Lipidómica y Transcriptómica en Enfermedades Neurológicas

Resumen

Este artículo presenta un protocolo modular para lipidómica tisular y transcriptómica, y lipidómica plasmática en modelos de ratones de enfermedades neurológicas dirigidos a lípidos subyacentes a la inflamación subyacente y la actividad neuronal, lípidos de membrana, mensajeros aguas abajo y enzimas / receptores subyacentes de ARNm función lipídica subyacente. Se describen los procedimientos de muestreo, procesamiento de muestras, extracción y cuantificación.

Resumen

Los lípidos sirven como la interfaz principal para los insultos cerebrales o estímulos conducentes a enfermedades neurológicas y son un reservorio para la síntesis de lípidos con diversas funciones de señalización o ligando que pueden subrayar la aparición y progresión de enfermedades. A menudo cambiando a nivel presintomático, los lípidos son una fuente emergente de dianas farmacológicas y biomarcadores. Muchas enfermedades neurológicas exhiben neuroinflamación, neurodegeneración y excitabilidad neuronal como características comunes, parcialmente moduladas por sistemas específicos de señalización lipídica. La interdependencia e interrelación de la síntesis de varios lípidos provoca un análisis multilipídico, multienzimático y multirreceptor para derivar los puntos en común y las especificidades de los contextos neurológicos y acelerar el desentrañamiento de los aspectos mecanicistas del inicio y la progresión de la enfermedad. La atribución de roles lipídicos a distintas regiones del cerebro avanza en la determinación del fenotipo molecular lipídico y la morfología asociada con una enfermedad neurológica.

Aquí se presenta un protocolo modular adecuado para el análisis de lípidos de membrana y señales lipídicas aguas abajo junto con ARNm de enzimas y mediadores subyacentes a su funcionalidad, extraídos de regiones cerebrales discretas que son relevantes para una enfermedad neurológica y / o condición en particular. Para garantizar un perfil lipidómico comparativo preciso, los flujos de trabajo y los criterios operativos se optimizaron y estandarizaron para: i) muestreo cerebral y disección de regiones de interés, ii) coextracción de múltiples señales lipídicas y lípidos de membrana, iii) extracción dual de lípidos / ARNm, iv) cuantificación por cromatografía líquida monitoreo de reacciones múltiples (LC / MRM) y v) perfil estándar de ARNm. Este flujo de trabajo es susceptible de las bajas cantidades de tejido obtenidas mediante el muestreo de las subregiones cerebrales funcionalmente discretas (es decir, mediante punzonado cerebral), evitando así el sesgo en el análisis multimolecular debido a la heterogeneidad del tejido y / o la variabilidad animal. Para revelar las consecuencias periféricas de las enfermedades neurológicas y establecer lecturas moleculares traslacionales de los estados de enfermedad neurológica, también se persiguen y describen el muestreo de órganos periféricos, el procesamiento y su posterior análisis lipidómico, así como la lipidómica plasmática. El protocolo se demuestra en un modelo de ratón con epilepsia aguda.

Introducción

Los recientes avances en la función de los lípidos y su papel en la aparición y progresión de enfermedades neurológicas abren nuevos lugares de investigación y desarrollo de nuevas dianas terapéuticas y elucidación del mecanismo de la ^enfermedad1. Las diferencias documentadas en la composición de lípidos en diferentes regiones del cerebro, enfatizadas por las técnicas modernas de imágenes moleculares, como las imágenes de espectrometría de masas y el perfil avanzado de espectrometría de masas, cambian el paradigma de la investigación de lípidos de todo el cerebro hacia regiones cerebrales funcionalmente distintas y discretas. El hecho de que la composición lipídica varíe en diferentes regiones del cerebro provoca una nueva conceptualización tanto de la sensibilidad a los lípidos de la membrana como de la señalización lipídica aguas abajo en respuesta a un insulto o estímulo cerebral a través de las regiones cerebrales funcionalmente distintas. Por lo tanto, los protocolos de lípidos requieren nuevos desarrollos para abordar el desafío de las bajas cantidades de tejido para una detección y cuantificación de mayor resolución espacial y, al mismo tiempo, el análisis de múltiples componentes lipídicos de las membranas celulares y las vías de señalización. Además, la determinación de enzimas, ligandos lipídicos y receptores implicados en la regulación de sus niveles y función es primordial para dilucidar las vías de señalización afectadas en una enfermedad neurológica y guiar nuevas investigaciones mecanicistas en un contexto fisiopatológico.

