve takip ettiğinden emin olun.
3. İmmünohistokmetri analizi için fedakârlık prosedürünü izleyin.
   1. İmmünohistokimyasal ^boyama13 için, davranışsal olarak aşağıdaki grupların her birinden üç fare puan: BEZELYE tedavisi, BEZELYE tedavi edilmemiş epilepsi ve araç grupları, tüm zaman kursu boyunca (180 dk).
   2. 5 gün sonra fareleri kurban edin ve perfuse edin. Fareleri derinlemesine uyuşturun (fare grupları için 1.3.1 adımına bakın) i.p. pentobarbital (100 mg/kg) ve buprenorfin (0.1 mg/kg) enjekte ederim. Derin anesteziyi, tonlar arasındaki refleks kaybı ile onaylayın.
   3. Fareyi bir polistiren plakaya sabitlayın ve ince makas ve standart tostiki kullanarak toraksı hemen açın. Kelebeği sol kalp ventrikülüne ayarlayın ve ince makas kullanarak sağ kulakçık kesin.
   4. Pompanın hızını ve basıncını 2−3 mL/dk hız ile sabit bir peristaltik akışa ayarlayın. ~5 dakika boyunca buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfuse. Gerekirse kelebeği değiştirin.
      NOT: Uygun perfüzyon ile iç organlar (dalak hariç) 1−2 dakika içinde beyazlatmaya başlar.
   5. Perfüzyonu ~5 dakika boyunca buz gibi %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisine geçirin. 2.2.2 adımında açıklandığı gibi tüm beyinleri izole edin ve 4 °C'de% 4 PFA çözeltisinde 24 saat boyunca sabitlenin.
   6. Beyinleri 4 °C'de 48 saat boyunca% 30 sakkaroz çözeltisinde kuluçkaya yatırın. Kalan sakkarotu kuru bir kağıt mendille çıkarın ve beyinleri metal bir plakada (-80 °C) dondurun. Boyama işlemleri için beyinleri -80 °C'de ^saklayın13.

