Préparation et application d’un nouveau Biocapteur bactérien pour la détection présumée de résidus de balles

Résumé

Un protocole est présenté à l’aide de techniques de biologie synthétique pour synthétiser un ensemble de biocapteurs bactériens pour l’analyse des résidus de balles, et pour tester le fonctionnement des dispositifs pour leur utilisation prévue à l’aide de la spectroscopie par fluorescence.

Résumé

MicRoboCop est un biocapteur qui a été conçu pour une application unique en chimie médico-légale. MicRoboCop est un système composé de trois dispositifs qui, lorsqu’ils sont utilisés ensemble, peuvent indiquer la présence de résidus de balles (GSR) en produisant un signal de fluorescence en présence de trois analytes clés (antimoine, plomb et composants organiques de GSR). Le protocole décrit la synthèse des biocapteurs à l’aide d' Escherichia coli (E. coli) et les méthodes analytiques de chimie utilisées pour évaluer la sélectivité et la sensibilité des capteurs. Le fonctionnement du système est démontré par l’utilisation de GSR recueillies à l’intérieur d’un boîtier de cartouche usé. Une fois préparés, les biocapteurs peuvent être stockés jusqu’à ce que nécessaire et peuvent être utilisés comme un test pour ces analytes clés. Une réponse positive des trois analytes fournit un test présomptif positif pour le GSR, tandis que chaque dispositif individuel a des applications pour détecter les analytes dans d’autres échantillons (par exemple, un détecteur pour la contamination du plomb dans l’eau potable). La principale limitation du système est le temps nécessaire pour un signal positif; les travaux futurs peuvent impliquer l’étude de différents organismes pour optimiser le temps de réponse.

Introduction

Un biocapteur est un dispositif analytique qui utilise des composants biologiques (tels que des protéines, des acides nucléiques ou des organismes entiers) qui produisent une réponse qui peut être utilisée pour la détection d’une substance chimique ou d’un analyte. À titre d’exemple, l’industrie minière du charbon a utilisé un biocapteur pour une grande partie du XXe siècle pour détecter la présence de gaz toxiques pour les mines: le canari dans la mine de charbon¹. La réponse de l’organisme biologique (canari) (mort ou détresse) à un analyte chimique (monoxyde de carbone) a été observée par les mineurs afin de protéger les travailleurs. Dans un exemple plus moderne et sophistiqué, les bactéries peuvent être modifiées à l’aide de techniques de biologie synthétique pour répondre à la présence d’un certain analyte chimique en exposant une réponse spécifique, telle que l’expression d’une protéine fluorescente.

La biologie synthétique est un terme général qui fait référence à la construction de dispositifs et de systèmes biologiques qui n’existent pas naturellement, ou à la reconception des systèmes biologiques existants à des fins spécifiques². La biologie synthétique se distingue de l’ingénierie génétique par une méthodologie standard et l’existence de pièces normalisées (éléments génétiques de biologie synthétique standard) qui peuvent être utilisées pour synthétiser des dispositifs et des systèmes. Une partie est introduite dans le génome d’un dispositif, un organisme tel qu’une bactérie, pour exprimer un certain trait qui servira d’indication de fonction. Par exemple, dans de nombreux dispositifs synthétiques, l’expression d’une protéine fluorescente est introduite dans un organisme unicellulaire en tant que protéine reporter. Plusieurs appareils peuvent être combinés dans un système. Les génomes de microorganismes tels que les bactéries sont faciles à manipuler de cette manière. De nombreux exemples de biocapteurs spécifiques à un large éventail d’analytes chimiques ont été rapportés dans la littérature au cours de la dernière décennie^3,4.

Dans ce travail, le système MicRoboCop est présenté comme un exemple d’un biocapteur conçu à l’aide de techniques de biologie synthétique avec des applications nouvelles dans la chimie médico-légale et environnementale. MicRoboCop est un système de trois dispositifs distincts qui, lorsqu’ils sont combinés, permettront à Escherichia coli d’exprimer des protéines fluorescentes rouges (RFP) en présence de résidus de balles (GSR) qui ont été recueillis à partir des mains d’une personne ou d’une surface. Chacun des trois dispositifs répond à un analyte chimique spécifique qui est connu pour être un composant de GSR⁵. Les trois analytes auxquels le système répond sont I. 2, 4, 6-trinitrotoluène (TNT) et les composés apparentés, II. plomb (sous forme d’ions de plomb) et III. antimoine (également sous forme d’ions).