Además del aumento de la resolución espacial cerebral, hay dos dificultades principales que desafían el desarrollo de nuevos enfoques neurolipidómicos. En primer lugar, las moléculas de señalización lipídica son típicamente de muy baja abundancia en comparación con los lípidos constitutivos de membrana. En segundo lugar, el lipidoma exhibe una alta heterogeneidad estructural, difícil de diseccionar utilizando un único enfoque analítico. Por lo tanto, los métodos de extracción y análisis se adaptan a diferentes categorías de lípidos y se realizan comúnmente en distintas muestras de tejido.². Métodos lipidómicos de escopeta³ son excelentes herramientas para revelar rápidamente un amplio perfil de lípidos de membrana, mientras que el aumento de la sensibilidad y la selectividad ofrecidas por los métodos espectrométricos de masas de descubrimiento y cuantificación dirigidos se aprovechan para la investigación de lípidos de señalización de baja abundancia, incluidos: i) lípidos inflamatorios y ii) lípidos involucrados en la modulación de la actividad neuronal, como endocannabinoides (eCB), lípidos vinculados a aminoácidos, etc.^4,5. Para abarcar los cambios lipídicos tanto a nivel de membrana celular como de señalización que ocurren en las regiones cerebrales de los modelos de enfermedades neurológicas, generalmente la extracción y el análisis de lípidos se llevan a cabo en distintas muestras de tejido, obtenidas de distintos lotes de animales o de diferentes hemisferios, o diseccionando una región de tejido más grande en múltiples piezas. Cuando los niveles de ARNm de los receptores enzimáticos también son de interés, su investigación generalmente requiere la obtención de una muestra de tejido distinta. Por ejemplo, la investigación de lípidos de membrana, cannabinoides endógenos y ARNm requeriría tres muestras de tejido diferentes (por ejemplo, dos muestras para los dos métodos de extracción de lípidos -lípidos de membrana y lípidos de señalización- y dos métodos posteriores de análisis de lípidos- y una muestra para el análisis de ARNm). La investigación de lípidos inflamatorios y cannabinoides endógenos requiere dos muestras de tejido distintas, métodos de extracción y métodos de análisis, respectivamente. Otro ejemplo es la investigación del ARNm y de cualquier categoría de lípidos en una muestra de punzón cerebral o microdisección láser que, en consecuencia, requiere que dos animales distintos obtengan dos muestras por (sub)región cerebral. En tales casos se produce con frecuencia un grado sustancial de variabilidad y/o escasa reproducibilidad de los resultados, originándose en la variabilidad biológica y/o la heterogeneidad tisular. Guiados por estas limitaciones prácticas del análisis multimolecular, que ocurren particularmente a alta resolución espacial en el cerebro, se diseñó un protocolo neurolipidómico de tres módulos que abarca: 1) coextracción y coanálisis por LC / MRM de lípidos inflamatorios (por ejemplo, eicosanoides (eiCs)) y lípidos involucrados en la modulación de la actividad neuronal, como eCBs²; 2) co-extracción de fosfolípidos (PL) y eCB con posterior análisis multiescanal LC/MRM y precursor/neutral de pérdida²; y 3) extracción dual de (fosfo)lípidos de membrana y eCBs, así como ARNm, con posterior análisis de secuenciación LC/MRM y qPCR o ARN⁶. Dependiendo de la cuestión biológica a abordar en una enfermedad neurológica y la región cerebral de interés, se puede aplicar una combinación del primer y segundo protocolo, o el primer y el tercer protocolo, en la misma muestra de tejido para tejidos que pesan alrededor de 4 mg. El primer y tercer protocolo se pueden aplicar de forma independiente para tejidos de alrededor de 2 mg. El segundo protocolo se puede aplicar para tejidos que pesan tan poco como 0,5 mg. Independientemente del módulo de protocolo neurolipidómico seleccionado, el muestreo de tejido y el procesamiento preanalítico, el aislamiento cerebral y la disección de la región, así como el procedimiento para sacrificar el modelo animal están estandarizados e idénticos para los tres módulos del protocolo. En nuestra investigación de enfermedades neurológicas, los órganos periféricos que son relevantes para las consecuencias patológicas de la enfermedad siempre se recopilan y analizan utilizando estos protocolos modulares. Además, la sangre se muestrea regularmente para lipidómica plasmática para servir como una herramienta de lectura de enfermedades neurológicas con vistas a posibles aplicaciones traslacionales. El protocolo de lipidómica modular aquí presentado es muy versátil: escalable a cantidades de tejido más grandes y fácilmente aplicable para prácticamente cualquier tipo de tejido y enfermedad. Para la aplicación del protocolo modular (Figura 1) en las enfermedades neurológicas, cualquier modelo estandarizado de roedores de inicio y progresión de trastornos neurológicos, como la lesión cerebral traumática, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o la epilepsia son susceptibles.

Estos protocolos se han aplicado ampliamente para estudiar los cambios en el lipidoma tisular y/o el transcriptoma en la fase aguda de la epilepsia en el modelo de epilepsia inducida por ácido kínico (KA)^2,7, modelo ampliamente utilizado en estudios preclínicos debido a la semejanza con la epilepsia del lóbulo temporal humano (TLE)^8,9,10,11. Utilizando estos protocolos, se evaluó el potencial terapéutico de fármacos como la Palmitoiletanolamida (PEA)^12,13 en el mismo modelo de ratón de epilepsia. El estudio identificó cambios en los lípidos y el ARNm a alta y baja resolución espacial en el cerebro y la periferia, en el punto temporal de las intensidades máximas de convulsiones agudas (a los 60 minutos de inducción posterior a la incautación) y en el tratamiento subcrónico y agudo con PEA en cuatro puntos de tiempo diferentes (20, 60, 120 y 180 min) después de la inducción de la convulsión ka, una ventana de tiempo que cubre la fase aguda de la epilepsia. El plasma, los cerebros y los órganos periféricos de ratones no tratados inyectados con KA, ratones tratados con PEA aguda y subcrónicamente, así como ratones de control de vehículos y vehículos PEA, se recolectaron en cada punto de ^tiempo12,13 y se investigaron con este análisis molecular. Los datos moleculares se correlacionaron con fenotipos conductuales obtenidos por puntuación de convulsiones, así como con datos derivados de inmunohistoquímica sobre procesos neurodegenerativos, con el fin de desentrañar la progresión de la fase de epilepsia aguda y el potencial de la PEA para aliviarla.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales descritos aquí están de acuerdo con la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea de 22 de septiembre de 2010 (2010/63UE) y fueron aprobados por el comité local de animales del estado de Renania-Palatinado, Alemania (referencia de archivo: 23 177-07/G16-1-075).

1. Modelo animal de epilepsia aguda y inducida por KA tratada profilácticamente

1. Realizar la inducción de convulsiones, el tratamiento y la puntuación del comportamiento.
   1. Separar ratones (mínimo n = 6 ratones por grupo) en jaulas individuales.
   2. Preparar la solución inyectable por inducción para convulsiones y el vehículo correspondiente (ver Tabla 1), así como la solución de inyección de tratamiento y el vehículo correspondiente (ver Tabla 2).
   3. Inyectar ratones por vía intraperitoneal (i.p.) (10 ml/kg de masa corporal del ratón) sin anestesia según su identidad de grupo: enfermedad, tratado o vehículo tratado (es decir, KA, KA tratado con PEA y los dos grupos de vehículos). Ver Figura 2, Tabla 1 y Tabla 2.
   4. Monitorear y calificar el comportamiento de acuerdo con la siguiente escala estandarizada de intensidad de convulsiones: 0 = sin respuesta; 1 = inmovilidad y mirada fija; 2 = extensión de la extremidad anterior y/o de la cola, postura rígida; 3 = movimientos repetitivos, balanceo de la cabeza; 4 = crianza y caída; 5 = crianza y caída continuas; 6 = convulsiones clónico-tónicas graves; 7 = ^muerte14,15 (Figura 3).
2. Realizar un procedimiento de sacrificio para el análisis lipidómico y transcriptómico.
   1. En cuatro puntos de tiempo (es decir, 20, 60, 120 y 180 minutos después de la inyección de KA o vehículo, respectivamente), sacrifique seis ratones de cada uno de los siguientes grupos: PEA tratado, pea no tratado vehículo epiléptico 1 y vehículo 2, siguiendo los protocolos aprobados por la IACUC.
   2. Diez segundos después de cada punto de tiempo, anestesiar a los ratones usando un tejido empapado de isoflurano en una cámara de vidrio. Confirme la anestesia por la pérdida del reflejo de enderezamiento, indicado por la incapacidad de moverse mientras se vuelca lentamente la cámara de vidrio. Decapitar ratones usando tijeras quirúrgicas y recolectar plasma, cerebro y órganos periféricos (ver pasos 2.2.2-2.2.4).
      PRECAUCIÓN: Las regulaciones éticas para los procedimientos de sacrificio varían entre los comités locales de animales. Asegúrese de verificar y seguir las regulaciones emitidas por el comité local de animales.
3. Siga el procedimiento de sacrificio para el análisis de inmunohistoquímica.
   1. Para la tinción ^{inmunohistoquímica13}, puntúe conductualmente a tres ratones de cada uno de los siguientes grupos: PEA tratado, epilepsia no tratada con PEA y grupos de vehículos, durante todo el curso del tiempo (180 min).
   2. Sacrifica y perfunde ratones 5 días después. Anestesiar profundamente a los ratones (ver paso 1.3.1 para los grupos de ratones) mediante inyección i.p. de pentobarbital (100 mg/kg) y buprenorfina (0,1 mg/kg) como estupefacientes. Confirmar la anestesia profunda por la pérdida del reflejo entre los dedos de los pies.
   3. Fije el ratón en una placa de poliestireno y abra inmediatamente el tórax con tijeras finas y pinzas estándar. Coloque la mariposa en el ventrículo izquierdo del corazón y corte la aurícula derecha con tijeras finas.
   4. Ajuste la velocidad y la presión de la bomba a un flujo peristáltico constante con una velocidad de 2−3 ml/min. Perfuse con solución salina tamponada con fosfato helado (PBS) durante ~ 5 min. Si es necesario, reemplace la mariposa.
      NOTA: Con la perfusión adecuada, los órganos internos (excepto el bazo) comienzan a blanquearse en 1-2 min.
   5. Cambie la perfusión a una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% helada durante ~ 5 min. Aislar cerebros enteros como se describe en el paso 2.2.2 y fijar durante 24 h en solución de PFA al 4% a 4 °C.
   6. Incubar cerebros en solución de sacarosa al 30% durante 48 h a 4 °C. Retire la sacarosa sobrante con un papel de seda seco y congele los cerebros en una placa de metal (-80 ° C). Almacene los cerebros a -80 °C para los procedimientos de ^tinción13.

2. Procedimientos de muestreo para el análisis lipidómico/transcriptómico

1. Prepárese para el muestreo.
   1. Tubos de EDTA preenfriados para muestreo plasmático a 4 °C. Preenfríe el aparato de centrífuga y vórtice a 4 °C. Preenfríe la placa de metal cubierta con papel de aluminio (para romper el cerebro congelado y / u otros tejidos de interés) sobre hielo seco (-80 ° C). Preenfriar los tubos etiquetados de 2 ml y 5 ml en hielo seco (-80 °C) para alícuotas plasmáticas, tejido congelado y recolección de cerebro, respectivamente. Use tubos de ámbar para proteger las moléculas sensibles a la luz, como los eiC.
   2. Limpie el equipo de muestreo y aislamiento de tejidos (tijeras quirúrgicas, tijeras finas rectas y afiladas, pinzas estándar lisas rectas, pinzas finas con acabado de espejo, pinzas curvas y espátula, placa de espuma de poliestireno y agujas para fijación) con un desinfectante (por ejemplo, etanol al 70%).
2. Protocolos de muestreo
   1. Determinar el orden de muestreo.
      1. Recolectar sangre inmediatamente después de la decapitación en tubos EDTA de 1 ml preenfriados (ver paso 2.2.3).
      2. Retire todo el cerebro y congele inmediatamente después de la extracción. Este paso tomará 1−2 min. Almacene los cerebros congelados a -80 °C para su posterior procesamiento (véase el paso 2.2.2).
      3. Extraer los órganos periféricos de interés (por ejemplo, pulmón, corazón, hígado), dentro de los 5 minutos posteriores a la extracción del cerebro, y congelar y almacenar a -80 °C para su posterior procesamiento (ver paso 2.2.4).
   2. Extirpar el cerebro para procedimientos de disección o punzonado. Este procedimiento dura de 1 a 2 minutos/cerebro.
      1. Después de la decapitación (ver paso 1.2), comience a hacer una incisión en la línea media en la piel con tijeras finas. Libera el cráneo volteando la piel sobre los ojos. Llegue a la parte superior del cráneo y haga una pequeña incisión caudal comenzando a nivel del hueso intraparietal. Evite cortar a través del cerebro.
      2. Corte firmemente a través de la parte más anterior del cráneo entre los ojos para facilitar la extirpación del cerebro. Incline un lado del hueso parietal usando pinzas curvas de patrón estrecho y rompa. Repita el último paso para el otro lado.
      3. Retire las meninges cerebrales. Deslice una espátula debajo de la parte anterior del cerebro (es decir, el bulbo olfatorio) e incline el cerebro suavemente hacia arriba. Deslice la espátula más abajo para romper la óptica y otros nervios craneales.
      4. Levante el cerebro del cráneo y congele todo el cerebro inmediatamente en una placa de metal preenfriada (-80 ° C) con el lado ventral frente a la placa de metal (dorsal hacia arriba).
      5. Permita que los cerebros se congelen completamente y se transfieran a tubos de 5 ml preenfriados y almacenen a -80 °C hasta la disección de las regiones cerebrales o el procedimiento de punzonado (ver pasos 3.1. y 3.2).
   3. Realizar muestreo por plasma.
      1. Tubos de EDTA preenfriados con espiga con 10 μL de dilución de indometacina recién preparada a una concentración objetivo de 10 μM.
      2. Recolecte la sangre del tronco inmediatamente después de la decapitación apretando suavemente el cuerpo en tubos de EDTA preenfriados a un volumen máximo de sangre de 1 ml.
         NOTA: En caso de presión arterial adecuada, no se requiere apretar. Si el volumen de sangre es inferior a 1 ml, disminuya el tiempo de incubación de isoflurano para permitir un flujo sanguíneo adecuado.
      3. Centrifuga inmediatamente los tubos de sangre a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C.
      4. Eliminar la fase plasmática superior resultante y, a los efectos del análisis multilípido, los volúmenes plasmáticos definidos alícuotas en tubos preenfriados de 2 ml de la siguiente manera: 50 μL para el análisis de eCB/EICs, 30 μL para el análisis de PL y el volumen plasmático restante como muestra de respaldo o para otros tipos de análisis.
      5. Almacene las muestras de plasma a -80 °C para su posterior extracción (véanse los pasos 4.1.2 y 4.1.4).
   4. Realizar muestreo de órganos periféricos.
      NOTA: Utilice referencias de anatomía del ^ratón16 y documentación proporcionada para los cursos obligatorios (FELASA) a los que asisten los investigadores de animales para identificar los órganos individuales, sus tejidos conectivos y / o vasos sanguíneos.
      1. Inmovilice el torso del ratón para facilitar la extracción de órganos con agujas. Haga una incisión ventral en la línea media con una tijera recta y afilada a la altura del pubis. Use fórceps estándar contundentes para fijar la pared abdominal mientras corta para abrir la cavidad abdominal.
      2. Inmovilizar la piel para permitir la extirpación de órganos abdominales con fórceps contundentes. Para la extirpación del corazón o los pulmones, continúe con el corte medial en la dirección de la cueva mamaria. Retire el pulmón y/o el corazón con fórceps finos.
      3. Abra la cavidad mamaria con cuidado para evitar el sangrado. Corte los tejidos conectivos y los vasos sanguíneos que anclan el órgano respectivo sin cortar a través del órgano.
      4. Transfiera las piezas de tejido inmediatamente en placas de metal preenfriadas (-80 ° C) y deje que se congelen por completo. Transfiera las piezas de tejido a tubos preenfriados y guárdelas a -80 °C para su posterior procesamiento (consulte el paso 4.1).

3. Procesamiento biológico de materiales

NOTA: Para la coextracción de eCBs/EICs utilice tubos de ámbar de 2 ml como tubos de extracción y agregue en cada tubo siete bolas de acero preenfriadas. Para la coextracción de PL/eCB y para la coextracción dual de lípidos y ARN, utilice 2 ml de tubos de extracción libres de RNAse con perlas de cerámica (Tabla de materiales).

