Preparazione e applicazione di un nuovo biosensore batterico per il rilevamento presuntivo di residui di arma da fuoco

Riepilogo

Un protocollo è presentato utilizzando tecniche di biologia sintetica per sintetizzare una serie di biosensori batterici per l'analisi dei residui di arma da fuoco, e per testare il funzionamento dei dispositivi per il loro uso previsto utilizzando la spettroscopia a fluorescenza.

Abstract

MicRoboCop è un biosensore che è stato progettato per un'applicazione unica nella chimica forense. MicRoboCop è un sistema costituito da tre dispositivi che, se utilizzati insieme, possono indicare la presenza di residui di arma da fuoco (GSR) producendo un segnale di fluorescenza in presenza di tre analiti chiave (antimonio, piombo e componenti organici di GSR). Il protocollo descrive la sintesi dei biosensori che utilizzano Escherichia coli (e. coli) e i metodi di chimica analitica utilizzati per valutare la selettività e la sensibilità dei sensori. Il funzionamento del sistema è dimostrato utilizzando GSR raccolti dall'interno di un involucro cartuccia esaurito. Una volta preparati, i biosensori possono essere conservati fino a quando necessario e possono essere utilizzati come test per questi analiti chiave. Una risposta positiva da tutti e tre gli analiti fornisce un test positivo presuntivo per GSR, mentre ogni singolo dispositivo ha applicazioni per rilevare gli analiti in altri campioni (ad esempio, un rivelatore per la contaminazione del piombo nell'acqua potabile). La limitazione principale del sistema è il tempo necessario per un segnale positivo; lavoro futuro può comportare lo studio di diversi organismi per ottimizzare il tempo di risposta.

Introduzione

Un biosensore è qualsiasi dispositivo analitico che utilizza componenti biologici (come proteine, acidi nucleici o interi organismi) che producono una risposta che può essere utilizzata per il rilevamento di una sostanza chimica o di un analita. Ad esempio, l'industria mineraria del carbone ha utilizzato un biosensore per gran parte del 20^° secolo per rilevare la presenza di gas minerari tossici: il canarino nella miniera di carbone¹. La risposta dell'organismo biologico (canarino) (morte o angoscia) ad un analita chimico (monossido di carbonio) è stata osservata dai minatori al fine di proteggere i lavoratori. In un esempio più moderno e sofisticato, i batteri possono essere alterati utilizzando tecniche di biologia sintetica per rispondere alla presenza di un determinato analita chimico esibendo una risposta specifica, come l'espressione di una proteina fluorescente.

La biologia sintetica è un termine generico che si riferisce alla costruzione di dispositivi biologici e sistemi che non esistono naturalmente, o la riprogettazione di sistemi biologici esistenti per uno scopo specifico². La biologia sintetica si distingue dall'ingegneria genetica da una metodologia standard e dall'esistenza di parti standardizzate (elementi genetici di biologia sintetica standard) che possono essere utilizzati per sintetizzare dispositivi e sistemi. Una parte viene introdotta nel genoma di un dispositivo, un organismo come un batterio, per esprimere un certo tratto che servirà come indicazione di funzione. Ad esempio, in molti dispositivi sintetici, l'espressione di una proteina fluorescente viene introdotta in un singolo organismo cellato come proteina reporter. È possibile combinare più dispositivi in un sistema. I Geniti di microrganismi come i batteri sono facili da manipolare in questo modo. Numerosi esempi di biosensori specifici per una vasta gamma di analiti chimici sono stati riportati in letteratura negli ultimi dieci anni,^3,4.

In questo lavoro, il sistema MicRoboCop è presentato come un esempio di un biosensore progettato utilizzando tecniche di biologia sintetica con nuove applicazioni in chimica forense e ambientale. MicRoboCop è un sistema di tre dispositivi separati che, quando combinati, permetteranno a Escherichia coli di esprimere la proteina fluorescente rossa (RFP) in presenza di residui di arma da fuoco (GSR) che sono stati raccolti dalle mani di una persona o da una superficie. Ciascuno dei tre dispositivi risponde a uno specifico analita chimico che è noto per essere un componente di GSR⁵. I tre analiti a cui il sistema risponde sono I. 2, 4, 6-trinitrotoluene (TNT) e i relativi composti, II. piombo (sotto forma di ioni di piombo), e III. antimonio (anche sotto forma di ioni).

GSR è costituito da molte sostanze chimiche diverse, ma i tre di solito utilizzati per identificare un residuo come GSR sono bario, piombo, e antimonio⁵. Il test probatorio standard per l'identificazione di GSR consiste nell'utilizzare la microscopia elettronica a scansione (SEM) con fluorescenza a raggi X a dispersione di energia (EDX)⁵. SEM-EDX consente agli analisti di identificare la morfologia unica e i componenti elementali di GSR. Attualmente, ci sono pochi ampiamente utilizzati test presuntivi binari disponibili. Un test presuntivo recentemente pubblicato utilizza la spettroscopia di mobilità ionica (IMS), che è un'apparecchiatura specializzata che potrebbe non essere disponibile in molti laboratori⁶. Ci sono anche alcuni test di colore "spot" che possono essere utilizzati, anche se sono tipicamente utilizzati per la determinazione della distanza o per l'identificazione GSR su fori di proiettile e ferite⁵. Inoltre, c'è stata una certa attenzione limitata nella letteratura per i test elettrochimici per GSR che impiegano l'analisi voltammetrica, che ha il vantaggio di essere potenzialmente in campo portatile, o anodico stripping voltammetria, che è un estremamente Metodo sensibile per gli elementi metallici⁷. Nella letteratura dei biosensori progettati specificamente allo scopo di rilevare la GSR è molto poca menzione, anche se alcuni biosensori per altre applicazioni forensi sono stati pubblicati⁸.

Gli elementi biologici per ogni dispositivo nel sistema MicRoboCop, e la costruzione del plasmide, sono illustrati in Figura 1. La freccia curva in Figura 1B rappresenta la regione promotrice che viene attivata in presenza dell'analita, l'ovale è il sito di legame ribosomiale che permette la traduzione della proteina reporter, la scatola grigia etichettata RFP è il gene che esprime il rosso proteina fluorescente, e l'ottagione rosso è il sito di terminazione della trascrizione. Tutti e tre i dispositivi saranno utilizzati insieme come un sistema per rilevare GSR. Ogni dispositivo con un promotore specifico (SbRFP, PbRFP e TNT-RFP) sarà incubato con il campione che viene testato e la fluorescenza di RFP sarà misurata. La RFP sarà espressa solo se l'analita chimico appropriato è presente e attiva la regione promotrice. Tre dispositivi che rispondono ad alcune delle sostanze chimiche presenti in GSR sono stati progettati e sono presentati in questo lavoro.

I promotori utilizzati nei tre dispositivi microbocop sono un promotore sensibile all'arsenico e all'antimonio , sbrfp^9,10, un promotore sensibile al piombo, pbrfp^11,12 e un promotore sensibile al TNT, TNT-RFP ¹³. poiché una ricerca in letteratura non ha rivelato alcun promotore progettato per rispondere al bario, il promotore di TNT è stato selezionato invece poiché questo promotore è sensibile a una serie di composti strutturalmente correlati (in particolare, 2, 4-dinitrotoluene e dinitrobenzene) che sono noti per essere una parte dei composti organici lasciati alle spalle in GSR. Questo promotore è stato utilizzato con successo per rilevare in modo specifico quantità minute di TNT e di 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) nelle miniere di terra sepolte¹³. Utilizzando i tre dispositivi insieme come un sistema, un test positivo per GSR produrrà fluorescenza in tutti e tre i dispositivi. Un segnale di fluorescenza in uno o due dispositivi indicherà un'altra fonte ambientale dell'analita (s) o nel caso del promotore di TNT, l'attivazione da parte di un composto che non è un composto organico lasciato alle spalle in GSR. Utilizzando tutti e tre i dispositivi insieme, la possibilità di un risultato falso positivo a causa di fonti ambientali è minimizzata. Le munizioni prive di piombo, che stanno guadagnando popolarità, rappresentano ancora solo il 5% delle vendite di munizioni negli Stati Uniti; quindi, risultati falsi negativi a causa dell'assenza di piombo può essere una possibilità, ma c'è ancora utilità in un sensore che utilizza il piombo come un marcatore per GSR¹⁴. Oltre a questa specifica applicazione forense, ogni dispositivo può essere utilizzato separatamente per individuare i contaminanti ambientali.

I protocolli presentati includono le tecniche di biologia sintetica utilizzate per creare i dispositivi (batteri del sensore) e le tecniche analitiche per controllare la funzione dei dispositivi e analizzare i segnali di fluorescenza ottenuti. Il protocollo include anche la raccolta di prove forensi sotto forma di pulizia a mano per raccogliere GSR dalle mani di un sospetto o di un tampone per raccogliere GSR da una superficie. I risultati del dispositivo con sensore di piombo sono presentati come risultati di esempio, insieme a una dimostrazione di un test positivo per GSR utilizzando un involucro cartuccia esaurito.