Le GSR est composé de nombreuses substances chimiques différentes, mais les trois habituellement utilisées pour identifier un résidu comme GSR sont le baryum, le plomb et l’antimoine⁵. Le test de preuve standard pour l’identification du GSR consiste à utiliser la microscopie électronique à balayage (SEM) avec la fluorescence des rayons X à dispersion d’énergie (EDX)⁵. SEM-EDX permet aux analystes d’identifier la morphologie unique et les composantes élémentaires du GSR. Actuellement, il y a peu de tests de présomption binaires largement utilisés disponibles. Un test présomptif publié récemment utilise la spectroscopie de mobilité ionique (IMS), qui est un équipement spécialisé qui pourrait ne pas être disponible dans de nombreux laboratoires⁶. Il y a aussi quelques tests de couleur "Spot" qui peuvent être utilisés, bien qu’ils soient généralement utilisés pour la détermination de la distance ou pour l’identification GSR sur les trous de balle et les plaies⁵. En outre, il y a eu une certaine attention limitée dans la littérature aux essais électrochimiques pour le GSR qui emploient l’analyse voltammétrique, qui a l’avantage de potentiellement être portable de champ, ou la voltammétrie anodique de décapage, qui est un extrêmement méthode sensible pour les éléments métalliques⁷. Il est très peu mentionné dans la littérature des biocapteurs conçus spécifiquement dans le but de détecter le GSR, bien que certains biocapteurs pour d’autres applications médico-légales ont été publiés⁸.

Les éléments biologiques de chaque dispositif du système MicRoboCop et de la construction du plasmide sont illustrés à la figure 1. La flèche incurvée de la figure 1b représente la région promotrice qui est activée en présence de l’analyte, l’ovale est le site de liaison ribosomique qui permet la traduction de la protéine reporter, la boîte grise étiquetée RFP est le gène qui exprime le rouge la protéine fluorescente, et l’octole rouge est le site de terminaison de transcription. Tous les trois appareils seront utilisés ensemble comme un système pour détecter GSR. Chaque dispositif avec un promoteur spécifique (SbRFP, PbRFP, et TNT-RFP) sera incubé avec l’échantillon qui est testé et la fluorescence de la DDP sera mesurée. La DDP ne sera exprimée que si l’analyte chimique approprié est présent et active la région promotrice. Trois dispositifs qui répondent à certaines des substances chimiques présentes dans le GSR ont été conçus et sont présentés dans ce travail.

Les promoteurs utilisés dans les trois dispositifs microbocop sont un promoteur sensible à l’arsenic et à l’antimoine, sbrfp^9,10, un promoteur sensible au plomb, pbrfp^11,12 et un promoteur sensible à la TNT, TNT-RFP ¹³. parce qu’une recherche dans la littérature n’a révélé aucun promoteur conçu pour répondre au baryum, le promoteur de TNT a été choisi à la place puisque ce promoteur est sensible à un certain nombre de composés structurellement apparentés (en particulier, 2,4-Dinitrotoluène et dinitrobenzène) qui sont connus pour être une partie des composés organiques laissés derrière dans le GSR. Ce promoteur a été utilisé avec succès pour détecter spécifiquement les quantités de minute de TNT et de 2,4-Dinitrotoluène (2,4-DNT) dans les mines terrestres enterrées¹³. En utilisant les trois appareils ensemble comme un système, un test positif pour le GSR produira la fluorescence dans les trois dispositifs. Un signal de fluorescence dans seulement un ou deux dispositifs indiquera une autre source environnementale de l’analyte (s) ou dans le cas du promoteur de TNT, activation par un composé qui n’est pas un composé organique laissé derrière dans le GSR. En utilisant les trois appareils ensemble, la possibilité de résultats faussement positifs dus à des sources environnementales est minimisée. Les munitions sans plomb, qui gagnent en popularité, ne représentent toujours que 5% des ventes de munitions aux États-Unis; par conséquent, de faux résultats négatifs en raison de l’absence de plomb peut être une possibilité, mais il ya encore utilité dans un capteur qui utilise le plomb comme marqueur pour GSR¹⁴. En plus de cette application légale spécifique, chaque appareil peut être utilisé séparément à des fins de détection des contaminants environnementaux.

Les protocoles présentés incluent les techniques de biologie synthétique utilisées pour créer les dispositifs (bactéries de capteur) et les techniques analytiques pour vérifier la fonction des dispositifs et pour analyser les signaux de fluorescence obtenus. Le protocole comprend également la collecte de preuves médico-légales sous forme d’essuyage à la main pour recueillir le GSR des mains d’un suspect ou d’un souillonnage pour collecter le GSR à partir d’une surface. Les résultats du dispositif du capteur de plomb sont présentés comme des résultats d’exemple, ainsi qu’une démonstration d’un test positif pour le GSR à l’aide d’un boîtier de cartouche usé.