2. Lipidomik/transkriptomik analiz için örnekleme prosedürleri

1. Örneklemeye hazırlanın.
   1. 4 °C'ye plazma örneklemesi için ön soğutma EDTA tüpleri. Santrifüj ve girdap aparatını 4 °C'ye çıkarın. Alüminyum folyo ile kaplı metal plakayı (donmuş beyni ve/veya diğer ilgi dokularını tutturmak için) kuru buzun üzerinde (-80 °C) ön soğutma. Plazma aliquots, dondurulmuş doku ve beyin toplama için kuru buz (-80 °C) üzerinde etiketli 2 mL ve 5 mL tüpleri ön soğutma. EIC'ler gibi ışığa duyarlı molekülleri korumak için kehribar tüpler kullanın.
   2. Doku örnekleme ve izolasyon ekipmanlarını (cerrahi makas, düz keskin ince makas, düz pürüzsüz standart forseps, ayna kaplamalı ince forseps, kavisli forseps ve spatula, polistiren köpük plaka ve sabitleme için iğneler) bir dezenfektanla (örn. %70 etanol) temizleyin.
2. Örnekleme protokolleri
   1. Örnekleme sırasını belirleyin.
      1. Önceden pişirilmiş 1 mL EDTA tüplerinde kafa kesmeden hemen sonra kan toplayın (bkz. adım 2.2.3).
      2. Tüm beyni çıkarın ve çıkarıldıktan hemen sonra dondurun. Bu adım 1−2 dakika sürecektir. Daha fazla işlem için donmuş beyinleri -80 °C'de saklayın (bkz. adım 2.2.2).
      3. Beyin çıkarılmasından 5 dakika sonra ilgilendirici çevre organlarını (örneğin akciğer, kalp, karaciğer) çıkarın ve daha fazla işlem için -80 °C'de dondurup saklayın (bkz. adım 2.2.4).
   2. Diseksiyon veya delme işlemleri için beyni çıkarın. Bu işlem 1−2 dk/beyin sürer.
      1. Kafa kesmeden sonra (bkz. adım 1.2), ince makas kullanarak ciltte bir orta çizgi kesisi yapmaya başlayın. Deriyi gözlerin üzerine çevirerek kafatasını serbest bir şekilde serbest bırakmaya devam edin. Kafatasının tepesine ulaşın ve intraparietal kemik seviyesinden başlayarak küçük bir kaudal kesi yapın. Beyni kesmekten kaçının.
      2. Beyin çıkarma işlemini kolaylaştırmak için kafatasının en ön kısmını gözlerin arasında sıkıca kesin. Kavisli dar desenli mansiyonlar kullanarak parietal kemiğin bir tarafını eğin ve ayrılın. Diğer taraf için son adımı tekrarlayın.
      3. Beyin menenjitlerini çıkarın. Beynin ön kısmının (yani koku ampulü) altına bir spatula kaydırın ve beyni hafifçe yukarı doğru eğin. Optik ve diğer kraniyal sinirleri kırmak için spatulayı daha aşağı kaydırın.
      4. Beyni kafatasından kaldırın ve tüm beyni hemen önceden soğmuş (-80 °C) metal bir plaka üzerinde dondurun ve ventral tarafı metal plakaya bakacak şekilde (sırt yukarı).
      5. Beyin bölgelerinin diseksiyonuna veya delme prosedürüne kadar beyinlerin tamamen donmasına ve önceden soğulmuş 5 mL tüplere aktarılmasına izin verin ve -80 °C'de saklayın (bkz. adımlar 3.1. ve 3.2).
   3. Plazma örneklemesi gerçekleştirin.
      1. Spike, 10 μL taze hazırlanmış indometasin seyreltme ile EDTA tüplerini 10 μM hedef konsantrasyonuna önceden havalandırdı.
      2. Vücudun önceden soğumuş EDTA tüplerine maksimum 1 mL kan hacmine hafifçe sıkarak kafasının kesilmesinden hemen sonra gövde kanını toplayın.
         NOT: Uygun tansiyon durumunda sıkma gerekmez. Kan hacmi 1 mL'den azsa, uygun kan akışını sağlamak için izofluran inkübasyon süresini azaltın.
      3. Hemen 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da kan tüplerini santrifüj edin.
      4. Elde edilen üst plazma fazını çıkarın ve çok yıllı analiz amacıyla aliquot önceden soğmuş 2 mL tüplerdeki plazma hacimlerini aşağıdaki gibi tanımladı: eBC/eiCs analizi için 50 μL, PC analizi için 30 μL ve kalan plazma hacmi yedek örnek olarak veya diğer analiz türleri için.
      5. Plazma örneklerini daha fazla ekstraksiyon için -80 °C'de saklayın (bkz. adımlar 4.1.2 ve 4.1.4).
   4. Periferik organ örneklemesi gerçekleştirin.
      NOT: Tek tek organları, bağ dokularını ve/veya kan damarlarını tanımlamak için hayvan araştırmacılarının katıldığı zorunlu kurslar (FELASA) için sağlanan fare anatomisi ^{referanslarını16} ve belgeleri kullanın.
      1. İğneler kullanarak organ çıkarma işlemini kolaylaştırmak için fare gövdesini hareketsiz hale getir. Pubisun yüksekliğinde düz keskin bir makas kullanarak ventral bir orta hat kesisi yapın. Karın boşluğunu açmak için keserken karın duvarını sabitlemek için künt standart tokmaklar kullanın.
      2. Künt tokmaklar kullanarak karın organının çıkarılmasına izin vermek için cildi hareketsiz hale getirmek. Kalp veya akciğer çıkarılması için meme mağarası yönünde medial kesime devam edin. İnce kümesler kullanarak akciğeri ve/veya kalbi çıkarın.
      3. Kanamayı önlemek için meme boşluğunu dikkatlice açın. Organı kesmeden ilgili organı tutturarak bağ dokularını ve kan damarlarını kesin.
      4. Doku parçalarını hemen önceden havalanmış metal plakalara (-80 °C) aktarın ve tamamen donmaya bırakın. Doku parçalarını önceden havalandırılmış tüplere aktarın ve daha fazla işlem için -80 °C'de saklayın (bkz. adım 4.1).

3. Biyolojik malzeme işleme

NOT: EBC/eiC'lerin ortak ekstraksiyonu için ekstraksiyon tüpleri olarak 2 mL kehribar tüp kullanın ve her tüpe yedi ön soğutmalı çelik top ekleyin. PL/eB'lerin ortak ekstraksiyonu ve çift lipid ve RNA ko-ekstraksiyonu için, seramik boncuklarla çivilenmiş 2 mL RNA içermeyen ekstraksiyon tüpleri kullanın (Malzeme Masası).

1. Beyin diseksiyonu ve periferik organ işleme gerçekleştirin.
   NOT: Diseksiyon için beynin görünürlüğünü artırmak için büyüteç lambaları kullanın.
   1. Süper ince uçlu tokslar da dahil olmak üzere cerrahi aletleri% 70 etanol ile 2x temizleyin.
   2. Donmuş beyinleri -80 °C'den önceden soğumuş fizyolojik tampon içeren bir Petri kabına aktarın (pH 5.5) Petri kabının 4 °C'de olduğundan emin olun. Beyinlerin diseksiyona izin vermek için tamamen çözülmesine izin verin. Eleps kullanarak dikkatlice test edin.
      DİkKAT: Beyinleri çözülme için gerekenden 4 °C'de tutmayın.
   3. Buz üzerinde bir metal plakayı (4 °C) öncool ve buz gibi fizyolojik tampona (pH 5.5) batırılmış ıslak dokularla örtün ve ventral tarafı olan beyni dikkatlice buz üzerinde önceden soğmuş (4 °C) metal bir plakaya aktarın. Buz gibi fizyolojik tampona batırılmış ıslak dokularla örtün (pH 5.5).
   4. Süper ince uçlu uzun uçlu tipler kullanarak beyin bölgelerini maksimum 5 dakika içinde parçalara çıkarın. Hipotalamus (HYP) ile başlayın ve sağ tarafa devam etmek için sırt tarafını yukarı çevirin. Hipokampus (HCr), prefrontal korteks (PFCr), striatum (STRr) ve serebral korteksi (cCTXr) izole edin. Sonra sol tarafı parçalara ayrılın. Hipokampus (HCl), prefrontal korteks (PFCl), striatum (STRl) ve serebral korteksi (cCTXl) izole edin. Beyincik ve talamik bölgeyi parçalara ayrıştırın. Beyin bölgesi tanımlaması için yayınlanmış anatomik ^{referansları16,17} kullanın.
   5. Parçalanmış her parçayı doğrudan alüminyum folyo kaplı, önceden solumuş metal plakaya (-80 °C) aktarın. Etiketli önceden solumuş 2 mL tüplerde izole edilmiş beyin bölgelerinin dondurulmasına ve aktarılmasına izin verin.
   6. Doku parçalarını bir doku pulverizörü (-80 °C'de) kullanarak pulverize edin ve dokunun çözülmesini önleyin. Soğuk odada, seramik boncuklar veya çelik toplar içeren etiketli, önceden soğmuş ekstraksiyon tüplerinde aliquot doku tozu. Çift lipidomik/transkriptomik analiz için soğuk odadaki doku tozu aliquotlarını tartın. Sadece lipidomik analiz için doku ağırlığına veya protein içeriğine normalleşme arasında seçim yapın. İkincisi için, doku tartımı yapmadan daha fazla ilerleyin.
   7. Periferik organ dokularını maksimum 20 mg ağırlığında parçalar halinde kesin. Adım 3.1.6'da olduğu gibi doku toz haline getirme işlemine devam edin.
   8. Doku örneklerinin çıkarılmasına devam edin (bkz. adımlar 4.1.1, 4.1.3 veya 4.1.5) veya tüpleri daha sonra ekstraksiyon için -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Çalışma tasarımı izin verirse beyin matrisi de kullanılabilir. Bununla birlikte, yöntem ayrık ve sınırlı sayıda beyin bölgesi için daha uygundur ve yukarıda belirtilen tüm beyin bölgelerini belirlenen zaman dilimi içinde parçalamak ve izole etmek pratik değildir.
2. Beyin delme işlemi gerçekleştirin.
   1. Donmuş beyinlerin tamamını kriyostattaki montaj sistemine (Malzeme Masası) monte edin. Kalınlığı 50 μm olarak ayarlayın ve ilgilendiğiniz bölgeye yakın kırpma modunda dilimleyin.
   2. İlginin alt kısmını yerelleştirmek için toluidin mavisi (%0,1−1) kullanarak beyin dilimini (18−20 μm) lekeleyin. Delilecek ilgi çekici bölgeleri belirlemek için mikroskop kullanarak lekeli dilimleri inceleyin. Uygun beyin anatomik bölgelerini bulmak için referans olarak fare atlası ^kullanın16. Önceden soğutmalı tüplerdeki numune korselerini kullanarak 0,8−1,0 mm çapında yumruklar alın.
   3. Donmuş zımbaları soğuk odada seramik boncuklar veya çelik toplar içeren etiketli, önceden soğmuş 2 mL ekstraksiyon tüplerinde tartın. EBC'ler ve eiCs ortak ekstraksiyonu için kehribar tüpler kullanın.
   4. Ekstraksiyonu başlatın (bkz. adımlar 4.1.1, 4.1.3 veya 4.1.5) veya daha fazla ekstraksiyon için tüpleri -80 °C'de saklayın.
3. Plazma işlemeyi gerçekleştirin.
   1. Donmuş plazma örneklerini buza (4 °C) yerleştirin ve çözülmesine izin verin (~20 dk).
   2. Ekstraksiyona başlamadan önce plazmanın tamamen çözdök olduğundan emin olun.
   3. Plazma çıkarma prosedürüne devam edin (bkz. adımlar 4.1.2 veya 4.1.4).
      NOT: Plazma örnekleri ekstraksiyona kadar -80 °C'de kalmalıdır. Çözülme ve yeniden donma döngülerinden kaçının.

4. Ekstraksiyon prosedürleri

1. Sıvı-Sıvı (LLE) lipid ko-ekstraksiyon protokollerini gerçekleştirin.
   1. Beyin parçalarından, yumruklardan veya doku tozu örneklerinden EBC'lerin ve eiC'lerin birlikte çıkarılmasını gerçekleştirin.
      NOT: Prosedür boyunca doğru pipetleme gereklidir.
      1. Doku örneklerini ve yedi çelik topu içeren ekstraksiyon tüplerini buza (4 °C) yerleştirin. İç standartları içeren 600 μL buz gibi MTBE ve 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) ekleyin. Analiz için son hacimdeki iç standartların hedef konsantrasyonu (50 μL) aşağıdaki gibidir: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 ve PGD2-d4 için 5 ng/mL; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; Sırasıyla 20-HETE-d6 ve TXB2-d4.
      2. 400 μL 0,1 M formik asit ekleyin ve bir doku lyser (30 s-1 dk) ile homojenize edin. Homojenatı 4 °C'de 5.000 x g'da 15 dakika santrifüj edin. Üst organik fazın transferini kolaylaştırmak için sulu alt fazın -80 °C'de 10 dakika donmasına izin verin.
      3. Organik fazı yeni tüplere aktarın. 37 °C'de nazik bir _N2 akışı altında buharlaşın ve daha fazla analiz için 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) olarak yeniden inşa edin.
      4. Daha fazla protein içeriği analizi için sulu fazı -20 °C veya -80 °C'de saklayın.
   2. Plazma örneklerinden eBC'lerin ve eiC'lerin birlikte çıkarılmasını gerçekleştirin.
      1. Plazma aliquotlarını 4 °C'de çözün. İç standartları içeren 800 μL MTBE ve 50 μL ACN/_H2O (1:1; v/v) ekleyin (doku analizi için kullanılanlara benzer şekilde, bkz. adım 5.1.1). Referans plazma örneklerini kullanarak spiking için dahili standart konsantrasyonu optimize edin.
      2. 2 dakika boyunca 4 °C'de 600 μL 0,1 M formik asit ve girdap örnekleri ekleyin. 4 °C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüj örnekleri.
      3. Organik fazı yeni tüplere aktarın, 37 °C'de hafif bir _N2 akışı altında buharlaşın ve LC/MRM analizi için 50 μL ACN/_H2O 'da (1:1; v/v) yeniden inşa edin.
         NOT: Mümkünse, kurutulmuş eiC özlerinin depolanmasını önleyin ve hemen LC/MRM analizine geçin. Depolama önlenemiyorsa, LC enjeksiyon çözücüslü numunelerle 4° C'de sadece 2−3 gün kısa süreli depolamaya başvurun.
   3. PL'lerin ve EB'lerin beyin bölgelerinden, yumruklardan veya diğer doku tozu örneklerinden birlikte çıkarılmasını gerçekleştirin.
      1. Doku örneklerini ve seramik boncukları içeren ekstraksiyon tüplerini buza (4 °C) yerleştirin. İç standartları içeren 800 μL MTBE/MeOH (10:3; v/v) ve 10 μL MeOH ekleyin. Analiz için son hacimde iç standartların hedef konsantrasyonu (100 μL) aşağıdaki gibidir: PC için 150 ng/mL 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; Pİ 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: Sırasıyla 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 ve 3 ng/mL PEA- d4.
      2. 25 μM tetrahidrolipstatin/URB597 ve 50 μg/mL BHT içeren 200 μL% 0.1 formik asit ekleyin. Doku homojenizatör (Malzeme Masası) ve santrifüj ile 5.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika homojenizon.
      3. Yeni tüplerde üst organik fazı kurtarın ve 37 °C'de hafif bir _N2 akışı altında buharlaşın. 90 μL MeOH'da yeniden inşa edin ve -20 °C veya -80 °C'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin.
      4. Lipid ekstresinin bir aliquot'una (4.1.3.3) % 10 _H2O ekleyin ve PLs analizi için LC / MS'ye 10 μL enjekte edin. Daha fazla eCB analizi için adım 4.3.5 ile devam edin.
      5. Özün bir aliquot alın (4.1.3.3), kuruluğa buharlaşmak ve ACN / _H2O (1:1; v / v) yeniden inşa etmek. eCB analizi için LC/MS enjeksiyonu için 20 μL kullanın.
   4. Plazma örneklerinden PL'lerin ve eB'lerin birlikte çıkarılmasını gerçekleştirin.
      1. Plazma aliquotlarını 4 °C'de çözün, iç standartlar (adım 4.1.3'e benzer) ve 1 dakika boyunca 4 °C'de girdap içeren 1.000 μL MTBE/ metanol (10:3; v / v) ve 10 μL MeOH ekleyin.
      2. 4 °C'de 45 dakika boyunca 250 μL _H2O ve girdap ekleyin. 5.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj örnekleri. Üst organik fazı kurtarın, 37 °C'de nazik bir _N2 akışı altında buharlaşın ve daha fazla LC / MS analizi için 90 μL metanolde yeniden inşa edin. -20 °C veya -80 °C'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin.
      3. PL analizi için, lipid ekstresinin bir aliquot'una % 10 su ekleyin (4.1.2.2).
      4. ECB analizi için, lipit ekstresinin bir aliquot'una% 10 su ekleyin (bkz. 4.1.4.3), kuruluğa buharlaşır ve% 50 ACN / _H2O'da (1:1; v / v) yeniden inşa edin.
   5. Doku örneklerinden RNA ve lipitlerin (PL'lerin ve eB'lerin birlikte çıkarılması) çift ekstraksiyonu gerçekleştirin.
      DİkKAT: RNA bozulmasını önlemek için RNA içermeyen koşullar altında çalışmayı sağlayın.
      1. Doku tozu aliquots veya beyin demetlerini (4 °C'de) çözün ve 5 μM THL/ URB597 içeren 600 μL RLT tamponu ekleyin, 10 μg/mL BHT ve %1 β-mercaptoethanol (homojenizasyon tamponunun son hacminin yüzdeleri için, bkz. adım 4.1) ile birlikte donmuş beyin yumrukları ve seramik boncuklar içeren ekstraksiyon tüplerine 200 μL kloroform.
      2. PL'ler ve eCB ortak ekstraksiyonu için 10 μL iç standart karışımlı çivi örnekleri (bkz. adım 4.1.3) ve doku homojenizatör (yüksek hız, 20 s) ile homojenize edin.
      3. Faz ayrımını sağlamak için lysates'i tam hızda 5 dakika ve 4 °C'de yeni santrifüj tüplerine ve santrifüje aktarın.
      4. Standart RNA ekstraksiyon prosedür kitlerini (Malzeme Tablosu) kullanarak RNA ekstraksiyonu için üst fazı kurtarın ve kullanın. Toplam 50 μL RNase içermeyen su hacminde Elute RNA ve -80 °C'de depolayın.
         NOT: Adım 4.1.5.4'teki örnek, uygun yöntemleri ve araçları kullanarak hem RNA dizilimi hem de qPCR için uygundur.
      5. Lipid ekstraksiyonu için alt kloroform içeren fazı kullanın. 4 °C'de 45 dakika boyunca 800 μL MTBE/metanol (10:3; v/v) ve %0,1 formik asit ve girdap 200 μL ekleyin. Üst organik fazı kurtarın ve 37 °C'de hafif bir _N2 akışı altında buharlaşın.
      6. Daha fazla LC/MS analizi için 90 μL metanolde yeniden inşa edin. -20 °C veya -80 °C'de saklayın veya 5.
      7. Lipid ekstresinin bir aliquot'una %10 _H2O ekleyin (yukarıdaki adım 4.1.5.6'ya bakın) ve PL analizi için LC/MS'ye 10 μL enjekte edin. Daha fazla eCB analizi için adım 5.7 ile devam edin.
      8. Özün bir aliquot alın (yukarıdaki adım 4.1.5.6 bakın) kuruluğa buharlaşmak ve ACN / _H2O (1:1; v / v) yeniden inşa etmek. eCB analizi için LC/MS enjeksiyonu için 20 μL kullanın (adım 4.3.5'e benzer).

5. LC/MRM nitel ve nicel profil oluşturma

1. LC çözücü sistemleri, kalibrasyon çözümleri ve kalite kontrol numuneleri hazırlayın.
   1. PL'ler için, 7,5 mM amonyum format ve% 0,1 TEA içeren mobil faz A: metanol / su (1:1; v / v) hazırlayın. Mobil faz B'yi hazırlayın: 7,5 mM amonyum formatlı ve %0,1 TEA içeren metanol/izopropanol (2:8; v/v). Çözücüleri LC şişelerinde saklayın.
   2. eCB ve eiC ayrımı için aşağıdaki LC çözücüleri hazırlayın: mobil faz A olarak %0,1 formik asit ve mobil faz B olarak %0,1 formik asit içeren %100 ACN. Çözücüleri LC şişelerinde saklayın.
   3. Kalibrasyon standartlarını ve iç standartları (Tablo 3) eşkenel veya kullanıcı tanımlı bir konsantrasyonda kullanarak kalite kontrolleri hazırlayın.
   4. Yedi konsantrasyon noktası ile kalibrasyon eğrileri hazırlayın. Kalibrasyon eğrisi çözümünde ve analiz edilecek numunelerde yükselmek için aynı dahili standart partiyi kullanın.
2. Nitel ve nicel lipit profilleme için LC-MRM yöntemini kullanın.
   1. Ticari yazılımda (örneğin Analist) Yapı Edinme Yöntemi sekmesini açın ve polarite geçişi ile LC/MRM modunu seçin. Nicel profil oluşturma için iyon geçişlerini ( Tablo 3'te verildiği gibi) yöntemde ayarlayın. Yerleşme süresini 50 ms olarak ayarlayın.
   2. DLL profil oluşturma için aşağıdaki iyon kaynağı parametrelerini ayarlayın: perde gazı = 40 psi; kaynak ısıtıcı sıcaklığı = 550 °C; iyon sprey gerilimi = negatif iyon modunda -4.500 V ve pozitif iyon modunda +5.200 V.
   3. EBC'lerin ve eiC'lerin birlikte analizi için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: perde gazı = 40 psi; kaynak ısıtıcı sıcaklığı = 550 °C; iyon sprey gerilimi = negatif iyon modunda -4.500 V ve pozitif iyon modunda +4.500 V.
   4. PL analizi için, kolon ısıtmasını 45 °C'ye ve akış hızını 200 μL/ dak'a ayarlayın ve aşağıdaki degradeyi ayarlayın: min 0 = % 40 B; dk 3 = %40 B; dk 42 = %90 B; dk 43 = %99 B; min 50 = %99 B ve min 52 = %40 B. Enjeksiyon hacmini 10 μL olarak ayarlayın.
   5. EBC'ler ve eiCs analizi için, kolon sıcaklığını oda sıcaklığında ayarlayın ve aşağıdaki degradeyi ayarlayın: min 0 = % 20 B; min 1 = %20 B; dk 5 = %50 B, dk 12 = %50 B; dk 13 = %90 B, dk 17 = %90 B; dk 17.5 = %20 B; min 20 = %20 B. Enjeksiyon hacmini 20 μL olarak ayarlayın.
      NOT: MRM koşulları enstrümantal platformlar arasında değişebilir, bu nedenle parçalanma ve MRM koşulları deneysel olarak çıkarılmalı ve maksimum hassasiyet ve seçicilik elde etmek için gerekirse iyonizasyon parametreleri test edilmeli ve ayarlanmalıdır.
3. Toplu iş analizi gerçekleştirin.
   1. Yapı Edinme toplu işlemini açın ve örnek açıklama, otomatik örnekleyicinin örnek rafındaki konum ve alma yöntemi (adım 5.2 olarak ayarlanır) için gerekli parametreleri doldurun.
   2. Her zaman analiz başında ve sonunda ve toplu iş içinde kalite kontrollerini ekleyin. Her 25−30 numuneden sonra, parti içine en az üç kalibrasyon eğrisi ekleyin ve her kalite kontrol örneğinden, kalibrasyon eğrisinin ve numune toplu işleminin sonundan sonra tercih edilen bir çözücüye sahip bir yıkama adımı ekleyin.
   3. LC/MS şişelerinde 4. Numuneleri toplu işte tanımlanan konuma göre LC otomatik örnekleyicinin yükleme raflarına yerleştirin ve numune rafını LC otomatik örnekleyiciye yükleyin.
   4. Toplu iş gönderin ve sıra çözümlemesi başlatın.
4. Lipid nicelemesi
   1. EBC'ler ve EIC nicelleştirme için ticari yazılımı (örneğin Analist) ve gömülü nicelik modüllerini ve PL niceliği için ticari yazılımı (örneğin, Çok Nitelikli) kullanın.
      NOT: İkinci yazılım, özellikle birden fazla analitenin niceliği için bir iç standart kullanıldığında, eBC'ler ve eiC'ler için de kullanılabilir.
   2. Yapı Niceleme Yöntemi'ni açın ve analizler, iç standartlar, MRM geçişleri için parametreleri doldurun ve iç standartları ölçülecek analizlere atfedin (Tablo 3). Minimum tepe yüksekliğini 500 cps olarak ayarlayın.
   3. Lipid kimlik ataması ve sonraki niceleme için aşağıdaki kriterleri veya kombinasyonunu ^kullanın6: lipid endojen analizlerin kalibrasyon standartlarıyla ve/veya mevcut olduğunda kısırlaştırılmış iç standartlarla saklanma süresi; hiçbir standart sağlanmayan lipid analitlerinin belirli bir m/z'si için pozitif ve negatif iyon modu parçalanması ile eşleşen parça iyon; izorik ve/veya izobarik yapıları parçalamak için benzer şekilde kullanılan LC koşulları altında lipitlerin literatür kaynaklı elüasyon davranışı; ve mevcut olduğunda, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile LC/MS ve MS/MS analizi, hedeflenen analize benzer LC koşulları kullanılarak (LC/MRM kullanılarak), ilgi çekici endojen lipitlerin kimliğini ve elüasyon davranışını doğru bir şekilde belirlemek ^için18,19.
   4. Toplu iş analizinin doğrulanması için aşağıdaki kriterleri kullanın: nicelik doğruluğu ≤ ±20%; regresyon katsayısı ≥0,97 (ideal olarak ≥0,99).
      NOT: Hedef moleküllerin güvenilir ve tekrarlanabilir bir analizini sağlamak için biyoanalitik yöntem geliştirme ve doğrulama yönergelerini izleyin.

