発砲残渣の推定検出のための新しい細菌性バイオセンサの調製と適用

要約

合成生物学技術を用いて、銃創の分析のために一連の細菌用バイオセンサーを合成し、蛍光分光法を用いてその使用目的に対してデバイスの機能をテストするプロトコルを提示します。

要約

MicRoboCop は法医学化学の独特な適用のために設計されていたバイオセンサーである。MicRoboCop は3つの装置で構成されるシステムで、一緒に使用すると、3つの主要な検体 (アンチモン、鉛、および GSR の有機成分) の存在下で蛍光シグナルを生成することによって、発射残渣 (GSR) の存在を示すことができます。本プロトコルは、大腸菌 (e.coli) を用いたバイオセンサーの合成と、センサの選択性と感度を評価するために用いられる分析化学法について述べる。システムの機能は、使用済みカートリッジケーシングの内部から GSR を収集することによって実証されます。一度準備すれば、バイオセンサーは必要になるまで貯えることができ、これらの主要な分析物のためのテストとして使用することができる。3つの検体すべてからの肯定的な反応は、GSR に対する推定陽性試験を提供し、個々のデバイスは、他のサンプル中の検体を検出するためのアプリケーション (例えば、飲料水中の鉛汚染の検出器) を有する。システムの主な制限は、正の信号に必要な時間です。今後の研究は、応答時間を最適化するために異なる生物を研究することを含むかもしれない。

概要

バイオセンサは、化学物質または検体の検出に使用できる応答を生成する生物学的成分 (例えば、タンパク質、核酸、または生物全体) を使用する任意の分析装置です。例として、石炭鉱業は、有毒な鉱山ガスの存在を検出するために20世紀の多くのためにバイオセンサを使用しました: 炭鉱¹のカナリア。生物の生物 (カナリア) は、化学物質 (一酸化炭素) への応答 (死または苦痛) を労働者を保護するために鉱夫によって観察されました。より現代的で洗練された例では、細菌は、蛍光タンパク質の発現のような特定の反応を示すことによって特定の化学分析物の存在に応答する合成生物学技術を使用して改変することができる。

合成生物学は、自然に存在しない生物学的デバイスやシステムの構築、または特定の目的のための既存の生物学的システムの再設計を指す広義の用語である².合成生物学は、標準的な方法論と、デバイスやシステムの合成に使用できる標準化された部品(標準合成生物学の遺伝的要素) の存在によって、遺伝子工学とは区別される。ある部位は、細菌のような生物である装置のゲノムに導入され、機能の指標として役立つ特定の形質を発現する。例えば、多くの合成デバイスにおいて、蛍光タンパク質の発現は、レポータータンパク質として単細胞生物に導入される。複数のデバイスをシステムに結合することができます。細菌などの微生物のゲノムは、このように操作が容易です。様々な化学物質に特有のバイオセンサーの多くの例は、過去10年間の文献で報告されています^3,4.

この研究では、MicRoboCop システムは、法医学および環境化学における新規アプリケーションと合成生物学技術を使用して設計されたバイオセンサの例として提示されています。MicRoboCop は3つの装置のシステムで、これを組み合わせることにより、ヒトの手や表面から採取された銃創 (GSR) によって、大腸菌が赤色蛍光タンパク質 (RFP) を発現することを可能にします。3つの装置の各々は、GSR⁵の構成要素であることが知られている特定の化学分析物に応答する。システムが応答する3つの分析対象は、I. 2, 4, 6-トリニトロトルエン (TNT) および関連化合物 II.鉛 (鉛イオンの形で)、および III.アンチモン (イオンの形態でも)。

