Vorbereitung und Anwendung eines neuen bakteriellen Biosensors für die präventive Erkennung von Gunshot Residue

Zusammenfassung

Ein Protokoll wird mit synthetischen Biologie-Techniken vorgestellt, um eine Reihe von bakteriellen Biosensoren zur Analyse von Schussrückständen zu synthetischen Biologiesensoren zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetischen Sensoren zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisieren und die Funktionsweise der Geräte mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie auf ihren beabsichtigten Einsatz zu testen.

Zusammenfassung

MicRoboCop ist ein Biosensor, der für eine einzigartige Anwendung in der forensischen Chemie entwickelt wurde. MicRoboCop ist ein System, das aus drei Geräten besteht, die, wenn sie zusammen verwendet werden, das Vorhandensein von Schussrückständen (GSR) anzeigen können, indem sie ein Fluoreszenzsignal in Anwesenheit von drei Schlüsselanalyten (Antimon, Blei und organische Komponenten der GSR) erzeugen. Das Protokoll beschreibt die Synthese der Biosensoren mit Escherichia coli (E. coli) und die analytischen Methoden der Chemie, mit denen die Selektivität und Empfindlichkeit der Sensoren bewertet wird. Die Funktionsweise des Systems wird durch die Verwendung von GSR aus dem Inneren eines verbrauchten Patronenhülers gesammelt. Nach der Vorbereitung können die Biosensoren bis zum Bedarf gespeichert und als Test für diese Schlüsselanalysen verwendet werden. Eine positive Resonanz aller drei Analyten liefert einen voraussichtlichen positiven Test für GSR, während jedes einzelne Gerät Anwendungen zur Erkennung der Analyten in anderen Proben (z.B. ein Detektor für Bleikontamination im Trinkwasser) hat. Die Haupteinschränkung des Systems ist die Zeit, die für ein positives Signal erforderlich ist; In Zukunft kann es sein, verschiedene Organismen zu untersuchen, um die Reaktionszeit zu optimieren.

Einleitung

Ein Biosensor ist jedes Analysegerät, das biologische Komponenten (wie Proteine, Nukleinsäuren oder ganze Organismen) verwendet, die eine Reaktion erzeugen, die zur Erkennung einer chemischen Substanz oder eines Analyten verwendet werden kann. Zum Beispiel nutzte der Kohlebergbau einen Biosensor für einen Großteil des 20^. Jahrhunderts, um das Vorhandensein giftiger Minengase zu erkennen: Den Kanarienvogel in der Kohlemine¹. Die Reaktion des biologischen Organismus (Tod oder Bedrängnis) auf einen chemischen Analyten (Kohlenmonoxid) wurde von den Bergarbeitern beobachtet, um die Arbeiter zu schützen. In einem moderneren und ausgeklügelteren Beispiel können Bakterien mit synthetischen Biologie-Techniken verändert werden, um auf das Vorhandensein eines bestimmten chemischen Analyten zu reagieren, indem eine spezifische Reaktion, wie die Expression eines fluoreszierenden Proteins, angezeigt wird.

Die synthetische Biologie ist ein breiter Begriff, der sich auf den Bau biologischer Geräte und Systeme bezieht, die nicht auf natürliche Weise existieren, oder auf die Neugestaltung bestehender biologischer Systeme für einen bestimmten Zweck². Die synthetische Biologie unterscheidet sich von der Gentechnik durch eine Standardmethodik und das Vorhandensein standardisierter Teile (Standard-synthetische Biologie-genetische Elemente), die zur Synthese von Geräten und Systemenverwendet werden können. Ein Teil wird in das Genom eines Gerätes,eines Organismus wie eines Bakteriums, eingeführt, um ein bestimmtes Merkmal auszudrücken, das als Funktionsindikation dienen wird. So wird bei vielen synthetischen Geräten der Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins als Reporter-Protein in einen einzigen zellenden Organismus eingeführt. Mehrere Geräte können zu einem Systemkombiniert werden. Die Genome von Mikroorganismen wie Bakterien lassen sich auf diese Weise leicht manipulieren. In den letzten zehn Jahren wurden in der Literatur zahlreiche Beispiele von Biosensoren berichtet,^dieauf eine Vielzahl^chemischerAnalyten zugeschnitten sind.

In dieser Arbeit wird das MicRoboCop-System als Beispiel für einen Biosensor präsentiert, der mit synthetischen Biologie-Techniken mit neuartigen Anwendungen in der forensischen und ökologischen Chemie entwickelt wurde. MicRoboCop ist ein System von drei separaten Geräten, die, wenn sie kombiniert werden, es Escherichia coli ermöglichen, rotes fluoreszierendes Protein (RFP) in Anwesenheit von Schussrückständen (GSR) auszudrücken, die aus den Händen einer Person oder einer Oberfläche gesammelt wurden. Jedes der drei Geräte reagiert auf einen spezifischen chemischen Analyten, der als Bestandteil von GSR⁵bekannt ist. Die drei Analyten, auf die das System reagiert, sind I. 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) und verwandte Verbindungen, II. Blei (in Form von Blei-Ionen), und III. Antimon (auch in Form von Ionen).

GSR besteht aus vielen verschiedenen chemischen Substanzen, aber die drei, die normalerweise verwendet werden, um einen Rückstand zu identifizieren, wie GSR sind Barium, Blei und Antimon⁵. Der Standard-Nachweistest zur Identifizierung von GSR ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit energiedispergierender Röntgenfluoreszenz (EDX)5. SEM-EDX ermöglicht es Analysten, die einzigartigen Morphologie und die Elementarkomponenten der GSR zu identifizieren. Derzeit gibt es nur wenige weit verbreitete binäre Anmaßungstests zur Verfügung. In einem kürzlich veröffentlichten Präsenztest wird die Ionenbewegungsspektroskopie (IMS) verwendet, die spezialisierte Geräte ist, die in vielen Labors⁶nicht verfügbar sein könnten. Es gibt auch ein paar farbige "Spot"-Tests, die verwendet werden können, obwohl sie in der Regel für die Distanzbestimmung oder für die GSR-Identifikation auf Einschusslöchern und Wunden 5 verwendet werden. Darüber hinaus gab es in der Literatur eine begrenzte Aufmerksamkeit für elektrochemische Tests für GSR, die voltammetrische Analyse, die den Vorteil hat, dass potenziell Feld tragbar ist, oder anodic Stripping Voltammetry, die eine extrem Empfindliche Methode für metallische Elemente⁷. In der Literatur von Biosensoren, die speziell für die Erkennung von GSR entwickelt wurden, wird nur sehr wenig erwähnt, obwohl einige Biosensoren für andere forensische Anwendungen veröffentlicht wurden^8.

Die biologischen Elemente für jedes Gerät im MicRoboCop-System und die Plasmid-Konstruktion sind in Abbildung1 dargestellt. Der geschwungene Pfeil in Abbildung 1b stellt die Promoter-Region dar, die in Anwesenheit des Analyten aktiviert wird, das Oval ist die ribosomale Bindungsstelle, die die Übersetzung des Reporter-Proteins ermöglicht, die graue Box mit der Bezeichnung RFP ist das Gen, das Rot drückt Fluoreszierendes Protein, und das rote Achteck ist die Transkriptionsabbruchstelle. Alle drei Geräte werden zusammen als System zur Erkennung von GSR eingesetzt. Jedes Gerät mit einem bestimmten Promoter (SbRFP, PbRFP und TNT-RFP) wird mit der Probe, die getestet wird, inkubiert und die Fluoreszenz von RFP wird gemessen. RFP wird nur dann zum Ausdruck gebracht, wenn der entsprechende chemische Analyt vorhanden ist und die Promoterregion aktiviert wird. Drei Geräte, die auf einige der in GSR vorhandenen chemischen Substanzen reagieren, wurden entworfen und werden in dieser Arbeit vorgestellt.

