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摘要

提出了一种利用合成生物学技术合成一套细菌生物传感器来分析枪弹残留物的方案, 并利用荧光光谱法测试这些器件的预期用途的功能。

摘要

Microbcop 是一种生物传感器, 专为法医化学中的独特应用而设计。Microbcop 是一个由三个器件组成的系统, 当一起使用时, 可以通过在存在三种关键分析物 (锑、铅和 gsr 的有机成分) 的情况下产生荧光信号来指示枪弹残留物 (GSR) 的存在。该协议描述了使用大肠杆菌(大肠杆菌) 合成生物传感器的方法, 以及用于评估传感器选择性和灵敏度的分析化学方法。该系统的功能是通过使用从废墨盒外壳内部收集的 GSR 来证明的。一旦准备好, 生物传感器就可以储存到需要, 并可以作为这些关键分析物的测试。所有三种分析物的阳性反应为 GSR 提供了推定阳性测试, 而每个设备都有检测其他样品中的分析物的应用 (例如, 饮用水中铅污染检测器)。系统的主要限制是正信号所需的时间;未来的工作可能涉及研究不同的生物体, 以优化反应时间。

引言

生物传感器是指使用生物成分 (如蛋白质、核酸或整个生物体) 产生可用于检测化学物质或分析物的反应的任何分析装置。例如, 在20世纪的大部分时间里, 煤矿业都使用生物传感器来检测有毒矿井气体的存在: 煤矿1中的金丝雀。矿工们观察到生物生物 (金丝雀) 对化学分析物 (一氧化碳) 的反应 (死亡或痛苦), 以保护工人。在一个更现代和复杂的例子中, 细菌可以使用合成生物学技术通过显示特定的反应 (如荧光蛋白的表达) 来改变某些化学分析物的存在。

合成生物学是一个宽泛的术语, 指的是构建不自然存在的生物装置和系统, 或为特定目的重新设计现有的生物系统2。合成生物学是通过标准方法与基因工程区分开来的, 并存在可用于合成设备和系统的标准化部件(标准合成生物学遗传元素)。一个部分被引入到一个装置的基因组中, 一个生物, 如细菌, 以表达某种特征, 作为功能的指示。例如, 在许多合成设备中, 荧光蛋白的表达作为报告蛋白被引入单个细胞生物体。多个设备可以组合到一个系统中。细菌等微生物的基因组很容易以这种方式操作。在过去十年的文献中, 文献中报道了许多针对各种化学分析物的生物传感器的例子。

在这项工作中, 米机器人警察系统是一个生物传感器设计的合成生物学软件的例子, 在法医和环境化学中的新应用。Microbcop 是一个由三个独立的设备组成的系统, 当结合在一起时, 将允许大肠杆菌在从一个人的手或表面收集到的枪弹残留物 (gsr) 的情况下表达红色荧光蛋白 (RFP)。这三个器件中的每一个都对已知为 GSR5成分的特定化学分析物做出响应。系统响应的三种分析物为 I. 2、4、6-三硝基甲苯 (TNT) 及相关化合物, II。铅 (以铅离子的形式), 和 III。锑 (也以离子的形式)。

GSR 由许多不同的化学物质组成, 但通常用于鉴定残渣的三种物质是钡、铅和锑5。GSR 鉴定的标准证据测试是使用具有能量色散 x 射线荧光 (EDX) 5 的扫描电子显微镜 (SEM).Sem edx 使分析师能够识别 GSR 的独特形态和元素成分。目前, 有很少广泛使用的二元推定测试可用。最近公布的一项推定测试使用离子-流动性光谱仪 (IMS), 这是许多实验室可能无法使用的专用设备。也有一些颜色的 "斑点" 测试可以使用, 虽然他们通常用于距离确定或 GSR 识别弹孔和伤口5。此外, 文献中对使用伏安分析的 GSR 电化学测试的关注有限, 该测试具有可能具有现场便携式或阳极剥离伏安法的优点, 这是一种极具实用性的方法。对金属元素的敏感方法7。在专门为检测 GSR 而设计的生物传感器的文献中, 很少提及, 尽管已经出版了一些用于其他法医应用的生物传感器.

M工商科普系统中每个装置的生物元素以及质粒结构如图 1所示。图 1b中的弯曲箭头表示在分析物存在下激活的启动子区域, 椭圆形是允许翻译报告人蛋白质的核糖体结合位点, 标记为 rfp 的灰色框是表达红色的基因荧光蛋白和红色八角形是转录终止位点。这三种设备都将作为检测 GSR 的系统一起使用。每个具有特定启动子 (SbRFP、PbRFP 和 TNT-RFP) 的设备都将与正在测试的样本一起孵育, 并测量 RFP 的荧光。只有在存在适当的化学分析物并激活启动子区域的情况下, 才会表达 RFP。设计了三个对 GSR 中存在的一些化学物质做出反应的装置, 并在这项工作中介绍了这些装置。

三个 microbcop 装置中使用的促进剂是砷和锑敏感启动子sbrfp9,10、铅敏感启动子、pbrfp11、12和 tnt 敏感启动子,TNT-RFP13. 由于文献中的搜索显示, 没有旨在对钡做出反应的启动子, 因此选择了 tnt 启动子, 因为该启动子对一些结构相关的化合物 (特别是 2, 4-二硝基甲苯和是 GSR 中留下的有机化合物的一部分。该启动子已成功地用于专门检测埋地地雷13中 TNT 和 2, 4-dinitlutolene (2, 4-DNT) 的微量。将这三个器件作为一个系统结合使用, GSR 的阳性测试将在所有三个器件中产生荧光。只有一个或两个器件中的荧光信号将表明分析物的另一个环境来源, 或者在 TNT 启动子的情况下, 由不是 GSR 中留下的有机化合物的化合物激活。通过同时使用这三种设备, 最大限度地减少了由于环境来源而产生假阳性结果的可能性。无铅弹药越来越受欢迎, 在美国仍然只占弹药销售的5% 左右;因此, 由于缺乏铅而产生的假阴性结果可能是有可能的, 但在使用铅作为 GSR14 标记的传感器中仍然有用。除了这种特定的法医应用外, 每个设备还可以单独用于检测环境污染物。

所提出的协议包括用于创建器件的合成生物学技术 (传感器细菌) 和用于检查设备功能和分析所获得的荧光信号的分析技术。该议定书还包括以手擦的形式收集法医证据, 从嫌疑人手中收集 GSR, 或擦拭从表面收集 GSR。铅传感器装置的结果作为示例结果, 并演示了使用乏墨盒外壳对 GSR 进行的阳性测试。

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研究方案

注: 介绍了表达 RFP 的大肠杆菌的合成。

1.大肠杆菌质粒 dna 的制备

  1. 解冻大肠杆菌含有具有 rfp 基因和抗氨匹西林基因的质粒, 并在37°c 时在含有100Μml 氨匹西林的尿液 (lb) 琼脂板上生长大肠杆菌, 时间为 24小时. 例如, 使用用于合成生物学的标准生物部件登记册中的 J10060 质粒 (见材料表)。J10060 质粒包括在 pBad 启动子区域控制下的 RFP (红色荧光蛋白) 基因和抗氨匹西林基因。或者, 在 lb 琼脂板上生长之前, 用质粒转换大肠杆菌 (见步骤 3.2)。
  2. 遵循标准的微制备协议 (见材料表), 从含有 j10060 质粒的大肠杆菌培养物的1毫升中分离出 dna。下面的协议的目的是删除 pBad 启动子, 并将其替换为设备所需的启动子。
  3. 在质粒小准备后, 将 DNA 储存在冰柜中, 直到准备消化。

2. 限制性酶消化

  1. 在用于 Ecri 和 NheI 消化的微离心管中建立以下反应: j10060 质粒 DNA 10Μl (在步骤1中分离)、8μl 水, 以及每种与1μl 缓冲液预混的1μl 酶 (见材料表)。
  2. 对于启动子 DNA, 在用于 Ecri 和 NheI 消化的微离心管中建立以下反应: 退火启动子 DNA 序列 10μl (8μl 的水, 每个 Ecri 和 NheI 酶的 1Μl, 分别与1Μl 的缓冲液混合。
    1. 对于 sb、pb-或 TNT-RFP (见材料表), 在缓冲液中溶解寡核苷酸 (30 MM hepes, ph 7.5; 100 mm 醋酸钾), 在相等的摩尔浓度下孵育, 加热到 94°c 2分钟, 并在室温下逐渐冷却)。
  3. 将样品轻轻向上和向下移液, 将移液器设置为10μl。
  4. 在37°c 下孵化30分钟。
  5. 在80°c 时将酶失活5分钟。
  6. 将消化过的 DNA 存放在冰柜中, 直到为下一步做好准备。

3. 结扎和转化

  1. 结扎
    1. 在步骤2中, 利用 Ec物 ri 和 NheI 双重消化的质粒和启动子 DNA, 将表 1所示反应混合物建立在冰上的微离心管中;最后添加 T4 DNA 连接酶。
      注:表 1显示了使用1:3 向量插入的连接, 用于指定的 dna 大小。
    2. 通过上下移液和微型离心机轻轻混合反应。
    3. 在室温下孵化10分钟。
    4. 在65°c 下热失活10分钟。
  2. 转型
    1. 在冰上解冻含有20μl 的 DH5-Α合格大肠杆菌细胞的管,直到最后一个冰晶消失。
    2. 在细胞混合物中加入5μl 质粒 dna。仔细轻触管4-5 次, 将细胞和 DNA 混合。
    3. 将混合物放在冰上2分钟。
    4. 在42°c 时的热冲击正好为30秒。不要混在一起。
    5. 在冰上放置2分钟。不要混在一起。
    6. 将移液器388μl 的室温 SOC 放入混合物中。立即扩散到含有氨匹西林 (100μgml) 的 LB 琼脂板上, 在37°c 下孵育过夜。
    7. 检查24小时内的板材生长。
    8. 用密封膜密封盘子, 存放在冰箱里, 直到准备好下一步。