GSR には多くの異なる化学物質が含まれていますが、主に GSR としての残渣を特定するために使用される3つは、バリウム、鉛、およびアンチモン⁵です。GSR の同定のための標準証拠試験は、エネルギー分散型 X 線蛍光 (EDX)⁵で走査電子顕微鏡 (SEM) を使用することである。SEM-BPS では、分析者が GSR の固有の形態および元素成分を特定することができます。現在、利用可能ないくつかの広く使用されているバイナリ推定試験があります。最近公表された推定試験の1つはイオンモビリティ分光法 (IMS) を使用しており、これは多くのラボ⁶では利用できないかもしれない特殊な装置です。また、使用できる色の「スポット」テストもいくつかありますが、通常は距離の決定や、弾丸穴や創傷⁵の GSR の識別に使用されます。さらに、ボルタンメトリー分析を使用する GSR のための電気化学試験に関する文献の一部には限定的な注意が払われており、これは潜在的に移植可能なフィールド、または陽極ストリッピングボルタンメトリーの利点があり、これは非常に金属元素の敏感な方法⁷.GSR を検出する目的のために特別に設計されたバイオセンサーの文献にはほとんど言及されていませんが、他の法医学アプリケーション用の一部のバイオセンサーは⁸を公開しています。

MicRoboCop システムにおける各デバイスの生物学的要素と、プラスミドの構造について、図 1に示します。図 1bにおいて湾曲した矢印は、検体の存在下で活性化されるプロモーター領域を表し、その楕円形は、レポータータンパク質の翻訳を可能にするリボソーム結合部位であり、RFP とラベル付けされた灰色のボックスは赤色を発現する遺伝子である蛍光タンパク質、および赤色八角形は転写終結部位である。3つのデバイスはすべて、GSR を検出するシステムとして一緒に使用されます。特定のプロモーター (SbRFP、PbRFP、TNT-RFP) を持つ各デバイスは、試験中のサンプルと共にインキュベートされ、RFP の蛍光が測定されます。RFP は、適切な化学物質が存在し、プロモーター領域を活性化する場合にのみ表現されます。GSR に存在する化学物質のいくつかに応答する3つのデバイスが設計されており、この作業で紹介しています。

3つの MicRoboCop デバイスで使用されるプロモーターは、ヒ素およびアンチモン感受性プロモーター、 SbRFP^9、10、鉛感受性プロモーター、 PbRFP^11、12および TNT 高感度プロモーター、TNT-RFP文献の検索は、バリウムに応答するように設計されたプロモーターを明らかにしなかったので、このプロモーターは、多くの構造的に関連する化合物 (特に、2, 4-dinitrotoluene およびdinitrobenzene) は、GSR に取り残された有機化合物の一部であることが知られている。このプロモーターは、埋設された地雷¹³における微小な量の TNT および 2, 4-dinitrotoluene (2, 4 DNT) を特異的に検出するために首尾よく用いられる。3つの装置をシステムとして一緒に使用すると、GSR のポジティブ・テストにより、3つのデバイスすべてに蛍光が生成されます。1つまたは2つの装置のみでの蛍光シグナルは、検体の別の環境源 (複数可)、または TNT プロモーターの場合、GSR において有機化合物が残されていない化合物による活性化を示す。すべての3つのデバイスを一緒に使用することにより、環境情報源による偽陽性の結果の可能性が最小限に抑えられます。人気が高まっている無鉛弾薬は、米国での弾薬販売量の約 5% しか占めていない。したがって、鉛が存在しないことによる偽陰性の結果は可能性があるが、GSR¹⁴のマーカーとしてリードを使用するセンサーには依然として有用性があります。この特定のフォレンジックアプリケーションに加えて、各デバイスは、環境汚染物質を検出する目的のために別々に使用することができます。

提示されたプロトコールには、デバイス (センサ細菌) を作成するために用いられる合成生物学技術と、デバイスの機能をチェックし得た蛍光シグナルを分析する分析技術が含まれる。プロトコルはまた、表面から GSR を収集するために、容疑者やスワブの手から GSR を収集するための手の拭き取りの形で法医学証拠の収集が含まれています。リードセンサー装置からの結果は、サンプル結果として、使用済みカートリッジケーシングを用いた GSR に対するポジティブテストのデモンストレーションとともに提示されます。

