通过自由浮动免疫荧光测定,在皮外神经纤维中定位阿尔法核糖核酸聚合体

摘要

在这里,我们提出了一个协议,在皮肤活检部分自由浮动间接免疫荧光测定,允许识别疾病特异性形态变异的阿尔法核糖核酸与多种蛋白质外围神经系统。

摘要

迄今为止,对于大多数神经退行性疾病,只有死后组织病理学的明确诊断可用。对于帕金森病 (PD),诊断仍然只依赖于运动参与的临床迹象,这些症状在疾病过程中出现,当时大多数多巴胺能神经元已经丢失。因此,我们强烈需要一种生物标志物,能够识别疾病开始时的患者或有患疾病的风险。在过去几年中,皮肤活检已被证明是一个优秀的研究和诊断工具,为周围神经疾病,如小纤维神经病变。有趣的是,一种小纤维神经病变和α核糖核酸(βSyn)神经沉积已经通过PD患者的皮肤活检显示。事实上,皮肤活检具有一种易于接近、微创和无痛的手术,能够分析易发生病理学的周围神经组织。此外,在同一患者的随访过程中重复皮肤活检的可能性允许研究与疾病进展的纵向相关性。我们建立了一个标准化的可靠协议,以研究PD患者皮肤神经纤维中是否存在βSyn聚集体。该协议涉及几个短的固定步骤,一个冷冻体切片,然后一个自由浮动免疫荧光双染色与两个特定的抗体:抗蛋白基因产品9.5(PGP9.5),以标记皮神经纤维和抗5G4检测*Syn 聚合。它是一种多功能、敏感且易于执行的协议,也可用于靶向皮肤神经中感兴趣的其他蛋白质。标记 _Syn 聚合体的能力是使用皮肤活检作为建立 PD 的验尸前组织病理学诊断的工具的又一进步。

引言

皮肤活检作为神经疾病领域的诊断和研究工具,已经变得越来越重要。事实上,表皮和真皮含有丰富的体性感觉神经纤维(骨髓和未骨髓),感知自由神经末梢,感觉受体和汗腺、血管、皮脂腺和肌肉呼吸体毛质^{的自主内侧2}.

在20世纪中叶,PGP9.5抗体的免疫组织化学设置为人类表皮哺乳动物皮肤的广泛内生提供了证据。PGP9.5 是一种沿中枢和周围神经系统 (PNS) 的轴子均匀分布的碳化物终端水解酶。这种抗体的可得性不仅澄清了皮肤中PNS的形态和解剖学,还实现了与PNS相关的疾病的研究3,4。皮肤活检有助于定义一个新的临床实体:小纤维神经病变。几个国际团体通过皮肤活检分析证明了皮内神经纤维的丧失与小纤维神经病变5的症状/体征之间的联系,并为神经活检和神经活检提供了标准化的规程规范参考值用于临床实践6,7,8。

最近大量证据表明,神经退行性疾病,其特点是中枢神经系统中蛋白质积累错误,是多系统^疾病。事实上,PD的特点是在基斯坦尼格拉的多巴胺能神经元中积累βSyn,但已经证明,βSyn及其病理形式磷酸化βSyn(P-αSyn)也可以在外围组织中检测到。胃肠粘液10,唾液腺11,皮肤自主纤维周围的汗腺和皮洛运动肌肉12,13,14,显示免疫反应的致病形式βSyn,在根据布拉克的假说,耐人寻味的假设,_Syn病理学可能开始在PNS提前,在它在大脑^积累15。此外,p-syn 的存在已在 REM 行为障碍患者的皮肤神经中得到证明,这些患者被视为前体 PD^16,17因此皮肤病理学 _Syn 可被视为有前途的早期外周核糖核酸组织病理学标记。

小纤维神经病变在PD的关联已经证明之前,并已发现,皮内神经纤维密度反映疾病进展18,19。因此,皮肤活检是研究PD神经退化和建立疾病的验尸前组织病理学诊断的有用工具。事实上,皮肤活检具有一个很大的优势,是一个容易接近和微创的程序,允许分析容易发生病理的神经组织。最后,在同一患者的随访过程中重复皮肤活检的可能性允许研究与疾病进展的纵向相关性。

在我们的实验室中,利用PGP9.5和构象特异性单克隆5G4抗体的双重免疫染色,识别疾病特定形式的βSyn,包括小聚合^体20,21,我们能够显示在皮肤神经中存在βSyn聚集,具有有前途的高诊断^效率19。结合蛋白质聚集物的检测和体内神经退化的测量,对构象性疾病的皮肤活检进行免疫荧光分析,是生物标志物的一个有前途的来源。下面,我们演示了处理皮肤活检和执行自由浮动免疫荧光染色以检测 _Syn 聚合物的简单而通用的协议。此外,该协议可以适应针对皮肤PNS表达的任何其他感兴趣的蛋白质。