4. 群体 PCR

  1. 在 PCR 管中加入表2所示的反应混合物 (设置4个反应管)。
  2. 通过上下移液轻轻混合反应。
  3. 使用黄色的移液器尖端, 刮伤一个菌落 (或非常小的区域) 的转化大肠杆菌。将此大肠杆菌的刷子转移到一个新的 lbp 琼脂板上, 该板已被切割, 然后将移液器尖端插入 PCR 管中。摇摇移液器尖端, 将大肠杆菌与 PCR 混合。对其他菌落再重复三次。将 PCR 管转移到 PCR 机器, 并使用表 3所示的程序开始热循环。
  4. 运行凝胶电泳使用2% 琼脂糖凝胶在 TAE, 以确定哪些菌落有最好的结扎到质粒, 并在一个新的板上生长这些菌落。
  5. 将盘子存放在冰箱里, 直到准备好进行测试。在尿草汤中制备液体培养物, 加入100μml 氨匹西林进行化学测试。

5. DNA 测序

  1. 对于每个样品, 加入5Μl 质粒、4μl 测序引物和3μl 去离子水。
  2. 将这种混合物放入试管中, 并将其用于 DNA 测序 (参见材料表)。
  3. 分析 DNA 序列数据, 使用 DNA 序列分析软件比较预期和观察到的 DNA 序列, 以确保没有突变, 并正确插入基因。
    注: 使用大肠杆菌作为化学传感器如下。

6.大肠杆菌培养物的制备

  1. 用100μgml 氨匹西林制备用于液体培养的 LB。
  2. 准备传感器细菌的液体培养、阳性对照 * 细菌和阴性控制 * * 细菌。
    注: * 阳性对照菌:含有质粒的大肠杆菌, 其 rfp 基因由本构启动子控制;本工作采用了合成生物学标准生物部件登记册中的质粒 E1010 (见材料表)。
    * * 阴性对照细菌: 含有质粒的大肠杆菌, rfp 基因受不同启动子的控制, 如 pbad 启动子 (来自合成生物学标准生物部件登记册的质粒 j10060) (见材料) 或没有 rfp 基因的质粒。
  3. 将培养物放入37°c 和220转/分的晃动孵化器中, 最低 8小时, 最高 18小时. 多云肉汤表示细菌生长。

7. 滴定大肠杆菌检查设备的功能

注: 对传感器进行滴定以检查功能后, 不需要重复此步骤。以添加铅、锑和 2, 4-DNT 或 1, 3-dinitro照相机 (1, 3-DNB) 的形式进行积极控制, 可以检查每次使用的设备的功能, 而不需要完全滴定。

  1. 在水中浓度为 10 ppm 的情况下, 准备感兴趣的分析物的库存溶液。如果溶解度是个问题, 请使用 50/水/甲醇混合物。
  2. 以表 4为指导, 标记适当数量的无菌培养管, 并将培养的肉汤的2毫升 (从协议步骤 6) 放入每个管。
    注: 为了确定一般的分析范围, 对传感器细菌至少做三个不同级别的分析物, 用负控制做一个层次, 用正控制做一个层次。每个没有添加金属的细菌也应该有一个管 (另一种类型的负控制)。要更准确地确定检测的分析范围和范围, 请使用更大范围的分析物浓度。
  3. 如表4所示, 在含有 2毫升肉汤的管中加入分析物库存溶液, 将卡扣盖放在培养管上, 使其松动 (以允许空气流入培养管), 并使培养管产生涡流。
  4. 将卡扣盖松散地放在培养管上, 放置在220转/分和37°c 的晃动孵化器中, 时间至少为24小时。
  5. 从孵化器中取出管子, 将瓶盖紧紧地扣在管子上, 并将管子存放在冰箱中, 直到准备好进行荧光分析。

