Lipidomique et transcriptomique dans les maladies neurologiques

Résumé

Cet article présente un protocole modulaire pour la lipidomique tissulaire et la transcriptomique, et la lipidomique plasmatique dans des modèles murins de maladies neurologiques ciblant les lipides sous-jacents à l’inflammation et à l’activité neuronale, les lipides membranaires, les messagers en aval et les enzymes/récepteurs codant pour l’ARNm sous-jacents à la fonction lipidique. Les procédures d’échantillonnage, de traitement des échantillons, d’extraction et de quantification sont décrites.

Résumé

Les lipides servent d’interface principale aux insultes cérébrales ou aux stimuli propices aux maladies neurologiques et sont un réservoir pour la synthèse des lipides avec diverses fonctions de signalisation ou de ligand qui peuvent souligner l’apparition et la progression des maladies. Changeant souvent au niveau présymptomatique, les lipides sont une source émergente de cibles médicamenteuses et de biomarqueurs. De nombreuses maladies neurologiques présentent la neuroinflammation, la neurodégénérescence et l’excitabilité neuronale comme caractéristiques communes, partiellement modulées par des systèmes de signalisation lipidique spécifiques. L’interdépendance et l’interrelation de la synthèse de divers lipides incitent à une analyse multilipide, multienzymatique et multiréceptrice afin d’en déduire les points communs et les spécificités des contextes neurologiques et d’accélérer le démêlage des aspects mécanistes de l’apparition et de la progression de la maladie. L’attribution de rôles lipidiques à des régions cérébrales distinctes fait progresser la détermination du phénotype moléculaire lipidique et de la morphologie associée à une maladie neurologique.

Présenté ici est un protocole modulaire adapté à l’analyse des lipides membranaires et des signaux lipidiques en aval ainsi que de l’ARNm des enzymes et des médiateurs sous-jacents à leur fonctionnalité, extraits de régions cérébrales discrètes pertinentes pour une maladie et/ou une affection neurologique particulière. Pour assurer un profilage lipidomique comparatif précis, les flux de travail et les critères d’exploitation ont été optimisés et normalisés pour : i) l’échantillonnage cérébral et la dissection des régions d’intérêt, ii) la co-extraction de multiples signaux lipidiques et lipides membranaires, iii) l’extraction double lipide/ARNm, iv) la quantification par chromatographie liquide par surveillance des réactions multiples (LC/MRM) et v) le profilage standard de l’ARNm. Ce flux de travail se prête aux faibles quantités de tissus obtenues par l’échantillonnage des sous-régions cérébrales fonctionnellement discrètes (c’est-à-dire par poinçonnage du cerveau), empêchant ainsi les biais dans l’analyse multimoléculaire dus à l’hétérogénéité tissulaire et / ou à la variabilité animale. Pour révéler les conséquences périphériques des maladies neurologiques et établir des lectures moléculaires translationnelles des états de maladie neurologique, l’échantillonnage et le traitement des organes périphériques et leur analyse lipidomique ultérieure, ainsi que la lipidomique plasmatique, sont également poursuivis et décrits. Le protocole est démontré sur un modèle murin d’épilepsie aiguë.

Introduction

Les progrès récents dans la fonction des lipides et leur rôle dans l’apparition et la progression des maladies neurologiques ouvrent de nouveaux lieux de recherche et de développement de nouvelles cibles thérapeutiques et d’élucidation des mécanismes de la ^maladie1. Les différences documentées dans la composition lipidique dans différentes régions du cerveau, soulignées par les techniques modernes d’imagerie moléculaire telles que l’imagerie par spectrométrie de masse et le profilage avancé par spectrométrie de masse, déplacent le paradigme de l’investigation des lipides de l’ensemble du cerveau vers des régions cérébrales fonctionnellement distinctes et discrètes. Le fait que la composition lipidique varie dans différentes régions du cerveau incite à une nouvelle conceptualisation de la sensibilité aux lipides membranaires et de la signalisation lipidique en aval en réponse à une insulte cérébrale ou à des stimuli dans les régions cérébrales fonctionnellement distinctes. Par conséquent, les protocoles lipidiques nécessitent de nouveaux développements pour relever le défi des faibles quantités de tissus pour la détection et la quantification à plus haute résolution spatiale, et simultanément, l’analyse de multiples composants lipidiques des membranes cellulaires et des voies de signalisation. En outre, la détermination des enzymes, des ligands lipidiques et des récepteurs impliqués dans la régulation de leurs niveaux et de leur fonction est primordiale pour élucider les voies de signalisation affectées dans une maladie neurologique et guider de nouvelles investigations mécanistes dans un contexte physiopathologique.

En plus de l’augmentation de la résolution spatiale du cerveau, deux difficultés majeures remettent en question le développement de nouvelles approches neurolipidomiques. Tout d’abord, les molécules de signalisation lipidique sont généralement de très faible abondance par rapport aux lipides constitutifs de la membrane. Deuxièmement, le lipidome présente une grande hétérogénéité structurelle, difficile à disséquer à l’aide d’une seule approche analytique. Par conséquent, les méthodes d’extraction et d’analyse sont adaptées à différentes catégories de lipides et couramment effectuées dans des échantillons de tissus distincts.². Méthodes lipidomiques Shotgun³ sont d’excellents outils pour révéler rapidement un large profil des lipides membranaires, tandis que la sensibilité et la sélectivité accrues offertes par les méthodes de spectrométrie de masse de découverte et de quantification ciblées sont capitalisées pour étudier les lipides de signalisation à faible abondance, y compris: i) les lipides inflammatoires et ii) les lipides impliqués dans la modulation de l’activité neuronale, tels que les endocannabinoïdes (eCB), les lipides liés aux acides aminés, etc.^4,5. Pour englober les changements lipidiques à la fois au niveau de la membrane cellulaire et de la signalisation se produisant dans les régions du cerveau des modèles de maladies neurologiques, l’extraction et l’analyse des lipides sont généralement effectuées dans des échantillons de tissus distincts, obtenus à partir de lots animaux distincts ou de différents hémisphères, ou en disséquant une plus grande région tissulaire en plusieurs morceaux. Lorsque les niveaux d’ARNm des récepteurs enzymatiques sont également intéressants, leur étude nécessite généralement l’obtention d’un échantillon de tissu distinct. Par exemple, l’étude des lipides membranaires, des cannabinoïdes endogènes et de l’ARNm nécessiterait trois échantillons de tissus différents (par exemple, deux échantillons pour les deux méthodes d’extraction des lipides - lipides membranaires et lipides de signalisation - et deux méthodes d’analyse des lipides subséquentes - et un échantillon pour l’analyse de l’ARNm). L’étude des lipides inflammatoires et des cannabinoïdes endogènes nécessite respectivement deux échantillons de tissus, des méthodes d’extraction et des méthodes d’analyse distincts. Un autre exemple est l’étude de l’ARNm et de toute catégorie de lipides dans un échantillon de microdissection cérébrale ou laser qui nécessite par conséquent deux animaux distincts pour obtenir deux échantillons par (sous-)région cérébrale. Une variabilité importante et/ou une mauvaise reproductibilité des résultats se produisent fréquemment dans de tels cas, provenant de la variabilité biologique et/ou de l’hétérogénéité tissulaire. Guidé par ces limites pratiques de l’analyse multimoléculaire, se produisant en particulier à haute résolution spatiale dans le cerveau, un protocole neurolipidomique à trois modules a été conçu englobant: 1) la coextraction et la co-analyse par LC / MRM des lipides inflammatoires (par exemple, les eicosanoïdes (eiC)) et des lipides impliqués dans la modulation de l’activité neuronale, tels que les eCB²; 2) co-extraction des phospholipides (PL) et des eCB avec analyse LC/MRM multiscan et analyse de perte précurseur/neutre ultérieure²; et 3) double extraction des lipides membranaires (phospho)et des eCB ainsi que de l’ARNm, avec analyse ultérieure LC/MRM et qPCR ou séquençage de l’ARN⁶. Selon la question biologique à traiter dans une maladie neurologique et la région du cerveau d’intérêt, une combinaison du premier et du deuxième protocole, ou du premier et du troisième protocole, peut être appliquée sur le même échantillon de tissu pour des tissus pesant environ 4 mg. Les premier et troisième protocoles peuvent être appliqués indépendamment pour les tissus autour de 2 mg. Le deuxième protocole peut être appliqué pour les tissus pesant aussi peu que 0,5 mg. Quel que soit le module de protocole neurolipidomique sélectionné, le prélèvement tissulaire et le traitement pré-analytique, l’isolement cérébral et la dissection de la région, ainsi que la procédure de sacrifice du modèle animal sont standardisés et identiques pour les trois modules du protocole. Dans notre enquête sur les maladies neurologiques, les organes périphériques pertinents pour les conséquences pathologiques de la maladie sont toujours collectés et analysés à l’aide de ces protocoles modulaires. De plus, le sang est régulièrement prélevé pour la lipidomique plasmatique afin de servir d’outil de lecture des maladies neurologiques en vue d’applications translationnelles potentielles. Le protocole lipidomique modulaire présenté ici est très polyvalent : évolutif à de plus grandes quantités de tissus et facilement applicable à pratiquement tous les types de tissus et de maladies. Pour l’application du protocole modulaire (Graphique 1) dans les maladies neurologiques, tout modèle normalisé d’apparition et de progression de troubles neurologiques, tels que les lésions cérébrales traumatiques, la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou l’épilepsie, est acceptable.

Ces protocoles ont été largement appliqués pour étudier les changements dans le lipidome tissulaire et / ou le transcriptome à la phase aiguë de l’épilepsie dans le modèle murin d’épilepsie induit par l’acide kainique (KA)^2,7, un modèle largement utilisé dans les études précliniques en raison de la ressemblance avec l’épilepsie du lobe temporal humain (TLE)^8,9,10,11. À l’aide de ces protocoles, le potentiel thérapeutique de médicaments tels que le palmitoyléthanolamide (PEA)^12,13 a été évalué dans le même modèle murin d’épilepsie. L’étude a identifié des changements de lipides et d’ARNm à haute et basse résolution spatiale dans le cerveau et la périphérie, au point temporel des intensités de crise aiguës maximales (à 60 min après l’induction de l’incendie), et lors d’un traitement subchronique et aigu avec PEA à quatre moments différents (20, 60, 120 et 180 min) après l’induction de la crise KA, une fenêtre temporelle couvrant la phase aiguë de l’épilepsie. Le plasma, le cerveau et les organes périphériques de souris injectées de KA non traitées, de souris traitées au PEA aigu et subchroniquement, ainsi que de souris témoins de véhicules et de véhicules PEA, ont été collectés à chaque point ^{de temps12,13} et étudiés avec cette analyse moléculaire. Les données moléculaires ont été corrélées avec les phénotypes comportementaux obtenus par scoring de crise, ainsi qu’avec les données dérivées de l’immunohistochimie sur les processus neurodégénératifs, afin de démêler la progression de la phase d’épilepsie aiguë et le potentiel du PEA pour l’atténuer.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales décrites ici sont conformes à la directive du Conseil de la Communauté européenne du 22 septembre 2010 (2010/63UE) et ont été approuvées par le comité local des animaux de l’État de Rhénanie-Palatinat, Allemagne (référence du dossier: 23 177-07/G16-1-075).

1. Modèle animal d’épilepsie aiguë et traitée prophylactiquement induite par l’AC

1. Effectuer l’induction des crises, le traitement et la notation comportementale.
   1. Séparer les souris (minimum n = 6 souris par groupe) dans des cages simples.
   2. Préparer la solution injectable d’induction épileptique et le véhicule correspondant (voir tableau 1), ainsi que la solution d’injection de traitement et le véhicule correspondant (voir tableau 2).
   3. Injecter des souris par voie intrapéritonéale (i.p.) (10 mL/kg de masse corporelle de souris) sans anesthésie selon leur identité de groupe : maladie, traitée ou traitée par véhicule (c.-à-d. KA, KA traitée par PEA et les deux groupes de véhicules). Voir la figure 2, le tableau 1 et le tableau 2.
   4. Surveiller et noter le comportement selon l’échelle d’intensité de crise standardisée suivante : 0 = aucune réponse ; 1 = immobilité et regard fixe; 2 = extension du membre antérieur et/ou de la queue, posture rigide; 3 = mouvements répétitifs, balancement de la tête; 4 = élevage et chute; 5 = élevage et chute continus; 6 = crises clonico-toniques sévères; 7 = ^décès14,15 (figure 3).
2. Effectuer une procédure de sacrifice pour l’analyse lipidomique et transcriptomique.
   1. À quatre moments (c.-à-d. 20, 60, 120 et 180 min après l’injection de KA ou de véhicule, respectivement), sacrifiez six souris de chacun des groupes suivants : traité par PEA, véhicule épileptique non traité PEA 1 et véhicule 2, conformément aux protocoles approuvés par l’IACUC.
   2. Dix secondes après chaque point de temps atteint, anesthésiez les souris à l’aide d’un tissu imbibé d’isoflurane dans une chambre en verre. Confirmer l’anesthésie par la perte du réflexe de redressement, indiquée par l’incapacité de bouger tout en renversant lentement la chambre à verre. Décapiter des souris à l’aide de ciseaux chirurgicaux et prélever du plasma, du cerveau et des organes périphériques (voir les étapes 2.2.2−2.2.4).
      ATTENTION : Les règles éthiques pour les procédures de sacrifice varient d’un comité animalier local à l’autre. Assurez-vous de vérifier et de suivre les règlements émis par le comité local des animaux.
3. Suivez la procédure de sacrifice pour l’analyse immunohistochimique.
   1. Pour la coloration immunohistochimique13, notez comportementalement trois souris de chacun des groupes suivants : PEA traité, PEA-épilepsie non traitée et groupes de véhicules, sur l’ensemble du cours du temps (180 min).
   2. Sacrifiez et perfusez les souris 5 jours plus tard. Anesthésier en profondeur les souris (voir étape 1.3.1 pour les groupes de souris) par injection par voie intraveineuse de pentobarbital (100 mg/kg) et de buprénorphine (0,1 mg/kg) comme stupéfiants. Confirmer l’anesthésie profonde par la perte de réflexe entre les orteils.
   3. Fixez la souris sur une plaque de polystyrène et ouvrez immédiatement le thorax à l’aide de ciseaux fins et de pinces standard. Placez le papillon dans le ventricule cardiaque gauche et coupez l’oreillette droite à l’aide de ciseaux fins.
   4. Ajuster la vitesse et la pression de la pompe à un débit péristaltique constant avec un débit de 2−3 mL/min. Perfuser avec une solution saline tamponnée au phosphate glacé (PBS) pendant environ 5 min. Si nécessaire, remplacez le papillon.
      REMARQUE: Avec une perfusion appropriée, les organes internes (à l’exception de la rate) commencent à blanchir en 1-2 min.
   5. Passer de la perfusion à une solution glacée de paraformaldéhyde (PFA) à 4% pendant environ 5 min. Isoler les cerveaux entiers comme décrit à l’étape 2.2.2 et fixer pendant 24 h dans une solution de PFA à 4 % à 4 °C.
   6. Incuber les cerveaux dans une solution de saccharose à 30% pendant 48 h à 4 °C. Retirez les restes de saccharose avec un papier de soie sec et congelez les cerveaux sur une plaque métallique (-80 °C). Stockez le cerveau à -80 °C pour les procédures de ^coloration13.

2. Procédures d’échantillonnage pour l’analyse lipidomique/transcriptomique

1. Préparez-vous à l’échantillonnage.
   1. Tubes EDTA prérefroidis pour l’échantillonnage plasma à 4 °C. Prérefroidir la centrifugeuse et l’appareil vortex à 4 °C. Prérefroidissez la plaque métallique recouverte de papier d’aluminium (pour casser le cerveau gelé et/ou d’autres tissus d’intérêt) sur de la glace carbonique (-80 °C). Prérefroidir les tubes marqués de 2 mL et 5 mL sur de la glace carbonique (-80 °C) pour les aliquotes plasmatiques, les tissus congelés et la collecte de cerveaux, respectivement. Utilisez des tubes ambrés pour protéger les molécules sensibles à la lumière, telles que les eiC.
   2. Nettoyez l’équipement d’échantillonnage et d’isolement des tissus (ciseaux chirurgicaux, ciseaux fins droits et tranchants, pinces standard droites et lisses, pinces fines avec finition miroir, pinces et spatules incurvées, plaque de mousse de polystyrène et aiguilles pour la fixation) avec un désinfectant (p. ex. éthanol à 70 %).
2. Protocoles d’échantillonnage
   1. Déterminer l’ordre d’échantillonnage.
      1. Prélever le sang immédiatement après la décapitation dans des tubes EDTA de 1 mL prérefroidis (voir étape 2.2.3).
      2. Retirez tout le cerveau et congelez immédiatement après le retrait. Cette étape prendra 1 à 2 min. Conserver les cerveaux congelés à -80 °C pour un traitement ultérieur (voir étape 2.2.2).
      3. Prélever les organes périphériques d’intérêt (p. ex., poumon, cœur, foie), dans les 5 minutes suivant l’ablation du cerveau, et congeler et conserver à -80 °C pour un traitement ultérieur (voir l’étape 2.2.4).
   2. Retirez le cerveau pour les procédures de dissection ou de poinçonnage. Cette procédure prend 1−2 min/cerveau.
      1. Après la décapitation (voir étape 1.2), commencez à faire une incision médiane dans la peau à l’aide de ciseaux fins. Libérez le crâne en retournant la peau sur les yeux. Atteignez le sommet du crâne et faites une petite incision caudale en commençant au niveau de l’os intrapariétal. Évitez de couper dans le cerveau.
      2. Coupez fermement la partie la plus antérieure du crâne entre les yeux pour faciliter l’ablation du cerveau. Inclinez un côté de l’os pariétal à l’aide de pinces incurvées à motif étroit et rompez. Répétez la dernière étape pour l’autre côté.
      3. Enlevez les méninges cérébrales. Faites glisser une spatule sous la partie antérieure du cerveau (c’est-à-dire le bulbe olfactif) et inclinez doucement le cerveau vers le haut. Faites glisser la spatule plus bas pour briser l’optique et d’autres nerfs crâniens.
      4. Soulevez le cerveau hors du crâne et congelez tout le cerveau immédiatement sur une plaque métallique prérefroidie (-80 ° C) avec la face ventrale faisant face à la plaque métallique (dorsale vers le haut).
      5. Laisser les cerveaux geler complètement et transférer dans des tubes de 5 mL prérefroidis et les stocker à -80 °C jusqu’à la dissection des régions du cerveau ou la procédure de poinçonnage (voir étapes 3.1. et 3.2).
   3. Effectuer un échantillonnage plasmatique.
      1. Tubes EDTA prérefroidis Spike avec 10 μL d’indométacine-dilution fraîchement préparée à une concentration cible de 10 μM.
      2. Prélever le sang du tronc immédiatement après la décapitation en pressant doucement le corps dans des tubes EDTA prérefroidis jusqu’à un volume sanguin maximal de 1 mL.
         REMARQUE: En cas de pression artérielle appropriée, il n’est pas nécessaire de presser. Si le volume sanguin est inférieur à 1 mL, diminuez le temps d’incubation de l’isoflurane pour permettre une bonne circulation sanguine.
      3. Centrifuger immédiatement les tubes sanguins à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
      4. Retirer la phase plasmatique supérieure résultante et aux fins de l’analyse multilipidique des volumes plasma définis par aliquote dans des tubes prérefroidis de 2 mL comme suit: 50 μL pour l’analyse eCB/eiCs, 30 μL pour l’analyse PLs et le volume plasma restant comme échantillon de secours ou pour d’autres types d’analyse.
      5. Conserver les échantillons de plasma à -80 °C pour une extraction ultérieure (voir étapes 4.1.2 et 4.1.4).
   4. Effectuer un prélèvement d’organes périphériques.
      REMARQUE: Utilisez les références d’anatomie de la ^souris16 et la documentation fournie pour les cours obligatoires (FELASA) suivis par les chercheurs sur les animaux afin d’identifier les organes individuels, leurs tissus conjonctifs et / ou leurs vaisseaux sanguins.
      1. Immobilisez le torse de la souris pour faciliter le prélèvement d’organes à l’aide d’aiguilles. Faites une incision ventrale de la ligne médiane à l’aide d’un ciseau droit et pointu à la hauteur du pubis. Utilisez des pinces standard émoussées pour fixer la paroi abdominale tout en coupant pour ouvrir la cavité abdominale.
      2. Immobiliser la peau pour permettre le prélèvement des organes abdominaux à l’aide de pinces contondantes. Pour l’ablation du cœur ou des poumons, continuer la coupe médiale dans la direction de la grotte mammaire. Retirez le poumon et/ou le cœur à l’aide d’une pince fine.
      3. Ouvrez soigneusement la cavité mammaire pour éviter les saignements. Coupez les tissus conjonctifs et les vaisseaux sanguins qui ancrent l’organe respectif sans couper à travers l’organe.
      4. Transférer immédiatement les morceaux de tissu sur des plaques métalliques prérefroidies (-80 °C) et laisser geler complètement. Transférer les morceaux de tissu dans des tubes prérefroidis et les conserver à -80 °C pour un traitement ultérieur (voir étape 4.1).

3. Traitement des matières biologiques

REMARQUE: Pour la co-extraction des eCB/eiCs, utilisez des tubes ambrés de 2 mL comme tubes d’extraction et ajoutez dans chaque tube sept billes d’acier prérefroidies. Pour la co-extraction des PL/eCB et pour la double co-extraction des lipides et des ARN, utilisez 2 mL de tubes d’extraction sans ARNi enrichis de billes de céramique (Table des matériaux).

1. Effectuer la dissection cérébrale et le traitement des organes périphériques.
   REMARQUE: Utilisez des lampes grossissantes pour augmenter la visibilité du cerveau pour la dissection.
   1. Nettoyez les outils chirurgicaux, y compris les pinces avec des pointes super fines, 2x avec 70% d’éthanol.
   2. Transférer les cerveaux congelés de -80 °C dans une boîte de Pétri contenant un tampon physiologique prérefroidi (pH 5,5) Assurez-vous que la boîte de Pétri est à 4 °C. Permettre aux cerveaux de se dégeler complètement pour permettre la dissection. Testez soigneusement à l’aide de pinces.
      ATTENTION : Ne gardez pas le cerveau à 4 °C plus longtemps que nécessaire pour la décongélation.
   3. Prérefroidir une plaque métallique sur de la glace (4 °C) et la recouvrir de tissus humides imbibés de tampon physiologique glacé (pH 5,5) et transférer soigneusement le cerveau avec le côté ventral vers le haut sur une plaque métallique prérefroidie (4 °C) sur de la glace. Couvrez-le de tissus humides imbibés d’un tampon physiologique glacé (pH 5,5).
   4. Disséquez les régions du cerveau dans un délai maximum de 5 minutes à l’aide de pinces à pointe super fine. Commencez par l’hypothalamus (HYP) et tournez la face dorsale vers le haut pour continuer avec le côté droit. Isolez l’hippocampe (HCr), le cortex préfrontal (PFCr), le striatum (STRr) et le cortex cérébral (cCTXr). Ensuite, disséquez le côté gauche. Isolez l’hippocampe (HCl), le cortex préfrontal (PFCl), le striatum (STRl) et le cortex cérébral (cCTXl). Disséquer le cervelet et la région thalamique. Utilisez des références anatomiques ^{publiées16,17} pour l’identification de la région du cerveau.
   5. Transférer chaque pièce disséquée directement sur une plaque métallique prérefroidie recouverte d’une feuille d’aluminium (-80 °C). Permettre la congélation et le transfert des régions cérébrales isolées dans les tubes de 2 mL prérefroidis étiquetés.
   6. Pulvériser les morceaux de tissu à l’aide d’un pulvérisateur de tissu (à -80 °C), en évitant la décongélation du tissu. Dans la chambre froide, poudre de tissu aliquote dans des tubes d’extraction étiquetés et prérefroidis contenant des billes de céramique ou des billes d’acier. Pour l’analyse double lipidomique/transcriptomique, peser les aliquotes de poudre tissulaire dans la chambre froide. Pour l’analyse lipidomique uniquement, choisissez entre la normalisation du poids tissulaire ou de la teneur en protéines. Pour ce dernier, continuez sans peser les tissus.
   7. Couper les tissus des organes périphériques en morceaux d’un poids maximum de 20 mg. Procéder à la pulvérisation des tissus comme à l’étape 3.1.6.
   8. Procéder à l’extraction d’échantillons de tissus (voir étapes 4.1.1, 4.1.3 ou 4.1.5) ou stocker des tubes à -80 °C pour une extraction ultérieure.
      REMARQUE: La matrice cérébrale peut également être utilisée si la conception de l’étude le permet. Cependant, la méthode est plus appropriée pour un nombre discret et limité de régions du cerveau, et il n’est pas pratique de disséquer et d’isoler toutes les régions du cerveau mentionnées ci-dessus dans le délai imparti.
2. Effectuez un coup de poing dans le cerveau.
   1. Montez les cerveaux entiers et gelés sur le système de montage (Table des matériaux) dans le cryostat. Réglez l’épaisseur sur 50 μm et coupez en mode découpage près de la région d’intérêt.
   2. Colorer une tranche de cerveau (18−20 μm) en utilisant du bleu de toluidine (0,1 %−1 %) comme référence pour localiser la sous-région d’intérêt. Inspectez les tranches colorées à l’aide d’un microscope pour identifier les régions d’intérêt à poinçonner. Utilisez un atlas de souris comme référence pour trouver les régions anatomiques cérébrales ^{appropriées16}. Prenez des poinçons d’un diamètre de 0,8 à 1,0 mm à l’aide de carottes d’échantillon dans des tubes prérefroidis.
   3. Peser les poinçons congelés dans la chambre froide dans des tubes d’extraction étiquetés et prérefroidis de 2 mL contenant des billes de céramique ou des billes d’acier. Utilisez des tubes ambrés pour la co-extraction des eCB et des eiCs.
   4. Commencez l’extraction (voir les étapes 4.1.1, 4.1.3 ou 4.1.5) ou stockez les tubes à -80 °C pour une extraction ultérieure.
3. Effectuer un traitement plasma.
   1. Placer les échantillons de plasma congelés sur de la glace (4 °C) et les laisser décongeler (~20 min).
   2. Assurez-vous que le plasma est entièrement décongelé avant de commencer l’extraction.
   3. Procéder à la procédure d’extraction au plasma (voir les étapes 4.1.2 ou 4.1.4).
      REMARQUE : Les échantillons de plasma doivent rester à -80 °C jusqu’à l’extraction. Évitez les cycles de décongélation et de recongélation.

4. Procédures d’extraction

1. Effectuer des protocoles de co-extraction lipidique liquide-liquide (LLE).
   1. Effectuer la co-extraction d’eCB et d’eiCs à partir de morceaux de cerveau, de poinçons ou d’échantillons de poudre de tissu.
      REMARQUE: Un pipetage précis est nécessaire tout au long de la procédure.
      1. Placer les tubes d’extraction contenant les échantillons de tissus et sept billes d’acier sur de la glace (4 °C). Ajouter 600 μL de MTBE glacé et 50 μL d’ACN/_H2O (1:1; v/v) contenant les étalons internes. La concentration cible des étalons internes dans le volume final pour analyse (50 μL) est la suivante : 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3 000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 et 5 ng/mL pour PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 et TXB2-d4, respectivement.
      2. Ajouter 400 μL d’acide formique 0,1 M et homogénéiser avec un lyseur tissulaire (30 s-1 min). Centrifuger l’homogénat pendant 15 min à 5 000 x g à 4 °C. Laisser congeler la phase inférieure aqueuse pendant 10 min à -80 °C pour faciliter le transfert de la phase organique supérieure.
      3. Transférer la phase organique dans de nouveaux tubes. Évaporer sous un léger jet de _N2 à 37 °C et reconstituer dans 50 μL d’ACN/_H2O (1:1; v/v) pour une analyse plus approfondie.
      4. Conservez la phase aqueuse à -20 °C ou -80 °C pour une analyse plus approfondie de la teneur en protéines.
   2. Effectuer la co-extraction des eCB et des eiCs à partir d’échantillons de plasma.
      1. Décongeler les aliquotes de plasma à 4 °C. Ajouter 800 μL de MTBE et 50 μL d’ACN/_H2O (1:1; v/v) contenant les étalons internes (analogues à ceux utilisés pour l’analyse tissulaire, voir l’étape 5.1.1). Optimiser la concentration étalon interne pour le pic à l’aide d’échantillons de plasma de référence.
      2. Ajouter 600 μL d’acide formique 0,1 M et des échantillons de vortex à 4 °C pendant 2 min. Échantillons de centrifugeuse à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
      3. Transférer la phase organique dans de nouveaux tubes, évaporer sous un doux flux de _N2 à 37 °C et reconstituer dans 50 μL d’ACN/_H2O (1:1; v/v) pour l’analyse LC/MRM.
         REMARQUE: Si possible, évitez de stocker des extraits séchés d’eiCs et passez immédiatement à l’analyse LC / MRM. Si le stockage ne peut être évité, recourir à un stockage de courte durée pendant seulement 2−3 jours à 4 ° C avec des échantillons dans un solvant d’injection LC.
   3. Effectuer la co-extraction des PL et des eCB à partir de régions du cerveau, de poinçons ou d’autres échantillons de poudre de tissu.
      1. Placer les tubes d’extraction contenant les échantillons de tissus et les perles de céramique sur de la glace (4 °C). Ajouter 800 μL de MTBE/MeOH (10:3; v/v) et 10 μL de MeOH contenant les étalons internes. La concentration cible des étalons internes dans le volume final pour analyse (100 μL) est la suivante : 150 ng/mL pour PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1 ; PI 17:0/14:1 ; PLC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12 : 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4 000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 et 3 ng/mL PEA-d4 respectivement.
      2. Ajouter 200 μL d’acide formique à 0,1 % contenant 25 μM de tétrahydrolipstatine/URB597 et 50 μg/mL de BHT. Homogénéiser avec l’homogénéisateur tissulaire (Table des matières) et centrifuger à 5 000 x g et 4 °C pendant 15 min.
      3. Récupérer la phase organique supérieure dans de nouveaux tubes et évaporer sous un doux flux de _N2 à 37 °C. Reconstituer dans 90 μL de MeOH et conserver à -20 °C ou -80 °C ou passer à l’étape suivante.
      4. Ajouter 10 % de _H2O à une aliquote d’extrait lipidique (4.1.3.3) et injecter 10 μL dans la CL/SM pour l’analyse des PL. Pour une analyse plus approfondie de la CEE, passez à l’étape 4.3.5.
      5. Prendre une aliquote de l’extrait (4.1.3.3), évaporer à sec et reconstituer en ACN/_H2O (1:1; v/v). Utilisez 20 μL pour l’injection de LC/MS pour l’analyse eCB.
   4. Effectuer la co-extraction des PL et des eCB à partir d’échantillons de plasma.
      1. Décongeler les aliquotes plasmatiques à 4 °C, ajouter 1 000 μL de MTBE/méthanol (10:3; v/v) et 10 μL de MeOH contenant des étalons internes (analogues à l’étape 4.1.3) et vortex à 4 °C pendant 1 min.
      2. Ajouter 250 μL de _H2O et vortex pendant 45 min à 4 °C. Échantillons de centrifugeuse pendant 15 min à 5 000 x g et 4 °C. Récupérer la phase organique supérieure, évaporer sous un doux flux de _N2 à 37 °C et reconstituer dans 90 μL de méthanol pour une analyse LC/MS plus poussée. Conserver à -20 °C ou -80 °C ou passer à l’étape suivante.
      3. Pour l’analyse des PL, ajouter 10 % d’eau à une aliquote d’extrait lipidique (4.1.2.2).
      4. Pour l’analyse eCB, ajouter 10 % d’eau à une aliquote de l’extrait lipidique (voir 4.1.4.3), évaporer à sec et reconstituer dans 50 % d’ACN/_H2O (1:1; v/v).
   5. Effectuer une double extraction de l’ARN et des lipides (co-extraction des PL et des eCB) à partir d’échantillons de tissus.
      ATTENTION : Assurez-vous de travailler dans des conditions sans ARN pour éviter la dégradation de l’ARN.
      1. Décongeler les aliquotes de poudre de tissu ou les grappes de cerveau (à 4 °C) et ajouter 600 μL de tampon RLT contenant 5 μM THL/URB597, 10 μg/mL de BHT et 1 % de β-mercaptoéthanol (pour les pourcentages du volume final du tampon d’homogénéisation, voir l’étape 4.1) ainsi que 200 μL de chloroforme aux tubes d’extraction contenant des poinçons cérébraux congelés et des perles de céramique.
      2. Épiler des échantillons avec 10 μL de mélange étalon interne pour les PL et la co-extraction eCB (voir étape 4.1.3) et homogénéiser via un homogénéisateur tissulaire (haute vitesse, 20 s).
      3. Transférer les lysats dans de nouveaux tubes centrifuges et centrifuger pendant 5 min à pleine vitesse et 4 °C pour permettre la séparation de phase.
      4. Récupérez et utilisez la phase supérieure pour l’extraction de l’ARN à l’aide de kits de procédure d’extraction d’ARN standard (Table des matériaux). Éluter l’ARN dans un volume total de 50 μL d’eau sans RNase et stocker à -80 °C.
         REMARQUE : L’échantillon à l’étape 4.1.5.4 se prête à la fois au séquençage de l’ARN et à la qPCR à l’aide des méthodes et de l’instrumentation appropriées.
      5. Utilisez la phase inférieure contenant du chloroforme pour l’extraction des lipides. Ajouter 800 μL de MTBE/méthanol (10:3; v/v) et 200 μL d’acide formique à 0,1 % et vortex pendant 45 min à 4 °C. Récupérer la phase organique supérieure et évaporer sous un doux jet de _N2 à 37 °C.
      6. Reconstituer dans 90 μL de méthanol pour une analyse plus approfondie de la CL/SEP. Conserver à -20 °C ou -80 °C ou passer à l’étape 5.
      7. Ajouter 10 % de _H2O à une aliquote d’extrait lipidique (voir l’étape 4.1.5.6 ci-dessus) et injecter 10 μL dans la CL/MS pour l’analyse des PL. Pour une analyse plus approfondie de la CEE, passez à l’étape 5.7.
      8. Prendre une aliquote de l’extrait (voir ci-dessus étape 4.1.5.6) évaporer à sec et reconstituer en ACN/_H2O (1:1; v/v). Utiliser 20 μL pour l’injection de CL/MS pour l’analyse eCB (analogue à l’étape 4.3.5).

5. Profilage qualitatif et quantitatif LC/MRM

1. Préparer des systèmes de solvants LC, des solutions d’étalonnage et des échantillons de contrôle de la qualité.
   1. Pour les PL, préparer la phase mobile A : méthanol/eau (1:1; v/v) contenant 7,5 mM de formiate d’ammonium et 0,1 % de TEA. Préparer la phase B mobile : méthanol/isopropanol (2:8; v/v) contenant 7,5 mM de formiate d’ammonium et 0,1 % de TEA. Conservez les solvants dans des bouteilles LC.
   2. Pour la séparation eCB et eiC, préparer les solvants LC suivants : 0,1 % d’acide formique en phase mobile A et 100 % d’ACN contenant 0,1 % d’acide formique en phase B mobile. Conserver les solvants dans des bouteilles de LC.
   3. Préparer les contrôles de qualité à l’aide des étalons d’étalonnage et des étalons internes (tableau 3) à une concentration équimolaire ou définie par l’utilisateur.
   4. Préparez des courbes d’étalonnage avec sept points de concentration. Utilisez le même lot étalon interne pour monter en flèche dans la solution de courbe d’étalonnage et dans les échantillons à analyser.
2. Utilisez la méthode LC-MRM pour le profilage qualitatif et quantitatif des lipides.
   1. Ouvrez l’onglet Méthode d’acquisition de build dans le logiciel commercial (par exemple, Analyste) et sélectionnez le mode LC/MRM avec commutation de polarité. Définissez dans la méthode les transitions ioniques (comme indiqué dans le tableau 3) pour le profilage quantitatif. Réglez le temps de décantation à 50 ms.
   2. Pour le profilage PLs, définissez les paramètres de source d’ions suivants : gaz rideau = 40 psi ; température du chauffe-source = 550 °C; tension de pulvérisation ionique = -4 500 V en mode ion négatif et = +5 200 V en mode ion positif.
   3. Pour la co-analyse des eCB et des eiC, définissez les paramètres suivants: gaz rideau = 40 psi; température du chauffe-source = 550 °C; tension de pulvérisation ionique = -4 500 V en mode ion négatif et = +4 500 V en mode ion positif.
   4. Pour l’analyse PL, réglez le chauffage de la colonne à 45 °C et le débit à 200 μL/min et réglez le gradient suivant: min 0 = 40% B; min 3 = 40 % B; min 42 = 90 % B; min 43 = 99 % B; min 50 = 99 % B et min 52 = 40 % B. Réglez le volume d’injection à 10 μL.
   5. Pour l’analyse des eCB et des eiCs, réglez la température de la colonne à température ambiante et définissez le gradient suivant: min 0 = 20% B; min 1 = 20 % B; min 5 = 50 % B, min 12 = 50 % B; min 13 = 90 % B, min 17 = 90 % B; min 17,5 = 20 % B; min 20 = 20 % B. Régler le volume d’injection à 20 μL.
      REMARQUE: Les conditions MRM peuvent varier d’une plate-forme instrumentale à l’autre, d’où la fragmentation et les conditions MRM doivent être déduites expérimentalement et les paramètres d’ionisation doivent être testés et ajustés si nécessaire afin d’obtenir une sensibilité et une sélectivité maximales.
3. Effectuer une analyse par lots.
   1. Ouvrez build acquisition batch et remplissez les paramètres requis pour la description de l’exemple, l’emplacement dans le rack d’échantillons de l’échantillonneur automatique et la méthode d’acquisition (définie à l’étape 5.2).
   2. Incluez toujours des contrôles de qualité au début et à la fin de l’analyse et dans le lot. Après chaque 25 à 30 échantillons, inclure au moins trois courbes d’étalonnage dans le lot et inclure une étape de lavage avec un solvant de choix après chaque échantillon de contrôle de la qualité, courbe d’étalonnage et à la fin du lot d’échantillon.
   3. Transférer des échantillons obtenus à l’étape 4 dans des flacons de CL/SEP. Placez les échantillons dans les racks de chargement de l’échantillonneur automatique LC en fonction de la position définie dans le lot et chargez le rack d’échantillons dans l’échantillonneur automatique LC.
   4. Envoyez un lot et démarrez l’analyse de la file d’attente.
4. Quantification des lipides
   1. Utilisez le logiciel commercial (p. ex., Analyst) et le module de quantification intégré pour la quantification des eCB et des eiCs et le logiciel commercial (p. ex., Multiquant) pour la quantification des PL.
      REMARQUE: Le deuxième logiciel peut également être utilisé pour les eCB et les eiC, en particulier lorsqu’une norme interne est utilisée pour la quantification de plusieurs analytes.
   2. Méthode de quantification Open Build et remplissez les paramètres des analytes, des normes internes, des transitions MRM et attribuez les normes internes aux analytes à quantifier (tableau 3). Réglez la hauteur de crête minimale sur 500 cps.
   3. Utiliser les critères suivants ou leur combinaison pour l’attribution de l’identité lipidique et la quantification ^ultérieure6 : correspondance du temps de rétention des analytes endogènes lipidiques avec les étalons d’étalonnage et/ou les étalons internes deutérés, le cas échéant ; l’appariement des fragments par fragmentation en mode ionique positif et négatif pour un m/z donné d’analytes lipidiques pour lesquels aucune norme n’est fournie; comportement d’élution des lipides dans des conditions de CL utilisées de manière similaire pour disséquer les structures isomériques et/ou isobares; et, le cas échéant, l’analyse LC/MS et MS/MS avec spectrométrie de masse à haute résolution, en utilisant des conditions LC similaires à celles de l’analyse ciblée (utilisant LC/MRM), pour identifier avec précision l’identité et le comportement d’élution des lipides endogènes ^{d’intérêt18,19}.
   4. Pour la validation de l’analyse des lots, utilisez les critères suivants : précision de la quantification ≤ ±20 % ; coefficient de régression ≥0,97 (idéalement ≥0,99).
      REMARQUE: Suivez les directives pour le développement et la validation de méthodes bioanalytiques afin d’assurer une analyse fiable et reproductible des molécules cibles.

Résultats

L’ensemble des protocoles décrits peut être combiné à différents niveaux d’une manière spécifique à l’objectif, comme le choix du modèle animal, la voie d’échantillonnage, la méthode d’extraction et le profilage (figure 1).

Afin de déterminer les changements du taux de lipides dans le cerveau et la périphérie au cours d’un état épileptique aigu et de démêler l’effet a...

Discussion

La méthodologie neurolipidomique et transcriptomique décrite ici est un moyen viable d’étudier toute maladie ou développement sain à haute et basse résolution spatiale dans le cerveau et les organes périphériques. Grâce aux procédures optimisées d’échantillonnage et de manipulation du plasma, l’analyse lipidomique plasmatique peut également être effectuée à partir des mêmes animaux sacrifiés pour la lipidomique tissulaire et la transcriptomique, améliorant ainsi la fiabilité des corrélats molé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017	Microscopy
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Lipid Std
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth	FST	11016-17	Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern	FST	14130-17	Surgical Tools
T3000 Thermocycler	Biometra		Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2	Biomol	Cay19030-5	Lipid Std
Thromboxane B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Lipid Std
Tissue Lyser II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek	Sakura Finetek	4583	Microscopy
Toluidinblau	Roth	0300.2	Microscopy
Vapotherm	Barkey	4004734	Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	Solvent/LCMS