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Protocollo

Nota: viene presentata la sintesi di E. coli che esprime RFP.

1. preparazione del DNA plasmide da E. coli

1. Scongelare e . coli contenente un plasmide con un gene RFP e un gene di resistenza all'ampicillina e far crescere le piastre di agar e . coli on Luria brodo (lb) contenenti 100 μg/ml di ampicillina a 37 ° c per 24 ore. Ad esempio, utilizzare il plasmide J10060 dal registro delle parti biologiche standard utilizzate per la biologia sintetica (vedere tabella dei materiali). Il plasmide J10060 include un gene per la RFP (proteina rossa fluorescente) sotto il controllo di una regione promotrice di pBad e un gene di resistenza all'ampicillina. In alternativa, trasformare E. coli (fare riferimento al passo 3,2) con il plasmide prima della crescita sulle piastre di agar lb.
2. Seguire un protocollo di plasmidico standard (vedere la tabella dei materiali) per isolare il DNA da 1 ml di una coltura di E. coli che contiene il plasmide J10060. Lo scopo del seguente protocollo è quello di rimuovere il promotore di pBad e sostituirlo con il promotore desiderato per il dispositivo.
3. Dopo la Miniprep del plasmide, conservare il DNA nel congelatore fino a quando è pronto per la digestione.

2. digestione dell'enzima di restrizione

1. Impostare la seguente reazione in un tubo per microcentrifuga per la digestione EcoRI e NheI: 10 μL di DNA plasmide J10060 (isolato nel passaggio 1), 8 μL di acqua e 1 μL ciascuno degli enzimi EcoRI e NheI pre-miscelati con 1 μL di tampone (vedere tabella dei materiali).
2. Per il DNA del promotore, impostare la seguente reazione in un tubo per microcentrifuga per la digestione EcoRI e NheI: 10 μL di sequenze di DNA del promotore ricotto (8 μL di acqua e 1 μL di ciascuno degli enzimi EcoRI e NheI pre-miscelati con 1 μL di tampone.
   1. Per SB-, PB-, o TNT-RFP (vedere tabella dei materiali), sciogliere gli oligonucleotidi in tampone (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm acetato di potassio), Incubare in concentrazioni molari uguali, riscaldare a 94 ° c per 2 min, e gradualmente raffreddare a temperatura ambiente).
3. Miscelare i campioni pipettando delicatamente su e giù con la pipetta impostata su 10 μL.
4. Incubare per 30 min a 37 ° c.
5. Il calore inattiva gli enzimi a 80 ° c per 5 min.
6. Conservare il DNA digerito nel congelatore fino a quando non è pronto per il passo successivo.

3. legazione e trasformazione

1. Legatura
   1. Utilizzando il DNA plasmide e promotore che è stato doppio digerito con EcoRI e NheI nel passaggio 2, impostare la miscela di reazione mostrata nella tabella 1 in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio; aggiungere l'ultimo DNA ligase T4.
      Nota: la tabella 1 Mostra una legazione utilizzando un rapporto molare di 1:3 vettore da inserire per le dimensioni del DNA indicate.
   2. Mescolare delicatamente la reazione pipettando su e giù e microcentrifuga brevemente.
   3. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
   4. Inattivazione del calore a 65 ° c per 10 min.
2. trasformazione f
   1. Scongelare un tubo con 20 μL di DH5-Alpha cellule E. coli competenti sul ghiaccio fino a quando gli ultimi cristalli di ghiaccio scompaiono.
   2. Aggiungere 5 μL di DNA plasmide alla miscela cellulare. Scorrere con cautela il tubo 4-5 volte per mescolare le cellule e il DNA.
   3. Posizionare il composto su ghiaccio per 2 min.
   4. Shock termico a esattamente 42 ° c per esattamente 30 s. Non mescolare.
   5. Posto sul ghiaccio per 2 min. Non mescolare.
   6. Pipettare 380 μL di temperatura ambiente SOC nella miscela. Si diffonde immediatamente su una piastra di agar LB contenente ampicillina (100 μg/mL) e incubare durante la notte a 37 ° c.
   7. Controllare le piastre entro 24 h per la crescita.
   8. Sigillare le piastre con pellicola sigillante e conservare in frigorifero fino a quando non è pronto per il passo successivo.