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プロトコル

注: RFP を発現している大腸菌の合成が提示されている。

1.大腸菌からのプラスミド DNA の調製

1. RFP 遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を持つプラスミドを含む大腸菌を解凍し、 100 μ g/mL アンピシリンを含有する Luria ブロス (LB) 寒天プレートを24時間37° c で増殖させます。例えば、合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジストリからの J10060 プラスミドを使用してください (材料の表を参照してください)。J10060 プラスミドには、pBad プロモーター領域およびアンピシリン耐性遺伝子の制御下での RFP (赤色蛍光タンパク質) の遺伝子が含まれています。あるいは、LB 寒天プレート上で増殖する前にプラスミドを使用して大腸菌(ステップ3.2 を参照) を変換します。
2. 標準のミニ調製プロトコル (「材料表」を参照) に従って、J10060 プラスミドを含む大腸菌培養液の 1 mL から DNA を分離します。以下のプロトコルの目的は、pBad プロモーターを除去し、デバイスに対して所望のプロモーターと置き換えることである。
3. プラスミドミニ調製に続いて、消化の準備が整うまで冷凍庫に DNA を保存します。

2. 制限酵素消化

1. EcoRI と NheI のためのマイクロ遠心チューブに以下の反応を設定する:10 μ l の J10060 プラスミド DNA (ステップ1で単離された)、8μ l の水、および1μ l の EcoRI および NheI 酵素を1μ l の緩衝液とともに予め混合する (材料の表を参照)。
2. プロモーター DNA については、EcoRI および NheI 消化のためのマイクロ遠心チューブに以下の反応を設定する:10 μ l のアニールプロモーターの DNA 配列 (8 μ l の水、および1μ l の EcoRI および NheI 酵素を1μ l の緩衝液とともに前もって混合する。
   1. Sb、Pb、または TNT-RFP (材料表を参照) については、オリゴヌクレオチドをバッファーに溶かし (30 mm HEPES、pH 7.5; 100 mM 酢酸カリウム)、等しいモル濃度でインキュベートし、94° c に2分間加熱し、室温で徐々に冷却します。
3. ピペットを10μ l に設定して、サンプルをゆっくりと上下にピペットで混ぜます。
4. 37° c で30分間インキュベートします。
5. 熱は80° c で5分間酵素を失活させる。
6. 消化された DNA を冷凍庫に保存し、次のステップに進む準備をします。

3. ライゲーションと形質転換

1. 結紮
   1. ステップ2で EcoRI および NheI で二重に消化されたプラスミドおよびプロモーター DNA を用いて、マイクロ遠心チューブの氷の上に表 1に示す反応混合物をセットアップする。最後に T4 DNA リガーゼを追加します。
      注:表 1は、示された DNA サイズに対して挿入する1:3 ベクターのモル比を用いたライゲーションを示す。
   2. 反応は、上下にピペットでマイクロ遠心て軽く混ぜます。
   3. 室温で10分間インキュベートします。
   4. 熱は65° c で10分間不活性化します。
2. 変換
   1. 最後の氷の結晶が消えるまで、DH5 の有能な大腸菌細胞を20μ l のチューブを氷上で解凍します。
   2. 5μ l のプラスミド DNA を細胞混合物に添加する。慎重に細胞と DNA を混合するために、チューブ4-5 回をフリックします。
   3. 2分間氷の上に混合物を置きます。
   4. 正確に 30 s のための正確に42° c の熱衝撃。混ぜないでください。
   5. 氷の上に2分を置きます。混ぜないでください。
   6. ピペット380μ l の室温 SOC を混合液に注入します。アンピシリン (100 μ g/mL) を含む LB 寒天プレートの上に直ちに広げ、37° c で一晩インキュベートします。
   7. 成長のために24時間以内にプレートをチェックしてください。
   8. シールフィルムでプレートを密封し、次のステップの準備が整うまで冷蔵庫に保管してください。

4. コロニー PCR

1. 表 2に示す反応混合物を PCR チューブ (4 つの反応管をセットアップ) に加える。
2. 上下にピペットで反応を軽く混ぜる。
3. 黄色のピペットチップを使用して、変換された大腸菌のコロニー (または非常に小さな領域) をこすります。この大腸菌のスワイプを 、断面化されている新しい LB/アンピシリン/寒天プレートに移し、次にピペットチップを PCR チューブに挿入します。ピペットチップを振り、大腸菌と PCR ミックスを混合します。追加のコロニーのためにさらに3回を繰り返す。Pcr チューブを PCR マシンに移し、表 3に示すプログラムを使用して thermocycling を開始します。
4. 2% のアガロースゲルを用いてゲル電気泳動を実行し、プラスミドに最適なライゲーションを有するコロニーを特定し、新しいプレート上でコロニーを増殖させます。
5. テストの準備ができるまで冷蔵庫にプレートを保管してください。化学試験用に100μ g/mL のアンピシリンを添加し、Luria ブロスに液体培養を調製します。

5. DNA シーケンシング

1. 各サンプルについて、5μ l のプラスミド、4μ l のシーケンシング・プライマー、および3μ l の脱イオン水を加えます。
2. この混合物をチューブに入れ、DNA シーケンシングのために送ります (資料の表を参照)。
3. Dna 配列データを解析して、DNA 配列解析ソフトウェアを使用して、予測された dna 配列と観察結果を比較し、変異がなく、遺伝子が正しく挿入されることを確認します。
   注: 化学センサーとして大腸菌を使用すると、以下に提示されます。

6.大腸菌培養物の調製

1. 液体培養用に100μ g/mL アンピシリンを使用して LB を調製します。
2. センサー細菌、ポジティブコントロール * 細菌、ネガティブコントロール * * 細菌の液体培養物を準備します。
   注: * 陽性対照細菌: 構成的プロモーターの制御下にある RFP 遺伝子を含むプラスミドを含有する大腸菌;合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジストリからのプラスミド E1010 (材料の表を参照) は、この作業に使用された。
   * * 陰性対照細菌: pBad プロモーター (合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジストリからのプラスミド J10060 のような、異なるプロモーターの制御下にある RFP 遺伝子を含むプラスミドを含有する大腸菌(の表を参照))または RFP 遺伝子を持たないプラスミドである。
3. 培養液を37° c で振とう器に入れ、最低8時間、最大18時間の 220 rpm にします。白濁したブロスは細菌の増殖を示す。

7. デバイスの機能をチェックする Titrating大腸菌

注: センサーがチェック機能に滴定されたら、このステップを繰り返す必要はありません。鉛、アンチモン、および 2, 4-DNT または 1, 3-dinitrobenzene (1, 3-DNB) の添加の形のポジティブコントロールは、完全な滴定を必要とせずに、各使用のためのデバイスの機能をチェックすることができます。

1. 水に10ppm の濃度で関心のある検体の原液を準備します。溶解性が問題である場合は、50/50 の水/メタノール混合物を使用してください。
2. 表 4をガイドとして、適切な数の滅菌培養チューブにラベルを付け、培養したブロス 2 mL (プロトコルステップ6から) を各チューブに入れます。
   注: 一般的な分析範囲を決定するために、センサーバクテリアを持つ検体の少なくとも3つの異なるレベル、ネガティブコントロールのあるレベル、ポジティブコントロールを持つ1つのレベルを行います。また、追加された金属 (ネガティブコントロールの別のタイプ) を持っていない細菌のそれぞれの1つのチューブがあるはずです。分析範囲と検出限界をより正確に決定するには、より広い範囲の分析物濃度を使用します。
3. 2 mL のブロスを含むチューブに分析物ストック溶液を加え、表 4に記載されているように、それらが緩んでいるように培養チューブの上にスナップキャップを置き (チューブに空気が流れるように)、培養チューブを渦させる。
4. 培養チューブの上に、スナップキャップを緩く残し、220 rpm および37° c で振とう器に少なくとも24時間置きます。
5. インキュベーターからチューブを取り出し、キャップをチューブ上にしっかりとはめ込み、蛍光解析の準備が整うまで、チューブを冷蔵庫に保管してください。

8. GSR 用化学センサーとして大腸菌を使用

1. 鉛を除去するために設計されたエタノールベースのワイプ (材料の表を参照) を使用して、手のすべての表面 (指の間を含む) を拭きます。それぞれの手に個別のワイプを使用します。ワイプは、分析まで適切にラベルが付いた密封 baggie に保管してください。
2. 試験対象の表面の場合: 大きな表面や小さな表面にエタノールで湿らせた綿棒には、アルコールベースのワイプを使用します。
   注: GSR に対するセンサーの応答を示すために、使用された40口径のカートリッジケーシングは、エタノール湿らせた綿棒で拭いました。
3. 清潔な手袋を着用し、アルコールで洗浄されたはさみを使用して、ワイプの中心から約 1cm²のセクションを切ります。
4. ハンドワイプまたは綿棒の切断部分を、センサー細菌 2 mL が含まれている培養チューブに直接置き、ブロス内に水没していることを確認します。
5. ステップ7.4 –7.5 で上記のように進んでください。

9. ポータブル分光器を用いた蛍光分析 (材料表参照)

1. チューブを振るために渦ミキサーを使用してください。
2. 500 nm の励起波長を持つ RFP バリアントに適した波長の蛍光発光を収集するために、分光器を準備します。
3. ブランクスペクトルを記録するには、Luria ブロスを使用します。
4. 各上澄み液を少量のキュベットに注意深く移し、発光強度を収集します。

10. 96 プレートリーダーを使用した蛍光分析 (材料表参照)

1. チューブを振るために渦ミキサーを使用してください。
2. ウェルプレート内のウェルにブロスの 200 mL を転送します。どのサンプルがプレートの各ウェルに入ったかを記録します。
3. Fluorimeter を設定して、RFP バリアントの適切な波長の発光強度を収集します。

11. データ分析

1. すべてのネガティブコントロール (検体が添加されていない RFP 陰性バクテリアまたはセンサーバクテリア) から得られたシグナルを使用して、バックグラウンドの平均蛍光シグナルを計算します。
2. センサー細菌について得られた各蛍光シグナルからの平均バックグラウンドシグナルを減算して、バックグラウンド補正した蛍光強度を得る。
3. 背景の補正された蛍光強度を平均バックグラウンド信号で割って、信号対雑音 (S/N) 比を推定します。S/N 比が3より大きい場合、検定は正の値になります。

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結果

この作業で使用した RFP バリアントの蛍光スペクトルを図 2に示します。これらのデータは、リードと TNT-RFP デバイスに応答する PbRFP デバイスからのもので、2つの分析対象、2、4の DNT および 1, 3-DNB に応答します。この図は、ネガティブコントロールのスペクトル (検体が追加されていない) を示し、2つの異なるレベルの検体が添加されたスペクトルを示?...

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ディスカッション

修正とトラブルシューティング

表 4に記載した実験は、設計されたセンサに適切な任意の方法で修正することができる。化学センサーの最も重要な側面は、その感度と特異性を評価することです。センサの有用な分析範囲を決定するために、検体の濃度の広い範囲が分析されることを確実にすることが有益である。また、細胞のための検体の最?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,3-dinitrobenzene, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97%	Aldrich	101397-5G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SA450-100	Standard in dilute HNO3
Cut Smart Buffer	New England BioLabs	B7204S
Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3101S
Ethanol, HPLC grade, denatured	Acros Organics	AC611050040	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit	IBI Scientific	IB47101
LB Broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SL21-100	Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes	Hygenall	45NRCN	Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific	A452-4	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cells	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3131S
Nuclease free water	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer	New England BioLabs	M0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology	Registry of Standard Biological Parts		http://parts.igem.org/Main_Page
Promoter Sequences	Integrated DNA Technologies		Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’
Reverse primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S