Sonuçlar

Açıklanan protokoller kümesi, hayvan modeli seçimi, örnekleme rotası, ekstraksiyon yöntemi ve profil oluşturma gibi amace özgü bir şekilde farklı düzeylerde birleştirilebilir (Şekil 1).

Akut epileptik nöbet durumu boyunca beyin ve periferde lipid düzeyi değişikliklerini belirlemek ve PEA'nın ^potansiyel antiepileptik etkisini ve beyin ve periferdeki lipidom...

Tartışmalar

Burada açıklanan nörolipidomik ve transkriptomik metodoloji, beyin ve periferik organlarda yüksek ve düşük mekansal çözünürlükte herhangi bir hastalığı veya sağlıklı gelişimi araştırmak için uygun bir ortalamadır. Optimize edilmiş plazma örnekleme ve elleçleme prosedürleri nedeniyle, doku lipidomik ve transkriptomik için kurban edilen aynı hayvanlardan plazma lipidomik analizi de yapılabilir, böylece doku kanı moleküler korelasyonlarının ve biyobelirteç keşfinin güvenilirliği artır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017	Microscopy
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Lipid Std
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth	FST	11016-17	Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern	FST	14130-17	Surgical Tools
T3000 Thermocycler	Biometra		Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2	Biomol	Cay19030-5	Lipid Std
Thromboxane B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Lipid Std
Tissue Lyser II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek	Sakura Finetek	4583	Microscopy
Toluidinblau	Roth	0300.2	Microscopy
Vapotherm	Barkey	4004734	Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	Solvent/LCMS