4. PCR della Colonia

1. Aggiungere a un tubo PCR (impostare 4 tubi di reazione) le miscele di reazione mostrate nella tabella 2.
2. Mescolare delicatamente le reazioni pipettando su e giù.
3. Utilizzando una punta di pipetta gialla, rasare una Colonia (o regione molto piccola) dell' E. colitrasformato. Trasferire un colpo di questo E. coli su una nuova piastra lb/ampicillina/agar che è stata sezionata, quindi inserire la punta della pipetta nel tubo PCR. Agitare la punta della pipetta per miscelare l' E. coli con la miscela PCR. Ripeti altre tre volte per ulteriori colonie. Trasferire i tubi PCR in una macchina PCR e iniziare il cicli termici alternati utilizzando il programma mostrato nella tabella 3.
4. Eseguire elettroforesi gel utilizzando un gel di agarosio del 2% in TAE per determinare quali colonie hanno la migliore legazione nel plasmide e crescono quelle colonie su una nuova piastra.
5. Conservare le piastre in frigorifero fino a quando non sono pronte per il collaudo. Preparare una coltura liquida in brodo di Luria con 100 μg/mL di ampicillina aggiunto per i test chimici.

5. sequenziamento del DNA

1. Per ogni campione, aggiungere 5 μL di plasmide, 4 μL del primer di sequenziamento e 3 μL di acqua deionizzata.
2. Mettere questa miscela in un tubo e inviarlo per il sequenziamento del DNA (vedere tabella dei materiali).
3. Analizzare i dati della sequenza del DNA per confrontare le sequenze di DNA attese e osservate utilizzando il software di analisi della sequenza del DNA per garantire che non vi sia alcuna mutazione e che i geni siano stati inseriti correttamente.
   Nota: utilizzando E. coli come un sensore chimico è presentato di seguito.

6. preparazione delle colture di E. coli

1. Preparare LB con 100 μg/mL di ampicillina per colture liquide.
2. Preparare colture liquide dei batteri del sensore, i batteri di controllo positivo * e il controllo negativo * * batteri.
   Nota: * batteri di controllo positivo: E. coli contenenti un plasmide con il gene RFP sotto il controllo di un promotore costitutivo; plasmide E1010 dal registro delle parti biologiche standard utilizzate per la biologia sintetica (vedere tabella dei materiali) è stato utilizzato in questo lavoro.
   * * Batteri di controllo negativi: E. coli contenenti un plasmide con il gene RFP sotto il controllo di un promotore diverso, come il promotore di pbad (plasmide J10060 dal registro delle parti biologiche standard utilizzate per la biologia sintetica (cfr. tabella delle Materiali)) o un plasmide che non ha il gene RFP.
3. Collocare le colture in un incubatore a scuotimento a 37 ° c e 220 rpm per un minimo di 8 h, massimo 18 h. il brodo nuvoloso indica la crescita batterica.

7. titolazione E. coli per controllare la funzione del dispositivo

Nota: una volta che i sensori sono stati titolati per controllare la funzione, questo passaggio non deve essere ripetuto. Un controllo positivo sotto forma di aggiunta di piombo, antimonio, e 2, 4-DNT o 1, 3-dinitrobenzene (1, 3-DNB) può controllare la funzione dei dispositivi per ogni uso senza la necessità di una titolazione completa.

1. Preparare una soluzione di riserva degli analiti di interesse ad una concentrazione di 10 ppm in acqua. Se la solubilità è un problema, utilizzare una miscela di acqua/metanolo 50/50.
2. Utilizzando la tabella 4 come guida, etichettare il numero appropriato di tubi di coltura sterili e posizionare 2 ml del brodo coltivato (dal passaggio del protocollo 6) in ogni tubo.
   Nota: al fine di determinare un intervallo analitico generale, fare almeno tre diversi livelli di un analita con i batteri del sensore, un livello con il controllo negativo e un livello con il controllo positivo. Ci dovrebbe essere anche un tubo di ciascuno dei batteri che non ha aggiunto metallo (un altro tipo di controllo negativo). Per determinare con maggiore precisione l'intervallo analitico e i limiti di rilevazione, utilizzare una gamma più ampia di concentrazioni di analiti.
3. Aggiungere soluzione di stock di analita ai tubi contenenti 2 mL di brodo come indicato nella tabella 4, posizionare i tappi a scatto sul tubo di coltura in modo che siano allentati (per consentire il flusso d'aria nel tubo), e vortice il tubo di coltura.
4. Lasciando i tappi a scatto liberamente sui tubi di coltura, mettere in un incubatore agitazione a 220 giri/min e 37 ° c per almeno 24 h.
5. Rimuovere i tubi dall'incubatore, agganciare saldamente i tappi sui tubi e conservare i tubi nel frigorifero fino a quando non sono pronti per l'analisi della fluorescenza.

8. utilizzo di E. coli come sensore chimico per GSR

1. Utilizzando una salvietta a base di etanolo progettata per rimuovere il piombo (vedere tabella dei materiali), pulire tutte le superfici delle mani, anche tra le dita. Usa una salvietta separata per ogni mano. Conservare le salviette in una busta sigillabile opportunamente etichettata fino all'analisi.
2. Per le superfici da testare: utilizzare una salvietta a base di alcool per superfici di grandi dimensioni o un batuffolo di cotone inumidito con etanolo per piccole superfici.
   Nota: per dimostrare la risposta dei sensori alla GSR, l'interno di un involucro di cartuccia calibro 40 è stato scambiato con un tampone di cotone inumidito con etanolo.
3. Indossando guanti puliti e usando le forbici che sono state pulite con alcool, tagliare una sezione di circa 1 cm² fuori dal centro della salvietta.
4. Posizionare il pezzo tagliato della salvietta o il batuffolo di cotone direttamente in un tubo di coltura che contiene 2 mL dei batteri del sensore, assicurandosi che sia immerso nel brodo.
5. Procedere come descritto in precedenza nei passaggi 7,4 – 7,5.

9. analisi della fluorescenza mediante Spettrometro portatile (vedere tabella dei materiali)

1. Utilizzare un miscelatore Vortex per scuotere i tubi.
2. Preparare lo spettrometro per raccogliere l'emissione di fluorescenza alla lunghezza d'onda appropriata per la variante RFP con una lunghezza di eccitazione di 500 Nm.
3. Utilizzare il brodo Luria per registrare uno spettro vuoto.
4. Trasferire con cautela ogni supernatante a una cuvetta a basso volume e raccogliere l'intensità di emissione.

10. analisi della fluorescenza con lettore di piastre 96-well (vedere tabella dei materiali)

1. Utilizzare un miscelatore Vortex per scuotere i tubi.
2. Trasferire 200 mL di brodo ad un pozzo nella piastra ben. Registrare quali campioni sono andati in ogni pozzo della piastra.
3. Impostare il fluorimetro per raccogliere l'intensità di emissione alla lunghezza d'onda appropriata per la variante RFP.

11. analisi dei dati

1. Utilizzando il segnale ottenuto da tutti i controlli negativi (batteri RFP negativi o batteri sensore senza analita aggiunto), calcolare un segnale di fluorescenza media per lo sfondo.
2. Sottrarre il segnale di fondo medio da ogni segnale di fluorescenza ottenuto per i batteri del sensore per ottenere un'intensità di fluorescenza corretta in background.
3. Stimare il rapporto segnale/rumore (S/N) dividendo l'intensità di fluorescenza corretta in background per il segnale di fondo medio. Se il rapporto S/N è maggiore di 3, il test è positivo.

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Risultati

Gli spettri di fluorescenza per la variante RFP utilizzata in questo lavoro sono illustrati nella Figura 2. Questi dati sono dal dispositivo PbRFP in quanto rispondono al piombo e al dispositivo TNT-RFP in quanto rispondono a due analiti, 2, 4-DNT e 1, 3-DNB. Questa figura mostra lo spettro di un controllo negativo (nessun analita aggiunto), e gli spettri a due diversi livelli di analita aggiunto. Il segnale di fluorescenza massimo per la variante RFP utilizzata è stato ...

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Discussione

Modifiche e risoluzione dei problemi

L'esperimento descritto nella tabella 4 può essere modificato in qualsiasi modo appropriato ai sensori che sono stati progettati. L'aspetto più importante di un sensore chimico è quello di valutarne la sensibilità e la specificità. È utile garantire che un'ampia gamma di concentrazioni dell'analita venga analizzata per determinare l'utile intervallo analitico del sensore. Vale anche la pena di determinare un livello m...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,3-dinitrobenzene, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97%	Aldrich	101397-5G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SA450-100	Standard in dilute HNO3
Cut Smart Buffer	New England BioLabs	B7204S
Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3101S
Ethanol, HPLC grade, denatured	Acros Organics	AC611050040	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit	IBI Scientific	IB47101
LB Broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SL21-100	Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes	Hygenall	45NRCN	Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific	A452-4	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cells	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3131S
Nuclease free water	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer	New England BioLabs	M0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology	Registry of Standard Biological Parts		http://parts.igem.org/Main_Page
Promoter Sequences	Integrated DNA Technologies		Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’
Reverse primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S