Die Promoter, die in den drei MicRoboCop-Geräten eingesetzt werden, sind ein arsen-und antimonempfindlicher Promoter, SbRFP 9 ^{, 10,}ein bleisensibler Promoter, PbRFP^11, 12und ein TNT-sensibler Promoter, TNT-RFP ¹³. Da eine Suche in der Literatur keinen Promoter ergab, der darauf reagiert, wurde stattdessen der TNT-Promoter ausgewählt, da dieser Promoter empfindlich auf eine Reihe von strukturell verwandten Verbindungen reagiert (insbesondere 2,4-Dinitrotoluene und Dinitrobenzol), die als Teil der organischen Verbindungen bekannt sind, die in der GSR zurückgelassen werden. Dieser Projektträger wurde erfolgreich eingesetzt, um in vergrabenen Landminen 13 Minenmengen von TNT und 2,4-Dinitrotoluol (2,4-DNT) gezielt zu erkennen^. Mit den drei Geräten gemeinsam als System wird ein positiver Test für GSR in allen drei Geräten Fluoreszenz erzeugen. Ein Fluoreszenzsignal in nur einem oder zwei Geräten zeigt eine andere Umweltquelle der Analyten oder im Fall des TNT-Promoters an, die Aktivierung durch eine Verbindung, die keine organische Verbindung ist, die in GSR zurückgelassen wird. Durch die gemeinsame Nutzung aller drei Geräte wird die Möglichkeit eines falschen positiven Ergebnisses aufgrund von Umweltquellen minimiert. Bleifreie Munition, die an Popularität gewinnt, macht immer noch nur etwa 5% des Munitionsverkaufs in den USA aus; Daher können falsche negative Ergebnisse aufgrund des Fehlens von Blei möglich sein, aber es gibt immer noch einen Nutzen in einem Sensor, der Blei als Markerfür GSR 14 verwendet. Zusätzlich zu dieser speziellen forensischen Anwendung kann jedes Gerät separat zur Erkennung von Umweltbelastungen eingesetzt werden.

Zu den vorgestellten Protokollen gehören die synthetischen Biologietechniken, mit denen die Geräte (Sensorbakterien) erstellt werden, und die Analysetechniken, um die Funktion der Geräte zu überprüfen und die erhaltenen Fluoreszenzsignale zu analysieren. Das Protokoll umfasst auch die Sammlung von forensischen Beweisen in Form von Handwischungen, um GSR aus den Händen eines Verdächtigen oder Swabbing zu sammeln, um GSR von einer Oberfläche zu sammeln. Die Ergebnisse des Bleisensor-Gerätes werden als Beispielresultate dargestellt, zusammen mit der Demonstration eines positiven Tests für GSR mit einem verbrauchten Patronengehäuse.

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Protokoll

NOTE: Synthese von E. coli Ausdruck RFP wird vorgestellt.

1. Zubereitung der Plasmid-DNA von E. coli

1. Tauen Sie E.coli , das ein Plasmid mit einem RFP-Gen und Ampicillin-Resistenz-Gen enthält, und wachsen Sie die E.coli auf Luria Broth (LB) Agarplatten, die 100 μg/mL Ampicillin bei 37 ° C für 24 Stunden enthalten. Verwenden Sie zum Beispiel das Plasmid J10060 aus der Registry der für die synthetische Biologie verwendeten Standardteile (siehe Materialtabelle). Das Plasmid J10060 enthält ein Gen für RFP (rotes Fluoreszenzprotein) unter der Kontrolle einer pBad Promoter-Region und ein Ampicillin-Resistenz-Gen. Alternativ können Sie E.coli (siehe Schritt 3.2) mit dem Plasmid vor dem Wachstum auf den LB-Bagar-Platten umwandeln.
2. Folgen Sie einem Standard-Miniprep-Protokoll (siehe Materialtabelle), um die DNA von 1 mL einer E. coli-Kultur zu isolieren, die das Plasmid J10060 enthält. Der Zweck des folgenden Protokolls ist es, den pBad Promoter zu entfernen und durch den gewünschten Promoter für das Gerät zu ersetzen.
3. Nach dem Plasmid-Miniprauch die DNA im Gefrierschrank aufbewahren, bis sie zur Verdauung bereit sind.

2. Restriction-Enzym Verdauung

1. Richten Sie die folgende Reaktion in einem Mikrozentrifugenrohr für die Verdauung von EcoRI und NheI ein: 10 μL von J10060 Plasmid DNA (isoliert in Schritt 1), 8 μL Wasser und 1 μL von EcoRI und NheI-Enzymen, die vorgemischt sind mit 1 μL Puffer (siehe Materialtabelle).
2. Für den Promoter DNA, die folgende Reaktion in einem Mikrozentrifugenrohr für EcoRI und NheI Verdauung: 10 μL von geglühten Promoter-DNA-Sequenzen (8 μL Wasser, und 1 μL von EcoRI und NheI-Enzymen, die vorgemischt mit 1 μL Puffer.
   1. Für Sb-, Pb-, Die Oligonukleotide im Puffer auflösen (30 mM HEPES, pH 7,5; 100 mM Kaliumacetat), Inkubat in gleichmäßigen molaren Konzentrationen, Wärme auf 94 ° C für 2 min und bei Raumtemperatur nach und nach abkühlen).
3. Mischen Sie die Proben, indem Sie die Proben vorsichtig nach oben und unten mit der Pipette auf 10 μL setzen.
4. 30 min bei 37 ° C in die Höhe treiben.
5. Hitze inaktivieren Sie die Enzyme bei 80 ° C für 5 min.
6. Bewahren Sie die verdaute DNA im Gefrierschrank auf, bis Sie für den nächsten Schritt bereit sind.

3. Ligation und Transformation

1. Verbindung
   1. Mit der Plasmid-und Promoter-DNA, die mit EcoRI und NheI in Schritt 2 doppelt verdaut wurde, setzte das Reaktionsgemisch, das in Tabelle 1 in einem Mikrozentrifugenrohr auf Eis gezeigt wird; Fügen Sie die T4 DNA Ligase zuletzt hinzu.
      Hinweis: Tabelle 1 zeigt eine Ligation mit einem molaren Verhältnis von 1:3 Vektor, die für die angegebenen DNA-Größen eingelegt werden.
   2. Die Reaktion sanft vermischen, indem man auf und ab pipettieren und kurz mikrozentrifugen.
   3. Bei Raumtemperatur 10 min einweichen.
   4. Hitze bei 65 ° C für 10 min inaktivieren.
2. Umwandlung
   1. Tauschen Sie ein Rohr mit 20 μL DH5-alpha-Kompetent E. coli-Zellen auf Eis, bis die letzten Eiskristalle verschwinden.
   2. Fügen Sie 5 μL Plasmid-DNA in das Zellgemisch ein. Die Röhre 4-5 mal vorsichtig flecken, um die Zellen und die DNA zu mischen.
   3. Die Mischung 2 min auf Eis legen.
   4. Hitzeschock bei exakt 42 ° C für exakt 30 s. Nicht mischen.
   5. 2 min auf Eis legen. Nicht mischen.
   6. Pipette 380 μL Raumtemperatur SOC in das Gemisch. Sofort auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (100 μg/mL) verteilen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
   7. Überprüfen Sie die Platten innerhalb von 24 Stunden auf Wachstum.
   8. Die Platten mit Dichtungsfolie versiegeln und im Kühlschrank aufbewahren, bis der nächste Schritt fertig ist.

4. Kolonie PCR

1. Fügen Sie die Reaktionsmischungen, die in Tabelle 2 gezeigt werden, in einPCR-Rohr (4 Reaktionsrohre einrichten) hinzu.
2. Die Reaktionen vorsichtig vermischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
3. Mit einer gelben Pipette-Spitze eine Kolonie (oder eine sehr kleine Region) des umgebauten E. coli abkratzen. Übertragen Sie einen Schwenk dieses E. coli auf eine neue LB/Ampicillin/Agar-Platte, die abgetrennt wurde, und legen Sie dann die Pipette-Spitze in das PCR-Rohr ein. Schütteln Sie die Pipettspitze, um den E. coli mit dem PCR-Mix zu mischen. Wiederholen Sie drei weitere Male für zusätzliche Kolonien. Übertragen Sie die PCR-Rohre auf eine PCR-Maschine und beginnen Sie mit dem Thermofahren mit dem Programm in Tabelle 3.
4. Führen Sie Gel-Elektrophorese mit einem 2%-Agrog-Gel in TAE aus, um festzustellen, welche Kolonien die beste Ligation in das Plasmid haben und wachsen Sie diese Kolonien auf einer neuen Platte.
5. Die Platten im Kühlschrank aufbewahren, bis sie zum Testen bereit sind. Bereiten Sie eine flüssige Kultur in der Luria-Brühe mit 100 μg/mL Ampicillin für chemische Tests.

5. DNA-Sequenzierung

1. Für jede Probe 5 μL Plasmid, 4 μL der Sequenzierungsgrundierung und 3 μL deionisiertes Wasser hinzufügen.
2. Legen Sie dieses Gemisch in ein Rohr und senden Sie es zur DNA-Sequenzierung (siehe Materialtabelle).
3. Analysieren Sie DNA-Sequenzdaten, um die zu erwartenden und beobachteten DNA-Sequenzen mit Hilfe von DNA-Sequenzanalyse-Software zu vergleichen, um sicherzustellen, dass es keine Mutation gibt und dass die Gene korrekt eingefügt wurden.
   Hinweis: Die Verwendung von E. coli als Chemikaliensensor wird unten dargestellt.

6. Zubereitung von E. coli-Kulturen

1. Bereiten Sie LB mit 100 μg/mL Ampicillin für flüssige Kulturen vor.
2. Bereiten Sie flüssige Kulturen der Sensorbakterien, die positiven Kontroll-*-Bakterien und die negative Kontrolle * * Bakterien vor.
   NOTE: * Positive Kontrollbakterien: E. coli, das ein Plasmid enthält, mit dem RFP-Gen unter Kontrolle eines konstitutiven Promoters; Plasmid E1010 aus der Registry der für die synthetische Biologie verwendeten Standardteile (siehe Materialtabelle) wurde bei dieser Arbeit verwendet.
   * * Negative Kontrollbakterien: E. coli, das ein Plasmid enthält, mit dem RFP-Gen unter Kontrolle eines anderen Promoters, wie dem pBad Promoter (Plasmid J10060 aus der Registry der für die synthetische Biologie verwendeten Standardteile (siehe Tabelle der Materialien) ) oder ein Plasmid, das nicht über das RFP-Gen verfügt.
3. Legen Sie die Kulturen bei 37 ° C und 220 U/min bei mindestens 8 Stunden, maximal 18 Stunden, in einen schüttelnden Brutkasten.

7. Titrierung E. coli, um die Funktion des Gerätes zu überprüfen

Hinweis: Sobald die Sensoren zur Überprüfung der Funktion zugeordnet sind, muss dieser Schritt nicht mehr wiederholt werden. Eine positive Steuerung in Form von Addition von Blei, Antimon, und 2,4-DNT oder 1,3-Dinitrobenzol (1,3-DNB) kann die Funktion der Geräte für jeden Einsatz überprüfen, ohne dass die volle Titration erforderlich ist.

1. Bereiten Sie eine Bestandslösung der Analysten (n) von Interesse bei einer Konzentration von 10 ppm in Wasser. Wenn es sich um eine Lösung handelt, verwenden Sie eine 50/50 Wasser-/Methanol-Mischung.
2. Mit der Tabelle 4 als Anleitung die entsprechende Anzahl steriler Kulturrohre kennzeichnen und Platz 2 mL der kultivierten Brühe (aus Protokollschritt 6) in jede Röhre geben.
   Hinweis: Um einen allgemeinen Analysebereich zu bestimmen, machen Sie mindestens drei verschiedene Ebenen eines Analyten mit den Sensorbakterien, eine Ebene mit der negativen Kontrolle und eine Ebene mit der positiven Kontrolle. Es sollte auch ein Rohr von jedem der Bakterien, die kein zusätzliches Metall hat (eine andere Art von negativer Kontrolle). Um den analytischen Bereich und die Grenzen der Erkennung genauer zu bestimmen, verwenden Sie eine größere Bandbreite an Analytenkonzentrationen.
3. Fügen Sie die Rohre mit 2 ml Brühe, wie in Tabelle 4erwähnt, mit Analytenlagerlösung fort, legen Sie die Schnappkappen auf die Kulturröhre, so dass sie locker sind (um den Luftstrom in die Röhre zu ermöglichen) und wirbeln Sie die Kulturröhre.
4. Die Schnappkappen locker auf den Kulturrohren lassen, bei 220 U/min in einen Schüttelinkubator und bei mindestens 24 Stunden 37 ° C in einen Schüttelinkel geben.
5. Entfernen Sie die Rohre aus dem Inkubator, schnappen Sie die Kappen fest auf die Rohre und lagern Sie die Rohre im Kühlschrank, bis die Rohre für die Fluoreszenzanalyse bereit sind.

8. Verwendung von E. coli als chemischer Sensor für GSR

1. Mit Hilfe eines Ethanol-basierten Wischs, der für das Entfernen von Blei konzipiert ist (siehe Materialtabelle), wischen Sie alle Oberflächen, auch zwischen den Fingern. Verwenden Sie für jede Hand eine separate Abwisches. Die Tücher in einem entsprechend gekennzeichneten Dichtungsbeutel bis zur Analyse lagern.
2. Für zu prüfende Oberflächen: Verwenden Sie eine alkoholhaltige Wische für große Oberflächen oder einen mit Ethanol befeuchteten Baumwollschwab für kleine Oberflächen.
   Hinweis: Um die Reaktion der Sensoren auf GSR zu demonstrieren, wurde das Innere eines verbrauchten 40 Kaliber-Patronenhauses mit einem Ethanol befeuchteten Wattestäbchen überzogen.
3. Mit sauberen Handschuhen und mit gesäuberter Schere, schneiden Sie einen ca. 1 cm² Abschnitt aus der Mitte des Wischens.
4. Das geschnittene Stück der Hand wischen oder den Baumwollschwab direkt in ein Kulturrohr legen, das 2 ml der Sensorbakterien enthält und so sicher ist, dass es in die Brühe eintaucht.
5. Gehen Sie wie oben beschrieben in den Schritten 7.4 – 7.5 vor.