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Protocole

NOTE: la synthèse de E. coli exprimant la DP est présentée.

1. préparation de l’ADN plasmidique de E. coli

1. Décongeler e. coli contenant un plasmide avec un gène de la DP et un gène de résistance à l’ampicilline et cultiver les plaques d’agar e. coli sur le bouillon Luria (lb) contenant 100 μg/ml d’ampicilline à 37 ° c pendant 24 h. Par exemple, utilisez le plasmide J10060 du registre des parties biologiques standard utilisées pour la biologie synthétique (voir le tableau des matériaux). Le plasmide J10060 comprend un gène pour la DDP (protéine fluorescente rouge) sous le contrôle d’une région promotrice de pBad et d’un gène de résistance à l’ampicilline. Alternativement, transformer E. coli (se référer à l’étape 3,2) avec le plasmide avant la croissance sur les plaques de gélose lb.
2. Suivre un protocole de miniprep standard (voir le tableau des matériaux) pour isoler l’ADN de 1 ml d’une culture E. coli qui contient le plasmide J10060. Le but du protocole suivant est de retirer le promoteur pBad et de le remplacer par le promoteur désiré pour l’appareil.
3. Après la miniprep de plasmide, stockez l’ADN dans le congélateur jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la digestion.

2. digestion enzymatique de restriction

1. Mettre en place la réaction suivante dans un tube à microcentrifugation pour la digestion EcoRI et NheI: 10 μL d’ADN plasmidique J10060 (isolé à l’étape 1), 8 μL d’eau et 1 μL d’enzymes EcoRI et NheI pré-mélangés avec 1 μL de tampon (voir tableau des matériaux).
2. Pour l’ADN du promoteur, mettre en place la réaction suivante dans un tube de microcentrifugation pour la digestion EcoRI et NheI: 10 μL de séquences d’ADN du promoteur recuit (8 μL d’eau, et 1 μL de chacune des enzymes EcoRI et NheI pré-mélangées avec 1 μL de tampon.
   1. Pour le SB-, PB-ou TNT-RFP (voir tableau des matériaux), dissoudre les oligonucléotides dans le tampon (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm acétate de potassium), incuber en concentrations molaires égales, chauffer à 94 ° c pendant 2 min, et refroidir graduellement à température ambiante).
3. Mélanger les échantillons en pipetant doucement vers le haut et vers le bas avec la pipette fixée à 10 μL.
4. Incuber pendant 30 min à 37 ° c.
5. La chaleur inactive les enzymes à 80 ° c pendant 5 min.
6. Stockez l’ADN digéré dans le congélateur jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’étape suivante.

3. ligature et transformation

1. Ligature
   1. En utilisant le plasmide et l’ADN promoteur qui ont été digérés à l’aide d’EcoRI et de NheI à l’étape 2, mettre en place le mélange réactionnel présenté dans le tableau 1 dans un tube de microcentrifugation sur glace; Ajouter la ligase de l’ADN T4 en dernier.
      NOTE: le tableau 1 montre une ligature utilisant un rapport molaire de 1:3 vecteur à insérer pour les tailles d’ADN indiquées.
   2. Mélanger doucement la réaction en pipetant de haut en bas et en microcentrifugation brièvement.
   3. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
   4. La chaleur inactive à 65 ° c pendant 10 min.
2. transformation
   1. Décongeler un tube avec 20 μL de cellules E. coli compétentes de DH5-alpha sur la glace jusqu’à ce que les derniers cristaux de glace disparaissent.
   2. Ajouter 5 μL d’ADN plasmidique dans le mélange cellulaire. Feuilleter soigneusement le tube 4-5 fois pour mélanger les cellules et l’ADN.
   3. Placer le mélange sur la glace pendant 2 min.
   4. Choc thermique à exactement 42 ° c pour exactement 30 s. Ne mélangez pas.
   5. Placer sur la glace pendant 2 min. Ne mélangez pas.
   6. Pipetter 380 μL de SOC de température ambiante dans le mélange. Étalez immédiatement sur une plaque de gélose LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) et incubez pendant la nuit à 37 ° c.
   7. Vérifiez les plaques dans les 24 h pour la croissance.
   8. Sceller les plaques avec du film d’étanchéité et les ranger dans le réfrigérateur jusqu’à ce que la prochaine étape soit prête.

4. PCR de la colonie

1. Ajouter à un tube PCR (mettre en place 4 tubes de réaction) les mélanges de réaction présentés dans le tableau 2.
2. Mélangez doucement les réactions en pipetant de haut en bas.
3. À l’aide d’une pointe de pipette jaune, gratter une colonie (ou très petite région) de la E. colitransformée. Transférez un balayage de ce E. coli sur une nouvelle plaque lb/ampicilline/agar qui a été coupée, puis insérez l’embout de la pipette dans le tube PCR. Agiter l’embout de la pipette pour mélanger le E. coli avec le mélange PCR. Répétez trois fois de plus pour les colonies supplémentaires. Transférer les tubes PCR sur une machine PCR et commencer le thermocyclisme à l’aide du programme illustré au tableau 3.
4. Exécutez l’électrophorèse sur gel à l’aide d’un gel d’d’agarose à 2% dans le TAE pour déterminer quelles colonies ont la meilleure ligature dans le plasmide et cultiver ces colonies sur une nouvelle plaque.
5. Rangez les plaques dans le réfrigérateur jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’essai. Préparer une culture liquide dans le bouillon de Luria avec 100 μg/mL d’ampicilline ajoutée pour les essais chimiques.

5. séquençage de l’ADN

1. Pour chaque échantillon, ajouter 5 μL de plasmide, 4 μL de l’apprêt de séquençage et 3 μL d’eau désionisée.
2. Placer ce mélange dans un tube et l’envoyer pour le séquençage de l’ADN (voir tableau des matériaux).
3. Analysez les données de séquences d’ADN pour comparer les séquences d’ADN attendues et observées à l’aide d’un logiciel d’analyse de séquences d’ADN afin de s’assurer qu’il n’y a pas de mutation et que les gènes ont été correctement insérés.
   Remarque: l’utilisation d' E. coli comme capteur chimique est présentée ci-dessous.

6. préparation des cultures E. coli

1. Préparer la LB avec 100 μg/mL d’ampicilline pour les cultures liquides.
2. Préparer les cultures liquides des bactéries du capteur, le contrôle positif * bactéries et le contrôle négatif * * bactéries.
   NOTE: * bactéries témoins positives: E. coli contenant un plasmide avec le gène RFP sous le contrôle d’un promoteur constitutif; le plasmide E1010 du registre des parties biologiques standard utilisées pour la biologie synthétique (voir le tableau des matériaux) a été utilisé dans ce travail.
   * * Bactéries témoins négatives: E. coli contenant un plasmide avec le gène RFP sous le contrôle d’un promoteur différent, tel que le promoteur pbad (plasmide J10060 du registre des parties biologiques standard utilisées pour la biologie synthétique (voir tableau des Matériaux)) ou un plasmide qui n’a pas le gène de la DP.
3. Placer les cultures dans un incubateur à agitation à 37 ° c et 220 RPM pour un minimum de 8 h, maximum de 18 h. le bouillon nuageux indique une croissance bactérienne.

7. titrant E. coli pour vérifier la fonction de l’appareil

Remarque: une fois que les capteurs ont été titrés pour vérifier la fonction, cette étape n’a pas besoin d’être répétée. Un contrôle positif sous forme d’addition de plomb, d’antimoine et de 2,4-DNT ou de 1,3-dinitrobenzène (1,3-DNB) peut vérifier la fonction des dispositifs pour chaque utilisation sans la nécessité de la titration complète.

1. Préparer une solution de stock de l’analyte (s) d’intérêt à une concentration de 10 ppm dans l’eau. Si la solubilité est un problème, utilisez un mélange eau/méthanol 50/50.
2. En utilisant le tableau 4 comme guide, étiqueter le nombre approprié de tubes de culture stériles et placer 2 ml du bouillon cultivé (à partir de l’étape de protocole 6) dans chaque tube.
   NOTE: afin de déterminer une plage analytique générale, faites au moins trois niveaux différents d’un analyte avec les bactéries de capteur, un niveau avec le contrôle négatif, et un niveau avec le contrôle positif. Il devrait également y avoir un tube de chacune des bactéries qui n’a pas de métal ajouté (un autre type de contrôle négatif). Pour déterminer plus précisément la portée analytique et les limites de détection, utilisez une plus grande gamme de concentrations d’analytes.
3. Ajouter la solution de stock d’analyte aux tubes contenant 2 mL de bouillon tel qu’indiqué dans le tableau 4, placer les capuchons de pression sur le tube de culture de sorte qu’ils soient desserrés (pour permettre le débit d’air dans le tube), et vortex le tube de culture.
4. En laissant les bouchons de pression lâchement sur les tubes de culture, placer dans un incubateur à agitation à 220 tr/min et 37 ° c pendant au moins 24 h.
5. Enlevez les tubes de l’incubateur, enclenchez fermement les capuchons sur les tubes et rangez les tubes dans le réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’analyse de fluorescence.

8. utilisation de E. coli comme capteur chimique pour GSR

1. À l’aide d’une lingette à base d’éthanol conçue pour enlever le plomb (voir tableau des matériaux), essuyez toutes les surfaces des mains, y compris entre les doigts. Utilisez un chiffon séparé pour chaque main. Rangez les lingettes dans une sac scellable dûment étiquetée jusqu’à l’analyse.
2. Pour les surfaces à tester: utiliser une lingette à base d’alcool pour les grandes surfaces ou un coton-tige humidifié avec de l’éthanol pour les petites surfaces.
   Remarque: pour démontrer la réponse des capteurs au GSR, l’intérieur d’un boîtier de cartouche de calibre 40 a été dégonflé avec un coton-tige humidifié à l’éthanol.
3. En portant des gants propres et en utilisant des ciseaux qui ont été nettoyés avec de l’alcool, coupez une section d’environ 1 cm² du centre de l’essuyage.
4. Placez la pièce coupée de la lingette à main ou le coton-tige directement dans un tube de culture contenant 2 mL des bactéries du capteur, en veillant à ce qu’elle soit immergée dans le bouillon.
5. Procédez comme décrit ci-dessus aux étapes 7,4 à 7,5.

9. analyse par fluorescence à l’aide d’un spectromètre portatif (voir tableau des matériaux)

1. Utilisez un mélangeur vortex pour secouer les tubes.
2. Préparez le spectromètre pour collecter les émissions de fluorescence à la longueur d’onde appropriée pour votre variante de RFP avec une longueur d’onde d’excitation de 500 nm.
3. Utilisez le bouillon Luria pour enregistrer un spectre vierge.
4. Transférez soigneusement chaque surnageant dans une cuvette à faible volume et collectez l’intensité d’émission.

10. analyse de fluorescence utilisant le lecteur de plaque 96-Well (voir tableau des matériaux)

1. Utilisez un mélangeur vortex pour secouer les tubes.
2. Transférer 200 mL du bouillon dans un puits de la plaque de puits. Notez quels échantillons sont allés dans chaque puits de la plaque.
3. Mettre en place le fluorimètre pour collecter l’intensité d’émission à la longueur d’onde appropriée pour la variante de RFP.

11. analyse des données

1. En utilisant le signal obtenu de tous les contrôles négatifs (les bactéries négatives de RFP ou les bactéries de capteur sans analyte ajouté), calculez un signal moyen de fluorescence pour l’arrière-plan.
2. Soustraire le signal d’arrière-plan moyen de chaque signal de fluorescence obtenu pour les bactéries du capteur pour obtenir une intensité de fluorescence corrigée en arrière-plan.
3. Estimer le rapport signal/bruit (S/N) en divisant l’intensité de fluorescence corrigée en arrière-plan par le signal d’arrière-plan moyen. Si le rapport S/b est supérieur à 3, le test est positif.

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Résultats

Les spectres de fluorescence pour la variante de RFP utilisée dans ce travail sont illustrés à la figure 2. Ces données proviennent de l’appareil PbRFP car elle répond au plomb et au dispositif TNT-RFP, car elle répond à deux analytes, 2,4-DNT et 1, 3-DNB. Cette figure montre le spectre d’un contrôle négatif (pas d’analyte ajouté), et les spectres à deux niveaux différents d’analyte ajouté. Le signal de fluorescence maximal pour la variante de RFP uti...

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Discussion

Modifications et dépannage

L’expérience décrite dans le tableau 4 peut être modifiée de quelque manière que ce soit pour les capteurs qui ont été conçus. L’aspect le plus important d’un capteur chimique est d’évaluer sa sensibilité et sa spécificité. Il est bénéfique de s’assurer qu’une large gamme de concentrations de l’analyte est analysée pour déterminer la plage analytique utile du capteur. Il vaut également la peine de dét...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,3-dinitrobenzene, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97%	Aldrich	101397-5G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SA450-100	Standard in dilute HNO3
Cut Smart Buffer	New England BioLabs	B7204S
Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3101S
Ethanol, HPLC grade, denatured	Acros Organics	AC611050040	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit	IBI Scientific	IB47101
LB Broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SL21-100	Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes	Hygenall	45NRCN	Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific	A452-4	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cells	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3131S
Nuclease free water	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer	New England BioLabs	M0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology	Registry of Standard Biological Parts		http://parts.igem.org/Main_Page
Promoter Sequences	Integrated DNA Technologies		Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’
Reverse primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S