8. 使用大肠杆菌作为 gsr 的化学传感器

  1. 使用用于去除铅的基于乙醇的擦拭 (参见材料表), 擦拭手的所有表面, 包括手指之间的表面。对每只手使用单独的擦拭。将湿巾存放在贴有适当标签的可密封袋中, 直到进行分析。
  2. 对于要测试的表面: 对大型表面使用含酒精的擦拭, 或对小表面使用用乙醇润湿的棉签。
    注: 为了显示传感器对 GSR 的反应, 用乙醇湿棉签擦拭了一个用0.40 口径的弹壳的内部。
  3. 戴干净的手套, 使用用酒精清洗过的剪刀, 从擦拭的中心剪下大约1厘米2的部分。
  4. 将手擦拭或棉签的切割件直接放入含有2毫升传感器细菌的培养管中, 确保其淹没在肉汤中。
  5. 按照上述步骤7.4–7.5 中所述的进行。

9. 使用便携式光谱仪进行荧光分析 (见材料表)

  1. 用涡旋搅拌机摇管。
  2. 准备光谱仪, 为您的 RFP 变种收集荧光发射, 其激发波长为500纳米。
  3. 使用鲁里亚汤记录一个空白光谱。
  4. 小心地将每个上清液转移到一个小体积的立方, 并收集排放强度。

10. 使用96孔板读取器进行荧光分析 (见材料表)

  1. 用涡旋搅拌机摇管。
  2. 将肉汤的200毫升转移到井盘中的井。记录哪些样本进入了盘子的每口井。
  3. 设置荧光仪, 以收集 RFP 变体在适当波长处的发射强度。

11. 数据分析

  1. 使用从所有阴性对照 (RFP 阴性菌或传感器细菌, 不添加分析物) 获得的信号, 计算背景的平均荧光信号。
  2. 从获得的传感器细菌的每个荧光信号中减去平均背景信号, 以获得背景校正荧光强度。
  3. 通过将背景校正后的荧光强度除以平均背景信号来估计信噪比 (S/n)。如果 sn 比率大于 3, 则测试为正。

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结果

图 2显示了本文中使用的 rfp 变体的荧光光谱。这些数据来自 PbRFP 设备, 因为它响应铅和 TNT-RFP 设备, 因为它响应两个分析物, 2, 4-DNT 和 1, 3-DNB。这个图显示了一个负控制的光谱 (没有添加分析物), 并在两个不同层次的分析物添加的光谱。在 575 nm (激发波长 500 nm) 时观察到所使用的 RFP 变种的最大荧光信号。图 3中的数据代表了 pbrfp 设备的单个滴定实...

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讨论

修改和故障排除

表 4中描述的实验可以以任何适合已设计传感器的方式进行修改。化学传感器最重要的方面是评估其灵敏度和特异性。这是有益的, 以确保广泛的浓度分析分析, 以确定有用的分析范围的传感器。确定细胞的最大分析物水平也是值得的。由于本研究中使用的分析物是有毒金属 (Pb 和 Sb) 或甲醇溶液中的有机化合物 (用于 TNT 衍生物), 因此?...

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披露声明

作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突需要披露。

致谢

作者希望向 BIOL 324 (遗传学) 的 Longwood 大学的学生和 CHEM 403 (高级化学实验室问题解决) 中参与锑和铅生物传感器初步制备和测试的学生表示感谢。MicRoboCop 的想法是在 GCAT SynBIO 研讨会 (2014年夏季) 上提出的, 该讲习班由 NSF 和 Howard Hughes 医学院资助, 马里兰州巴尔的摩县大学主办。作者还感谢龙伍德大学的 Cook-coe 艺术与科学学院和 GCAT SynBio 校友赠款公司提供的资金。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,3-dinitrobenzene, 97%AldrichD194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97%Aldrich101397-5G
AgarFisher ScientificBP1423-500
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)Fisher ScientificSA450-100Standard in dilute HNO3
Cut Smart BufferNew England BioLabsB7204S
Duplex BufferIntegrated DNA Technologies11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction EnzymeNew England BioLabsR3101S
Ethanol, HPLC grade, denaturedAcros OrganicsAC611050040Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing KitsEurofins GenomicsSimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCRIntegrated DNA Technologies5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencingIntegrated DNA Technologies5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kitIBI ScientificIB47101
LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)Fisher ScientificSL21-100Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon WipesHygenall45NRCNSold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC gradeFisher ScientificA452-4Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cellsNew England BioLabsC2987I
NheI-HF Restriction EnzymeNew England BioLabsR3131S
Nuclease free waterNew England BioLabsB1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard BufferNew England BioLabsM0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biologyRegistry of Standard Biological Partshttp://parts.igem.org/Main_Page
Promoter SequencesIntegrated DNA TechnologiesSb promoter: 5’-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’
3’-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5’
Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGCG
AGCTAGCGCAT-3’
3’-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCACA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC
GTA-5’
TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT
CGACGAAACAACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3’
3’CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA
GCGTA5’
Reverse primer for colony PCRIntegrated DNA Technologies5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencingIntegrated DNA Technologies5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S

参考文献

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