9. Fluoreszenzanalyse mit tragbarem Spektrometer (siehe Materialtabelle)

1. Verwenden Sie einen Wirbelmischer, um die Rohre zu schütteln.
2. Bereiten Sie das Spektrometer vor, um Fluoreszenzemissionen auf der entsprechenden Wellenlänge für Ihre RFP-Variante mit einer Anregungswellenlänge von 500 nm zu sammeln.
3. Verwenden Sie die Luria-Brühe, um ein leeres Spektrum aufzunehmen.
4. Übertragen Sie jeden Supernatant vorsichtig auf eine Kleinserien und sammeln Sie die Emissionsintensität.

10. Fluoreszenzanalyse mit 96-Brunnenplattenleser (siehe Materialtabelle)

1. Verwenden Sie einen Wirbelmischer, um die Rohre zu schütteln.
2. 200 mL der Brühe auf einen Brunnen in der Brunnenplatte übertragen. Zeichnen, welche Proben in jeden Brunnen der Platte gingen.
3. Stellen Sie das Fluorimeter ein, um die Emissionsintensität an der entsprechenden Wellenlänge für die RFP-Variante zu erfassen.

11. Datenanalyse

1. Mit dem Signal, das aus allen negativen Kontrollen gewonnen wird (RFP-Negative Bakterien oder Sensorbakterien ohne zusätzliche Analyte), berechnen Sie ein durchschnittliches Fluoreszenzsignal für den Hintergrund.
2. Subtrahieren Sie das durchschnittliche Hintergrundsignal von jedem Fluoreszenzsignal, das für die Sensorbakterien gewonnen wird, um einen Hintergrund korrigierte Fluoreszenzintensität zu erhalten.
3. Schätzen Sie das Verhältnis von Signal-Rauschen (S/N), indem Sie den Hintergrund korrigierte Fluoreszenzintensität durch das durchschnittliche Hintergrundsignal teilen. Wenn das S/N-Verhältnis größer als 3 ist, ist der Test positiv.

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Ergebnisse

Fluoreszenzspektren für die RFP-Variante, die in dieser Arbeit verwendet wird, sind in Abbildung2 dargestellt. Diese Daten stammen vom PbRFP-Gerät, da es auf Blei und das TNT-RFP-Gerät reagiert, da es auf zwei Analyten reagiert, 2, 4-DNT und 1,3-DNB. Diese Abbildung zeigt das Spektrum einer negativen Kontrolle (kein Analyte hinzugefügt), und die Spektren auf zwei verschiedenen Ebenen der Analyse hinzugefügt. Das maximale Fluoreszenzsignal für die verwendete RFP-Vari...

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Diskussion

Änderungen und Fehlerbehebungen

Das in Tabelle 4 beschriebene Experiment kann in jeder Weise modifiziert werden, die den entworfenen Sensoren entspricht. Der wichtigste Aspekt eines chemischen Sensors ist die Bewertung seiner Empfindlichkeit und Spezifität. Es ist von Vorteil, dass eine Vielzahl von Konzentrationen des Analyten analysiert wird, um den nützlichen Analysebereich des Sensors zu bestimmen. Es lohnt sich auch, ein Maximum an Analyte für die Zel...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,3-dinitrobenzene, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97%	Aldrich	101397-5G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SA450-100	Standard in dilute HNO3
Cut Smart Buffer	New England BioLabs	B7204S
Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3101S
Ethanol, HPLC grade, denatured	Acros Organics	AC611050040	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit	IBI Scientific	IB47101
LB Broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SL21-100	Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes	Hygenall	45NRCN	Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific	A452-4	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cells	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3131S
Nuclease free water	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer	New England BioLabs	M0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology	Registry of Standard Biological Parts		http://parts.igem.org/Main_Page
Promoter Sequences	Integrated DNA Technologies		Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’
Reverse primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S