1. Realizar la disección cerebral y el procesamiento de órganos periféricos.
   NOTA: Use lámparas de aumento para aumentar la visibilidad del cerebro para la disección.
   1. Limpie las herramientas quirúrgicas, incluidas las pinzas con puntas súper finas, 2x con etanol al 70%.
   2. Transfiera los cerebros congelados de -80 ° C a una placa de Petri que contenga un tampón fisiológico preenfriado (pH 5.5) Asegúrese de que la placa de Petri esté a 4 ° C. Permita que los cerebros se descongelen por completo para permitir la disección. Pruebe cuidadosamente con fórceps.
      PRECAUCIÓN: No mantenga los cerebros a 4 °C más de lo necesario para la descongelación.
   3. Preenfríe una placa de metal sobre hielo (4 °C) y cúbrala con tejidos húmedos empapados en tampón fisiológico helado (pH 5.5) y transfiera el cerebro con el lado ventral hacia arriba cuidadosamente sobre una placa de metal preenfriada (4 °C) sobre hielo. Cúbralo con tejidos húmedos empapados en tampón fisiológico helado (pH 5.5).
   4. Disecciona las regiones del cerebro en un máximo de 5 minutos usando pinzas de punta súper fina. Comience con el hipotálamo (HYP) y gire el lado dorsal hacia arriba para continuar con el lado derecho. Aislar el hipocampo (HCr), la corteza prefrontal (PFCr), el cuerpo estriado (STRr) y la corteza cerebral (cCTXr). Luego disecciona el lado izquierdo. Aislar el hipocampo (HCl), la corteza prefrontal (PFCl), el cuerpo estriado (STRl) y la corteza cerebral (cCTXl). Diseccionar el cerebelo y la región talámica. Utilizar referencias anatómicas ^{publicadas16,17} para la identificación de la región cerebral.
   5. Transfiera cada pieza diseccionada directamente sobre una placa de metal preenfriada cubierta de papel de aluminio (-80 °C). Permita la congelación y transfiera las regiones cerebrales aisladas en los tubos de 2 ml preenfriados etiquetados.
   6. Pulverizar las piezas de tejido utilizando un pulverizador de tejido (a -80 °C), evitando la descongelación del tejido. En la cámara frigorífica, polvo de tejido alícuota en tubos de extracción etiquetados y preenfriados que contengan perlas de cerámica o bolas de acero. Para el análisis dual de lipidómica/transcriptómica, pese las alícuotas de polvo tisular en la cámara frigorífica. Para el análisis de solo lipidómica, elija entre la normalización al peso del tejido o al contenido de proteínas. Para este último, proceda más sin pesar el tejido.
   7. Cortar los tejidos de los órganos periféricos en trozos con un peso máximo de 20 mg. Proceda con la pulverización del tejido como en el paso 3.1.6.
   8. Proceda a la extracción de muestras de tejido (véanse los pasos 4.1.1, 4.1.3 o 4.1.5) o almacene los tubos a -80 °C para su posterior extracción.
      NOTA: La matriz cerebral también se puede utilizar si el diseño del estudio lo permite. Sin embargo, el método es más adecuado para un número discreto y limitado de regiones cerebrales, y no es práctico diseccionar y aislar todas las regiones cerebrales mencionadas anteriormente dentro del marco de tiempo establecido.
2. Realiza puñetazos cerebrales.
   1. Monte los cerebros enteros y congelados en el sistema de montaje (Tabla de materiales) en el criostato. Ajuste el grosor a 50 μm y corte en modo de recorte cerca de la región de interés.
   2. Tinción de corte cerebral (18−20 μm) utilizando azul de toluidina (0,1%−1%) como referencia para localizar la subregión de interés. Inspeccione las rodajas teñidas con un microscopio para identificar las regiones de interés a perforar. Utilice un atlas de ratones como referencia para encontrar las regiones anatómicas cerebrales ^apropiadas16. Tome punzones con un diámetro de 0.8−1.0 mm usando perforadores de muestra en tubos preenfriados.
   3. Pese los punzones congelados en la cámara frigorífica en tubos de extracción de 2 ml etiquetados y preenfriados que contengan perlas de cerámica o bolas de acero. Utilice tubos de ámbar para la coextracción de eCB y EICs.
   4. Comience la extracción (consulte los pasos 4.1.1, 4.1.3 o 4.1.5) o almacene los tubos a -80 °C para una extracción posterior.
3. Realizar el procesamiento de plasma.
   1. Coloque las muestras de plasma congeladas sobre hielo (4 °C) y déjelas descongelar (~20 min).
   2. Asegúrese de que el plasma esté completamente descongelado antes de comenzar la extracción.
   3. Continúe con el procedimiento de extracción de plasma (véanse los pasos 4.1.2 o 4.1.4).
      NOTA: Las muestras de plasma deben permanecer a -80 °C hasta la extracción. Evite los ciclos de descongelación y recongelación.

4. Procedimientos de extracción

1. Llevar a cabo protocolos de coextracción de lípidos líquido-líquido (LLE).
   1. Realice la extracción conjunta de eCB y EICs de piezas cerebrales, punzones o muestras de polvo de tejido.
      NOTA: Se requiere un pipeteo preciso durante todo el procedimiento.
      1. Coloque los tubos de extracción que contienen las muestras de tejido y siete bolas de acero sobre hielo (4 °C). Añadir 600 μL de MTBE helado y 50 μL de ACN/_H2O (1:1; v/v) que contengan las normas internas. La concentración objetivo de las normas internas en el volumen final para el análisis (50 μL) es la siguiente: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 y 5 ng/mL para PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 y TXB2-d4, respectivamente.
      2. Añadir 400 μL de ácido fórmico 0,1 M y homogeneizar con un lisario tisular (30 s-1 min). Centrifugar el homogeneizado durante 15 min a 5.000 x g a 4 °C. Permita la congelación de la fase inferior acuosa durante 10 min a -80 °C para facilitar la transferencia de la fase orgánica superior.
      3. Transferir la fase orgánica en tubos nuevos. Evaporar bajo una corriente suave de _N2 a 37 °C y reconstituir en 50 μL de ACN/_H2O (1:1; v/v) para su posterior análisis.
      4. Guarde la fase acuosa a -20 °C o -80 °C para un análisis adicional del contenido de proteínas.
   2. Realizar co-extracción de eCBs y eiCs de muestras de plasma.
      1. Descongelar las alícuotas plasmáticas a 4 °C. Añádanse 800 μL de MTBE y 50 μL de ACN/_H2O (1:1; v/v) que contengan las normas internas (análogas a las utilizadas para el análisis de tejidos, véase el paso 5.1.1). Optimice la concentración estándar interna para el aumento utilizando muestras de plasma de referencia.
      2. Añadir 600 μL de ácido fórmico de 0,1 M y muestras de vórtice a 4 °C durante 2 min. Muestras de centrífugas a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C.
      3. Transfiera la fase orgánica a nuevos tubos, evapore bajo una corriente suave de _N2 a 37 °C y reconstituya en 50 μL de ACN/_H2O (1:1; v/v) para el análisis LC/MRM.
         NOTA: Si es posible, evite el almacenamiento de extractos secos de eIC y proceda inmediatamente al análisis LC/MRM. Si no se puede evitar el almacenamiento, recurra al almacenamiento a corto plazo durante solo 2-3 días a 4 ° C con muestras en disolvente de inyección LC.
   3. Realice la coextracción de PL y eCB de regiones cerebrales, punzones u otras muestras de polvo de tejido.
      1. Coloque los tubos de extracción que contienen las muestras de tejido y las perlas de cerámica sobre hielo (4 °C). Añadir 800 μL de MTBE/MeOH (10:3; v/v) y 10 μL de MeOH que contengan las normas internas. La concentración objetivo de las normas internas en el volumen final para el análisis (100 μL) es la siguiente: 150 ng/mL para PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; Salmos 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 y 3 ng/mL PEA-d4 respectivamente.
      2. Añadir 200 μL de ácido fórmico al 0,1% que contenga 25 μM de tetrahidroliptatina/URB597 y 50 μg/ml de BHT. Homogeneizar con el homogeneizador tisular (Tabla de Materiales) y centrifugar a 5.000 x g y 4 °C durante 15 min.
      3. Recuperar la fase orgánica superior en nuevos tubos y evaporar bajo una corriente suave de _N2 a 37 °C. Reconstituir en 90 μL de MeOH y conservar a -20 °C o -80 °C o continuar con el siguiente paso.
      4. Añadir 10% de _H2O a una alícuota de extracto lipídico (4.1.3.3) e inyectar 10 μL en el análisis lc/MS para PL. Para un análisis adicional de eCB, continúe con el paso 4.3.5.
      5. Tomar una alícuota del extracto (4.1.3.3), evaporar a sequedad y reconstituir en ACN/_H2O (1:1; v/v). Utilice 20 μL para la inyección de LC/MS para el análisis de eCB.
   4. Realizar la coextracción de PL y eCB de muestras de plasma.
      1. Descongelar las alícuotas plasmáticas a 4 °C, añadir 1.000 μL de MTBE/metanol (10:3; v/v) y 10 μL de MeOH que contengan normas internas (análogas al paso 4.1.3) y vórtice a 4 °C durante 1 min.
      2. Añadir 250 μL de _H2O y vórtice durante 45 min a 4 °C. Muestras de centrífugas durante 15 min a 5.000 x g y 4 °C. Recupere la fase orgánica superior, evapore bajo una corriente suave de _N2 a 37 ° C y reconstituya en 90 μL de metanol para un análisis adicional de LC / MS. Conservar a -20 °C o -80 °C o continuar con el siguiente paso.
      3. Para el análisis de PL, agregue agua al 10% a una alícuota de extracto de lípidos (4.1.2.2).
      4. Para el análisis de eCB, agregue agua al 10% a una alícuota del extracto de lípidos (ver 4.1.4.3), evapore hasta la sequedad y reconstituya en 50% ACN/_H2O (1:1; v/v).
   5. Realizar extracción dual de ARN y lípidos (co-extracción de PL y eCBs) a partir de muestras de tejido.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de trabajar en condiciones libres de ARN para evitar la degradación del ARN.
      1. Descongele las alícuotas de polvo de tejido o racimos cerebrales (a 4 °C) y agregue 600 μL de tampón RLT que contenga 5 μM THL/URB597, 10 μg/mL BHT y 1% β-mercaptoetanol (para porcentajes del volumen final del tampón de homogeneización, consulte el paso 4.1) junto con 200 μL de cloroformo a tubos de extracción que contengan punzones cerebrales congelados y perlas de cerámica.
      2. Muestras de espiga con 10 μL de mezcla estándar interna para PL y coextracción de eCB (ver paso 4.1.3) y homogeneizar a través de homogeneizador tisular (alta velocidad, 20 s).
      3. Transfiera lisados a nuevos tubos de centrífuga y centrífuga durante 5 minutos a toda velocidad y 4 °C para permitir la separación de fases.
      4. Recupere y utilice la fase superior para la extracción de ARN utilizando kits de procedimiento de extracción de ARN estándar (Tabla de materiales). Arn de Elute en un volumen total de 50 μL de agua libre de RNasa y almacenar a -80 °C.
         NOTA: La muestra en el paso 4.1.5.4 es susceptible tanto para la secuenciación de ARN como para la qPCR utilizando los métodos y la instrumentación apropiados.
      5. Utilice la fase inferior que contiene cloroformo para la extracción de lípidos. Añadir 800 μL de MTBE/metanol (10:3; v/v) y 200 μL de ácido fórmico al 0,1% y vórtice durante 45 min a 4 °C. Recuperar la fase orgánica superior y evaporar bajo una corriente suave de _N2 a 37 °C.
      6. Reconstituir en 90 μL de metanol para un análisis adicional de LC/MS. Conservar a -20 °C o -80 °C o continuar con el paso 5.
      7. Añadir 10% de _H2O a una alícuota de extracto lipídico (ver paso anterior 4.1.5.6) e inyectar 10 μL en el lc/MS para el análisis de PL. Para un análisis adicional de eCB, continúe con el paso 5.7.
      8. Tome una alícuota del extracto (ver paso anterior 4.1.5.6) evaporar a sequedad y reconstituir en ACN/_H2O (1:1; v/v). Utilice 20 μL para la inyección de LC/MS para el análisis de eCB (análogo al paso 4.3.5).

5. Elaboración de perfiles cualitativos y cuantitativos LC/MRM

1. Preparar sistemas de disolventes LC, soluciones de calibración y muestras de control de calidad.
   1. Para los PL, prepare la fase móvil A: metanol/agua (1:1; v/v) que contenga 7,5 mM de formiato de amonio y 0,1% de TEA. Preparar la fase B móvil: metanol/isopropanol (2:8; v/v) que contiene 7,5 mM de formiato de amonio y 0,1% de TEA. Almacene los disolventes en botellas LC.
   2. Para la separación de eCB y eiC, prepare los siguientes disolventes LC: 0,1% de ácido fórmico como fase A móvil y 100% de ACN que contenga 0,1% de ácido fórmico como fase B móvil. Almacene los disolventes en botellas LC.
   3. Preparar controles de calidad utilizando los estándares de calibración y estándares internos (Tabla 3) en una concentración equimolar o definida por el usuario.
   4. Preparar curvas de calibración con siete puntos de concentración. Utilice el mismo lote estándar interno para aumentar el pico en la solución de curva de calibración y en las muestras que se van a analizar.
2. Utilice el método LC-MRM para el perfil lipídico cualitativo y cuantitativo.
   1. Abra la pestaña Método de adquisición de compilación en el software comercial (por ejemplo, Analista) y seleccione el modo LC/MRM con conmutación de polaridad. Establezca en el método las transiciones de iones (como se indica en la Tabla 3) para la elaboración de perfiles cuantitativos. Establezca el tiempo de asentamiento en 50 ms.
   2. Para la elaboración de perfiles de PL, establezca los siguientes parámetros de fuente de iones: gas de cortina = 40 psi; temperatura del calentador de la fuente = 550 °C; voltaje de pulverización de iones = -4.500 V en modo de iones negativos y = + 5.200 V en modo de iones positivos.
   3. Para el coanálisis de eCB y EIC, establezca los siguientes parámetros: gas cortina = 40 psi; temperatura del calentador de la fuente = 550 °C; voltaje de pulverización de iones = -4.500 V en modo de iones negativos y = + 4.500 V en modo de iones positivos.
   4. Para el análisis PL, ajuste el calentamiento de la columna a 45 °C y el caudal a 200 μL/min y establezca el siguiente gradiente: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B, y min 52 = 40% B. Ajuste el volumen de inyección a 10 μL.
   5. Para el análisis de eCB y EICs, establezca la temperatura de la columna a temperatura ambiente y establezca el siguiente gradiente: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Ajuste el volumen de inyección a 20 μL.
      NOTA: Las condiciones de MRM pueden variar entre las plataformas instrumentales, por lo tanto, las condiciones de fragmentación y MRM deben inferirse experimentalmente y los parámetros de ionización deben probarse y ajustarse si es necesario para obtener la máxima sensibilidad y selectividad.
3. Realizar análisis de lotes.
   1. Abra el lote de adquisición de compilación y complete los parámetros necesarios para la descripción de la muestra, la ubicación en el bastidor de muestra del muestreador automático y el método de adquisición (establecido como paso 5.2).
   2. Incluya siempre controles de calidad al principio y al final del análisis y dentro del lote. Después de cada 25-30 muestras, incluya al menos tres curvas de calibración dentro del lote e incluya un paso de lavado con un disolvente de elección después de cada muestra de control de calidad, curva de calibración y al final del lote de muestra.
   3. Transfiera muestras obtenidas en el paso 4 en viales de LC/MS. Coloque las muestras en los bastidores de carga del muestreador automático LC de acuerdo con la posición definida en el lote y cargue el bastidor de muestras en el muestreador automático LC.
   4. Envíe el análisis de lotes e inicie la cola.
4. Cuantificación lipídica
   1. Utilice el software comercial (por ejemplo, Analyst) y el módulo de cuantificación integrado para la cuantificación de eCB y EICs y el software comercial (por ejemplo, Multiquant) para la cuantificación de PL.
      NOTA: El segundo software también se puede utilizar para eCB y eIC, particularmente cuando se utiliza un estándar interno para la cuantificación de múltiples analitos.
   2. Abra el método de cuantificación build y complete los parámetros para analitos, estándares internos, transiciones MRM y asigne los estándares internos a los analitos que se cuantificarán (Tabla 3). Establezca la altura mínima del pico en 500 cps.
   3. Utilizar los siguientes criterios o combinación de los mismos para la asignación de la identidad lipídica y la posterior ^{cuantificación6}: correspondencia del tiempo de retención de los analitos endógenos lipídicos con los estándares de calibración y/o normas internas deuteradas, cuando estén disponibles; coincidencia de iones de fragmentos por fragmentación en modo de iones positivos y negativos para un m/z dado de analitos lipídicos para los que no se proporcionan normas; comportamiento de elución inferido por la literatura de lípidos en condiciones de LC empleadas de manera similar para diseccionar estructuras isoméricas y/o isobáricas; y, cuando esté disponible, análisis LC/MS y MS/MS con espectrometría de masas de alta resolución, utilizando condiciones lc similares a las del análisis dirigido (utilizando LC/MRM), para identificar con precisión la identidad y el comportamiento de elución de lípidos endógenos de ^{interés18,19}.
   4. Para la validación del análisis de lotes, utilice los siguientes criterios: precisión de la cuantificación ≤ ±20%; coeficiente de regresión ≥0,97 (idealmente ≥0,99).
      NOTA: Siga las pautas para el desarrollo y validación de métodos bioanalíticos para garantizar un análisis confiable y reproducible de las moléculas objetivo.

Resultados

El conjunto de protocolos descritos puede combinarse en diferentes niveles de una manera específica para cada objetivo, como la elección del modelo animal, la ruta de muestreo, el método de extracción y la elaboración de perfiles (Figura 1).

Con el fin de determinar los cambios en el nivel de lípidos en el cerebro y la periferia a lo largo de un curso de tiempo de un estado de crisis epilépti...

Discusión

La metodología neurolipidómica y transcriptómica descrita aquí es un medio viable para investigar cualquier enfermedad o desarrollo saludable a alta y baja resolución espacial en el cerebro y los órganos periféricos. Debido a los procedimientos optimizados de muestreo y manejo de plasma, el análisis lipidómico plasmático también se puede llevar a cabo a partir de los mismos animales sacrificados para lipidómica tisular y transcriptómica, mejorando así la confiabilidad de los correlatos moleculares de la san...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12(S)-HETE	Biomol	Cay10007248-25	Lipid Std
12(S)-HETE-d8	Biomol	Cay334570-25	Lipid Std
1200 series LC System	Agilent		Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer	Agilent		Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8	Biomol	Cay 334230	Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler	Applied Biosystems		Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes	Eppendorf		Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
Analytical balance	Mettler Toledo		Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard	Biomol	Cay-10007277	Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer	Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)		Instrumentation/Sample prep.
Bino	Zeiss		Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody	Cellsignaling	9661S	Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S	Leica Biosystems		Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler	CTC Analytics AG		Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7	FST	11271-30	Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)	FST	11252-00	Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen	Kabe Labortechnik	078001	Sample Prep.
EP-1 EconoPump	BioRAD	700BR07757	Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish	FST	11412-11	Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp	FST	14094-11	Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight	FST	14568-09	Surgical Tools
Iris Spatulae	FST	10094-13	Surgical Tools
Kainic acid	Abcam	ab120100	Epileptic drug
Lipid View software	AB SCIEX, Darmstadt		Software
LPC 17:0	Avanis Polaris	855676P	Lipid Std
LPC 18:0	Avanis Polaris	855775P	Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column	Phenomenex	00D-4446-B0	Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp	Maul GmbH		Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%	Honeywell	9814920	Solvent/LCMS
Motic Camara	Motic		Microscopy
MTBE	Honeywell	34875-1L	Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package	AB SCIEX, Darmstadt		Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermo Scientific		Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1	Avanis Polaris	840857P	Lipid Std
PA 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1404	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide	Biomol	Cay90350-100	Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5	Biomol	Cay9000573-5	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 16:0-18:1	Avanis Polaris	850457P	Lipid Std
PC 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1004	Lipid Std
PE 16:0-18:1	Avanis Polaris	850757P	Lipid Std
PE 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1104	Lipid Std
PG 16:0-18:1	Avanis Polaris	840457P	Lipid Std
PG 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1204	Lipid Std
PI 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1504	Lipid Std
Precelleys 24	Peqlab		Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen	Peqlab	91-pcs-ck14p	Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm	Peqlab	91-PCS-MK28P	Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm	VWR	91-PCS-CK14	Sample Prep.
Prostaglandin D2	Biomol	Cay 12010	Lipid Std
Prostaglandin D2-d4	Biomol	Cay 312010	Lipid Std
Prostaglandin E2	Biomol	Cay10007211-1	Lipid Std
Prostaglandin E2-d9	Biomol	Cay10581-50	Lipid Std
PS 17:0-14:1	Avanis Polaris	LM-1304	Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS	AB SCIEX	AU111609004	Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System	Appliert Biosystem		Instrumentation/qPCR
Resolvin D1	Biomol	Cay10012554-11	Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)	Qiagen	79254	Sample Prep.
Security Guard precolumn	Phenomenex		Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates	Thermo Fisher	72110017	Microscopy
Shandon slide rack and lid	Thermo Fisher	73310017	Microscopy
SM 18:0	Avanis Polaris	860586P	Lipid Std
SM d18:1/12:0	Avanis Polaris	LM-2312	Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth	FST	11016-17	Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern	FST	14130-17	Surgical Tools
T3000 Thermocycler	Biometra		Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2	Biomol	Cay19030-5	Lipid Std
Thromboxane B2-d4	Biomol	Cay319030-25	Lipid Std
Tissue Lyser II	Qiagen/ Retsch	12120240804	Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek	Sakura Finetek	4583	Microscopy
Toluidinblau	Roth	0300.2	Microscopy
Vapotherm	Barkey	4004734	Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv	VWR	9814920	Solvent/LCMS