以下研究方案已用于评估在PDPNS中通过皮肤活^检19聚合+Syn分析的诊断效用。PD的纳入标准是:根据英国脑库诊断标准进行明确的临床诊断,疾病持续时间至少3年,无家族史,历史上无重大认知障碍或主要失学症状。排除标准是已知神经病变的原因(糖化血红蛋白、肌氨酸、维生素B12、TSH、血清免疫修复、艾滋病毒、丙肝病毒、梅毒和结节)。每个受试者在三个解剖部位(颈部在C8皮肤水平,大腿在膝盖上方10厘米,腿在侧侧10厘米以上)进行3毫米直径的皮肤活检,这在临床上受到的影响更大。一般来说,以下方案是关于处理皮肤活检和执行自由浮动免疫荧光染色和分析。因此,它可以被调整和用于检测皮肤组织中感兴趣的其他蛋白质。

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研究方案

该协议已获得州道德委员会的批准,所有入学的受试者都书面同意进行此项研究。

1. 皮肤活检系列

1. 让合格的医生在适当的临床环境中进行皮肤活检。
2. 选择区域进行皮肤活检,用酒精拭子清洁。
3. 用1cc的利多卡因2%准备麻醉溶液。
4. 针与区域平行,注射局部麻醉皮下。
5. 检查麻醉效果后,服用3毫米一次性冲床,施加旋转和微妙的向下压力,通过表皮和真皮向下旋转,直到达到皮下脂肪。
6. 收回拳头。
7. 使用一次性钳子轻轻拉起皮肤插头。
8. 用剪刀在脂肪组织水平上切出标本的底座。
9. 将试样放入含有10 mL的牙周-乙醛-甲醛(PLP)固定溶液的管中。
10. 消毒区域,用粘接绷带盖住。

2. 组织固定和储存

1. 制作新的 PLP 固定解决方案(参见表 1)。
2. 在采集皮肤活检后,立即将其浸入含有10 mL的PLP固定溶液的管中,并在4°C下孵育过夜(O/N)。
3. 第二天,在烟机罩下,轻轻取出PLP固定剂,在同一管中,用5mL的0.1M索伦森溶液清洗活检3次(表1)。
4. 丢弃索伦森的溶液,在4°C下用5mL的低温保护溶液O/N孵育活检。
5. 如果在1周内进行冷冻体切割,将活检储存在4°C;如果在3个月内进行切割,则将活检储存在-20°C;将活检嵌入低温(步骤 3.2-3.4),并将其储存在 -80°C,以保存更长时间。

3. 用冷冻培养的组织切割

1. 将冷冻组设置为 -20°C。
2. 取一个低温,并填充它与低温嵌入介质。避免产生气泡。
3. 使用钳子将活检浸入低温嵌入介质中,其纵向轴(表皮 - 真皮)与低温底部平行。
4. 用液氮捕捉样品,以获得含有正确方向活检的低温嵌入介质的固体立方体。
5. 将样品放入冷冻中,等待 30 分钟,使活检适应。
6. 将样品固定在低温上,并切割 50 μm 部分。
7. 在小刷子的帮助下,将冷冻部分转移到含有200μL防冻溶液的96孔板中。每口井一节。
8. 储存在-20°C。
   注:如果未分析整个活检,则仅部分切割。在这种情况下,各节必须储存在-20°C,活检的剩余部分在-80°C下储存,以保存更长时间。

4. 免疫荧光染色

1. 填充 96 孔板,使用 100 μL 的洗涤溶液。
2. 将要分析的截面从存储板转移到包含洗涤溶液的新部分。每个井1个节(每个解剖部位4个科室,每个患者:通常每个患者总共12个科室)。
3. 在室温 (RT) 下,将该部分留在洗涤溶液中 10 分钟。将截面转移到另一个含有相同溶液的井中,然后重复洗涤。
4. 将各部分移入含有 100 μL 阻塞溶液的新井中,并在 RT 孵育至少 90 分钟,最长 4 小时。
5. 稀释工作溶液中抗PGP9.5(兔多克隆,1:1000)和抗5G4(小鼠单克隆,1:400)的主要抗体。
6. 将部分转移到含有100μL初级抗体工作溶液的新井中,并在RT孵育O/N。
7. 作为步骤 4.3,在 RT 下用 100 μL 的洗涤溶液清洗部分至少 10 分钟。
8. 稀释二级抗体(与不同荧光道结合)山羊抗兔子,以检测PGP9.5(1:700)和山羊抗鼠,以检测工作溶液中的5G4(1:700)。
9. 将部分转移到含有100μL的二级抗体工作溶液的新井中,在RT处90分钟。从此时起,用铝箔覆盖96孔板,以避免与二级抗体结合的荧光团漂白。
10. 作为步骤 4.3,用 100 μL 的洗涤溶液清洗部分 2 次,至少 10 分钟。
11. 在 RT 将部分转移到含有 100 μL DAPI(PBS 1x 中稀释 1:5,000)的新井中 5 分钟。
12. 作为步骤 4.3,用 100 μL 的洗涤溶液清洗部分 2 次,至少 10 分钟。
13. 将部分安装在幻灯片上的正确位置,避免折叠错误。
14. 在幻灯片上添加几滴安装介质,并盖上盖玻片。
15. 在使用共聚焦/荧光显微镜之前,让幻灯片擦干 O/N。
16. 将幻灯片存放在 4°C 的相应盒中,避免光线照射。如果准确存储,信号将可见约 6 个月。
    注:使用有助于拾取活检的小刷子将部分从包含新切切片的 96 孔板转移到包含洗涤溶液的 96 孔板(步骤 4.1)。在将切片转移到第一口井后,每次切片需要用不同的溶液孵育时,在刷子的帮助下将其从井移动到井。

5. 免疫荧光成像

1. 在倒荧光显微镜或共聚焦显微镜下查看部分(20X、40 倍或更高放大倍率,在 Z 堆栈平面上使用 2 μm 增量的连续帧,以获得最佳效果)。
2. 通过显微镜连接的摄像机获取图像
3. 使用适当的成像软件(即 ImageJ)从信号的空间分布和强度的角度分析各节中的正信号。为此,执行下面提到的步骤。
   1. 使用 ImageJ 软件打开文件。
   2. 单击图像 > 颜色 > 拆分通道以分析每个颜色通道。
   3. 单击图像 > 堆栈 > Z 项目以获取多个节购置的合并。
   4. 单击图像 > 颜色 > 合并通道以获取相同采集的不同颜色通道的合并。

防冻液 (在 4°C 下存放长达 6 个月)	30% 甘油 30%乙二醇 30% dH2O 10% 2x 磷酸盐缓冲液
阻塞解决方案 (目前准备)	4% 正常山羊血清 1% 特里顿 X-100 在洗涤解决方案中
冷冻保护剂 (在 4°C 下存放长达 6 个月)	20%甘油 80% 索伦森的解决方案
磷酸氢钠溶液 (在 RT 存储长达 6 个月)	0.45M 磷酸氢钠 (Na2HPO4) 在 dH2O 中 在无菌瓶中过滤
莱辛溶液 (在 4°C 下储存长达 3 周)	0.3M L-Lysine 单盐溶液的 50% 0.1M 索伦森解决方案 pH7.6 的 50% pH 7.4,无菌瓶中过滤
甲醛 (PFA) 8% (在烟气罩下准备,在4°C下储存长达1个月)	2.6M PFA 在 dH2O 中(至 55°C+不超过 60°C,以避免甲酸形成) 无菌瓶中的过滤器
磷酸盐缓冲液 2x (在 4°C 下存放长达 6 个月)	6% 磷酸钠 (NaH2PO4) 溶液 45% 磷酸二钠(Na2HPO4)溶液,在dH2 O中
PLP 固定解决方案 (此刻准备,在烟雾罩下)	25% 甲醛 8% 0.01M 钠(元)周期 75% 以辛比溶液<
磷酸二氢钠单水合物 (在 RT 存储长达 6 个月)	0.52M 磷酸二氢钠单水合物 (NaH2PO4_H2O)在 dH2O 中 过滤在无菌瓶中。
索伦森的解决方案 (在 4°C 下存放长达 1 个月)	2.5% 磷酸钠溶液 18.7% 磷酸二钠溶液 pH7.6,以 dH2O 表示
洗涤解决方案 (目前准备)	0.25M Trizma 底座 0.26M 纳Cl pH7.6,以 dH2O 表示
工作解决方案 (目前准备)	50% 阻塞解决方案 50% 洗涤解决方案

表 1:所需的解决方案。协议所需解决方案的列表,以及如何准备协议的简要说明。

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结果

按照所述程序(图1),我们在PD患者的皮神经裂解内化自主结构中检测到带有5G4抗体标记的βSyn聚合体。α-核素沉积的形态以皮肤神经的斧子上的虚线信号出现(图2)。事实上,在19个PD患者和3个解剖部位(宫颈、大腿和远端腿)的皮肤活检中利用此协议,我们发现5G4具有81%的敏感性和86%的特异性,对健康的控制和P-+Syn有56%的灵敏度和100%的特^异性19。

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讨论

我们描述了皮肤活检的免费浮动免疫荧光测定,用于诊断PD:它利用抗PGP9.5抗体的双重免疫染色剂、泛化标记物和抗5G4,一种识别聚合形式的构象特异性抗体*Syn。

在PD和可能在其他蛋白质构象障碍中,皮肤活检用于诊断目的的巨大优点是:1) 通过轻度侵入性技术直接进入容易患病的神经组织,从而具有预期的更好的测定与血液或CSF等生物流体相比,对βSyn聚集物的敏感性;2) 有机会检测?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium