מיקוד אלפא Synuclein אגרגטים בתוך עורית היקפיים סיבים עצביים על ידי Free-צפה אימונוofלואונסנציה החופשית

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכת ביופסיה בחינם צף של העור על מקטעים לביופסיה של מעטפת המאפשרת זיהוי של מחלות היווצרות המחלה מסוים של מחלת אלפא מעורב במחלת פרקינסון מספר חלבונים של מערכת העצבים ההיקפית

Abstract

עד היום, עבור רוב מחלות ניווניות רק האבחון הסופי לאחר המוות histopathological זמין. עבור מחלת פרקינסון (PD), האבחון עדיין מסתמך רק על סימנים קליניים של מעורבות מוטורית המופיעים מאוחר יותר בקורס המחלה, כאשר רוב הנוירונים הדוגיים האלה כבר אבדו. מכאן, יש צורך חזק בסמנים שיכולים לזהות חולים בתחילת המחלה או בסיכון לפתח אותו. במהלך השנים האחרונות, ביופסיה העור הוכיחה להיות כלי מחקר מעולה ואבחון עבור מחלות עצבים היקפיים כגון נוירופתיה סיבים קטנים. מעניין, נוירופתיה סיבים קטנים ומערכת האלפא synuclein (αSyn) הפקדות עצביות הוכחו על ידי ביופסיה בעור חולי PD. אכן, ביופסיה העור יש את היתרון הגדול של להיות נגיש בקלות, פולשני מינימלית הליך כאבים המאפשר ניתוח של רקמת העצבים ההיקפית נוטה הפתולוגיה. יתר על כן, האפשרות של חזרה על ביופסיה של העור במהלך המעקב של החולה אותו מאפשר ללמוד את הקשר האורך עם התקדמות המחלה. הגדרת פרוטוקול אמין מתוקננת כדי לחקור את הנוכחות של אגרגטים αSyn בסיבי עצב העור של החולה PD. פרוטוקול זה כולל כמה שלבים הקיבעון קצר, הפסקה קריוטום ולאחר מכן בחינם צף הimmunofluorescence כפולה עם שני נוגדנים ספציפיים: אנטי חלבון מוצר גנטי 9.5 (PGP 9.5) כדי לסמן את סיבי העצב עורית ו 5G4 לגילוי . אגרגטים αSyn זהו מגוון, רגיש וקל לבצע פרוטוקול שניתן גם להחיל על המיקוד חלבונים אחרים של עניין עצבי העור. היכולת לסמן אגרגטים αSyn הוא צעד נוסף קדימה לשימוש ביופסיה של העור ככלי להקמת אבחנה טרום לנתיחה לפני המוות של PD.

Introduction

ביופסיה העור רכשה חשיבות רבה כמו כלי אבחון ומחקר בתחום של הפרעות נוירולוגיות¹. אכן, אפידרמיס ו דרמיס מכילים שופע סיבי העצב החושי החושים (מיאלואידית ובלתי מיאלואידית), nociceptive קצוות עצביים חינם, קולטני חישה ואינבציה אוטונומי של בלוטות הזיעה, כלי, בלוטות החלב ושרירים הרקטור השרירום ². שתיים.

באמצע המאה ה -20, ההתקנה עבור אימונוהיסטוכימיה של הנוגדן pgp 9.5 מותר הראיות של שימור נרחב של העור באפידרמיס האדם³. Pgp 9.5 הוא carboxyl-טרמינל הידרוקלז מופץ באופן שווה לאורך אקסונים של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית (היקפית). הזמינות של הנוגדן הזה מותר לא רק כדי להבהיר את המבנה ואת האנטומיה של היקפית בעור אלא גם יישמה את המחקר של מחלות הקשורות בו^3,4. ביופסיה של העור תרמו להגדרת ישות קלינית חדשה: נוירופתיה סיבים קטנים. קבוצות בינלאומיות מספר הפגינו את הקשר בין אובדן סיבי העצב התוך באפידרמיס ותסמינים/סימנים של נוירופתיה סיבים קטנים⁵ על ידי ניתוח ביופסיה העור סיפק פרוטוקולים סטנדרטיים עבור ממורמטריה עצבים, כמו גם ערכי התייחסות נורמטיבית לשימוש בפרקטיקה הקלינית^6,7,8.

לאחרונה כמות גדולה של ראיות הראו כי מחלות ניווניות, המאופיינת על ידי חלבון מקופל צטברויות במערכת העצבים המרכזית, הם הפתווגיות מולטי מערכת⁹. אכן, PD מאופיין על ידי הצטברות αSyn בתוך תא העצב הדואמנרגיים של החומר, אבל זה הוכח כי αSyn וצורתו הפתולוגית, αSyn זרחתי (P-αSyn), ניתן להבחין גם ברקמות ההיקפית. רירית העיכול¹⁰, בלוטות הרוק¹¹, סיבי העור האוטונומית סביב בלוטות הזיעה והשרירים הפילגניים^12,13,14, להראות פעילות immunoreactivity צורות של מערכת החיסונית של, ב בהתאם להשערה Braak כי שליט אקסיומת כי αSyn פתולוגיה עשויה להתחיל ב היקפית גם מראש, לפני הצטברות שלה במוח¹⁵. עוד, הנוכחות של p-αSyn כבר הפגינו עצבי העור של חולים עם הפרעות התנהגות REM שנחשבים משטרת prodromal^16,17 ובכך העור הפתולוגי αSyn יכול להיחשב היקפי מבטיח מוקדם סימן ההיסטואוולוגי של הסיננופתיה.

האגודה של נוירופתיה סיבים קטנים במשטרה כבר הפגינו בעבר וזה נמצא כי צפיפות סיבים עצביים באפידרמיס משקף התקדמות המחלה^18,19. מכאן, ביופסיה של העור הוא כלי שימושי עבור לימוד נוירוניוון ב PD ולהקמת אבחון histopathological לפני המוות של המחלה. אכן, ביופסיה של העור יש יתרון גדול של להיות הליך נגיש בקלות מינימלית פולשנית, המאפשר ניתוח של רקמת העצבים נוטה הפתולוגיה. לבסוף, האפשרות לחזור על ביופסיה בעור במהלך המעקב של חולים אותו מאפשר ללמוד את הקורלציה האורך עם התקדמות המחלה.

במעבדה שלנו, ניצול דלקת חיסונית כפולה עם pgp 9.5 ואת הקונפורמציה-הנוגדן 5g4 ספציפי, כי מזהה צורות ספציפיות של המחלה של αSyn כולל אגרגטים קטנים^20,21, הצלחנו להראות את ה נוכחות של אגרגטים αSyn בעצבי העור עם יעילות מבטיחה אבחון גבוה¹⁹. Immunofluorescence ניתוח של ביופסיה של העור מחלות קונפורניות בולטת כמו מקור מבטיח של סמנים באמצעות שילוב הן זיהוי של אגרגטים חלבונים ואת המדד של נוירוניוון ב vivo. להלן, אנו ממחישים פרוטוקול קל וצדדי על הטיפול ביופסיה העור וביצוע ללא תשלום הimmunofluorescence כתמים עבור זיהוי אגרגטים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למיקוד כל חלבון אחר של ריבית המתבטאת בעור היקפית.

פרוטוקול המחקר שלהלן נעשה שימוש כדי להעריך את כלי האבחון של ניתוח αSyn צבור בהיקפית של PD על ידי העור ביופסיה¹⁹. קריטריוני הכללה עבור המשטרה היו: אבחנה קלינית מובהק על פי הקריטריונים האבחון של בנק המוח בבריטניה, משך המחלה לפחות 3 שנים, אין היסטוריה משפחתית, ואין ליקוי קוגניטיבית גדול או סימפטומים dysautonomic הגדולות בהיסטוריה. קריטריוני הדרה היו ידועים סיבות נוירופתיה (המוגלובין מסוכרר, קריאטינין, ויטמין B12, TSH, החיסוני סרום, HIV, מימן, עגבת, ו borreliosis). כל אחד מהנושאים עבר ל -3 ביופסיות עור בקוטר 3 מ"מ בשלושה אתרים אנטומיים (צוואר ברמה C8 דרמטאלית, ירכיים 10 ס מ מעל הברך, רגל 10 ס"מ מעל קרסולית לרוחב) בצד, אשר הושפע קלינית יותר. באופן כללי, הפרוטוקול הבא הוא על טיפול ביופסיה של העור וביצוע של כתמים וניתוח החיסונית הצפה בחינם. לכן זה יכול להיות מותאם ומשמש לאיתור חלבונים אחרים של עניין רקמת העור.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של הקנטראל וכל הנושאים הרשומים העניקו הסכמה מושכלת למחקר.

1. העור אוסף ביופסיה

1. תן רופא מוסמך לבצע את ביופסיה העור בסביבה קלינית מתאימה.
2. בחר את האזור כדי לבצע את ביופסיה העור ולנקות אותו עם ספוגית אלכוהול.
3. הכינו את פתרון ההרדמה עם 1 cc של לידוקאין 2%.
4. , עם המחט במקביל לאזור. תזריק תת-עורי הרדמה מקומית
5. לאחר בדיקת ההשפעה של הרדמה, לקחת את 3 הפונץ ' חד פעמי ולהחיל הסיבוב ואת הלחץ העדין כלפי מטה כדי לסובב אותו למטה דרך האפידרמיס ואת dermis, עד השומן התת עורי הוא הגיע.
6. . למשוך את האגרוף
7. השתמש מלקחיים חד פעמיים כדי למשוך בעדינות את העור לחבר.
8. השימוש במספריים כדי לגזור את הבסיס של הדגימה ברמה של רקמת שומן.
9. מניחים את הדגימה בתוך צינור המכיל 10 מ ל של פתרון קבע ליזין-פאראפורמלדהיד (plp) מעודכן.
10. חטא את האזור וכיסו אותו בתחבושת דביקה.

2. קיבוע רקמות ואחסון

1. הפוך פתרון חדש plp קבע (ראה טבלה 1).
2. מיד לאחר האיסוף של העור ביופסיה, להטביע אותו בצינור המכיל 10 מ ל של פתרון קבע מאוד ולתת אותו לילה (O/N) ב 4 ° c.
3. ביום שלאחר מכן, מתחת למכסה המנוע, להסיר את התיקונים PLP בעדינות באותו צינור, לשטוף את הביופסיה 3 פעמים עבור 5 דקות עם 5 מ ל של 0.1 M הפתרון של סורנסן (שולחן 1).
4. התעלם מהפתרון של סורנסן והגנה על הביופסיה עם 5 מ ל של תמיסה להגנה על ההקפאה ב -4 ° c.
5. לאחסן את הביופסיה ב 4 ° צ' אם החתך עם קריוטומה מבוצע בתוך שבוע אחד; לאחסן את הביופסיה ב-20 ° c אם החתך מבוצע בתוך 3 חודשים; להטביע את הביופסיה ב cryomold (שלבים 3.2-3.4) ולאחסן אותו ב-80 ° צ' כדי לשמר את זה לתקופה ארוכה יותר של זמן.

3. רקמת חתך עם קריוטום

1. הגדר את הקריוטומה ב-20 ° c.
2. לקחת מיושן ולמלא אותו עם המדיום הטבעה ההקפאה. להימנע מיצירת בועות.
3. שימוש בפינצטה לטבול את הביופסיה לתוך המדיום הטבעה ההקפאה עם ציר האורך (אפידרמיס-dermis) במקביל לתחתית של הקריומוראולד.
4. הצמד להקפיא את המדגם עם חנקן נוזלי כדי לקבל קוביה מוצק של מדיום הטבעה ההקפאה המכילה את הביופסיה בכיוון הנכון.
5. לשים את המדגם ב קריוסטט ולחכות 30 דקות כדי לאפשר ביופסיה כדי לתקן.
6. לתקן את המדגם על קריוסטט ולחתוך 50 יקרומטר סעיפים.
7. בעזרתו של מברשת קטנה, להעביר את מקטעי ההקפאה ב 96 צלחת היטב המכיל 200 μL של פתרון נוגדי קיפאון בכל טוב. . חלק אחד לכל הטוב
8. חנות ב-20 ° c.
   הערה: אם לנתח את הביופסיה כולה לא מנותח, לחתוך אותו רק באופן חלקי. במקרה זה, יש לאחסן את הסעיפים ב-20 ° c ובחלק הנותר של הביופסיה ב-80 ° צ' כדי לשמר אותה למשך פרק זמן ארוך יותר.

4. מאימונולואובורנציה

1. מילוי צלחת 96 היטב, עם 100 μL של פתרון כביסה.
2. העבר את המקטעים לניתוח מלוחית האחסון לחדש המכיל את פתרון הכביסה. 1 מקטע לכל הבאר (4 מקטעים לכל אתר אנטומי, לכל מטופל: בדרך כלל סך של 12 סעיפים לכל חולה).
3. השאירו את החלק בפתרון הכביסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). העבר את הקטע למקום אחר המכיל את אותו הפתרון וחזור על השטיפה.
4. להעביר את הסעיפים לבארות חדשות המכילות 100 μL של חסימת הפתרון ו-דגירה עבור לפחות 90 דקות ועבור מקסימום של 4 h ב RT.
5. לדלל את הנוגדנים העיקריים anti-PGP 9.5 (הארנב polyclonal בטים, 1:1000) ו-anti-5G4 (עכבר monoclonal בטים, 1:400) בפתרון העבודה.
6. העבר את הסעיפים לבארות חדשות המכילות 100 μL של פתרון העבודה של הנוגדנים העיקריים והדגירה אותם O/N ב RT.
7. כמו שלב 4.3, לשטוף את הסעיפים 2 פעמים עבור לפחות 10 דקות ב RT, עם 100 μL של פתרון כביסה.
8. לדלל את הנוגדנים המשני (המשלים עם fluorophores שונים) עז נגד ארנב לזהות PGP 9.5 (1:700) ו עז אנטי עכבר לזהות 5G4 (1:700) בפתרון העבודה.
9. העבר את הסעיפים לבארות חדשות המכילות 100 μL של פתרון העבודה של הנוגדנים המשניים עבור 90 דקות ב-RT. מנקודה זו, לכסות את הצלחת 96 היטב עם רדיד אלומיניום כדי למנוע הלבנת של fluorophore מצועם נוגדן משני/ies.
10. כמו שלב 4.3, לשטוף את הסעיפים 2 פעמים עבור לפחות 10 דקות, עם 100 μL של פתרון כביסה.
11. העבר את הסעיפים לבארות חדשות המכילות 100 μL של DAPI (מדולל 1:5000 ב-PBS 1x) עבור 5 דקות ב RT.
12. כמו שלב 4.3, לשטוף את הסעיפים 2 פעמים עבור לפחות 10 דקות, עם 100 μL של פתרון כביסה.
13. טעינת המקטעים בשקופית במיקום הנכון הימנעות מקיפול מוטעה.
14. הוסף כמה טיפות של המדיום הגובר בשקופית וכיסוי עם שמיכות.
15. תנו לשקופיות להתייבש O/N לפני שימוש במיקרוסקופ הקונמוקד/זריחה.
16. אחסן את השקופיות בתיבה מתאימה ב-4 ° c והימנעות מחשיפה לאור. אם יאוחסנו במדויק, האות יהיה גלוי למשך כ 6 חודשים.
    הערה: העברת מקטע מלוחית הבאר 96 המכיל את פרוסות לחתוך החדש לצלחת הטובה 96 המכיל את פתרון כביסה (שלב 4.1) מבוצעת באמצעות מברשת קטנה שמסייעת להרים את הביופסיה. לאחר העברת הקטע לתוך הבאר הראשונה, בכל פעם הפרוסה צריך להיות מודחים עם פתרון שונה, להעביר אותו היטב גם בעזרת המברשת.

5. הדמיה מאימונולואורסנס

1. הצגת מקטעים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית הפוך או מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (20x, 40x או הגדלה גבוהה יותר, להשתמש במסגרות עוקבות של 2 יקרומטר בהפרשים על תוכנית Z-מחסנית לקבלת התוצאות הטובות ביותר).
2. לרכוש תמונות על ידי מיקרוסקופ מחובר מצלמה
3. השתמש בתוכנת דימות נאותה (כלומר ImageJ) כדי לנתח אותות חיוביים בסעיפים במונחים של הפצה מרחבית ועוצמת האות. לשם כך בצע את השלבים שהוזכרו להלן.
   1. פתח את הקובץ עם תוכנת ImageJ.
   2. לחץ על התמונה > צבע > לפצל ערוצים כדי לנתח כל ערוץ צבע.
   3. לחץ על > מחסנית > פרוייקט Z כדי לקבל מיזוג של רכישות מרובות מקטעים.
   4. לחץ על תמונה > צבע > מיזוג ערוצים כדי לקבל מיזוג של ערוצי צבע שונים של אותה רכישה.

תמיסה נגד קיפאון (בחנות ב -4 ° צ' עד 6 חודשים)	30% גליצרול 30% אתילן גליקול 30% dH2O 10% מאגר פוספט 2 x
חסימת פתרון (היכונו כרגע)	4% סרום עז רגיל 1% טריטון X-100 בתמיסה כביסה
מהגן המקפיא (בחנות ב -4 ° צ' עד 6 חודשים)	20% גליצרול 80% הפתרון של סורנסן
Disodium מימן פוספט פתרון (בחנות ב-RT עד 6 חודשים)	0.45 m Disodium מימן פוספט (Na2HPO4) ב dH2O סינון בבקבוק סטרילי
פתרון ליזין (החנות ב -4 ° צ' עד 3 שבועות)	50% מתוך 0.3 מ' L-ליזין מונוהידרוכללוריד 50% מהתמיסה של סורנסן-pH 7.6 pH 7.4, מסנן בבקבוק סטרילי
פאראפורמלדהיד (כדורגלן) 8% (היכונו מתחת למכסה המנוע והחנות ב -4 ° צ' עד לחודש אחד)	2.6 מ' בdH2O (עד 55 ° c) לא יעלה על 60 ° צ' כדי למנוע היווצרות חומצה פורמית) לסנן בקבוק סטרילי
מאגר פוספט 2x (בחנות ב -4 ° צ' עד 6 חודשים)	6% מונוסודיום פוספט (NaH2PO4) תמיסה 45% disodium פוספט (Na2HPO4) פתרון ב-dH2O
פתרון תיקונים PLP (היכונו כרגע, מתחת למכסה המנוע)	25% פאראפורמלדהיד 8% (מטא) 0.01 מ' נתרן 75% פתרון ליזין <
סודיום דימימן פוספט מונומונסודה (בחנות ב-RT עד 6 חודשים)	0.52 m נתרן Dihydrogen ימן פוספט מונומיים (NaH2PO4 * H2O) ב dH2O מסננים בבקבוק סטרילי.
הפתרון של סורנסן (החנות ב -4 ° צ' עד לחודש אחד)	2.5% מונוסודיום פוספט תמיסה 18.7% דינתרן פוספט לתמיסה pH 7.6, ב dH2O
פתרון כביסה (היכונו כרגע)	0.25 בסיס טריזמה 0.26 ז pH 7.6, ב dH2O
פתרון עבודה (היכונו כרגע)	50% פתרון חסימה 50% פתרון כביסה

טבלה 1: פתרונות נדרשים. רשימת הפתרונות הדרושים לפרוטוקול ותיאור קצר של אופן הכנתו.

תוצאות

בעקבות ההליך המתואר (איור 1), גילינו אגרגטים αSyn, המסומנים עם נוגדן 5G4, במבנה עצבי העורי innervating מבנים אוטונומית של חולי PD. מורפולוגיה של הפיקדונות אלפא-synuclein מופיע כאות מנוקד לאורך האקטונים של עצבי העורי (איור 2). אכן, ניצול פרוטוקול זה 19 חולים PD ו -17 שולטת ביופסי?...

Discussion

אנו מתארים את שיטת הimmunofluorescence צף חינם עבור ביופסיות עור לאבחון של PD: הוא מנצל את החיסוני כפול עם אנטי PGP הנוגדן 9.5, סמן panaxonal, ו-anti-5G4, נוגדן מסוים מזהה הטופס הצבור של αSyn.

היתרונות הגדולים של ביופסיה של העור למטרת אבחון ב PD ואולי בהפרעות אחרות חלבון הפרעות מסוימות הם: 1) גישה ישיר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium