Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour un test d'immunofluorescence indirecte flottant sur les sections de biopsie de peau qui permet l'identification des variantes spécifiques de conformation de la maladie de la synuclein alpha impliquée dans la maladie de Parkinson et les protéines multiples du système nerveux périphérique.

Résumé

À ce jour, pour la plupart des maladies neurodégénératives, seul un diagnostic histopathologique post-mortem définitif est disponible. Pour la maladie de Parkinson (PD), le diagnostic repose toujours seulement sur des signes cliniques de la participation motrice qui apparaissent plus tard dans le cours de la maladie, quand la plupart des neurones dopaminergiques sont déjà perdus. Par conséquent, il y a un fort besoin d'un biomarqueur qui puisse identifier les patients au début de la maladie ou au risque de le développer. Au cours des dernières années, la biopsie de la peau s'est avérée être un excellent outil de recherche et de diagnostic pour les maladies nerveuses périphériques telles que la neuropathie des petites fibres. Fait intéressant, une petite neuropathie de fibre et des dépôts neuronaux alpha synucléines ont été montrés par biopsie de peau dans les patients de. En effet, la biopsie de la peau a le grand avantage d'être une procédure facilement accessible, peu invasive et indolore qui permet l'analyse du tissu nerveux périphérique enclin à la pathologie. En outre, la possibilité de répéter la biopsie de peau au cours du suivi du même patient permet d'étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie. Nous avons mis en place un protocole fiable normalisé pour étudier la présence des agrégats de Syn dans les fibres nerveuses de peau du patient de. Ce protocole implique peu d'étapes courtes de fixation, une section cryotome et puis une double coloration d'immunofluorescence flottante avec deux anticorps spécifiques : anti-produit de gène de protéine 9.5 (PGP9.5) pour marquer les fibres cutanées de nerf et anti 5G4 pour détecter Agrégats Syn. Il s'agit d'un protocole polyvalent, sensible et facile à exécuter qui peut également être appliqué pour cibler d'autres protéines d'intérêt dans les nerfs de la peau. La capacité de marquer les agrégats de Syn est un autre pas en avant à l'utilisation de la biopsie de peau comme outil pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de.

Introduction

La biopsie de la peau a acquis une grande importance en tant qu'outil de diagnostic et de recherche dans le domaine des troubles neurologiques¹. En effet, l'épiderme et le derme contiennent d'abondantes fibres nerveuses sensorielles somatiques (myélinisés et non myélinistielles), des terminaisons nerveuses sans nociceptive, des récepteurs sensoriels et une innervation autonome des glandes sudoripares, des vaisseaux, des glandes sébacées et des pilorum ^{d'arrector musculaires. 2}.

Au milieu du XXe siècle, la configuration de l'immunohistochimie de l'anticorps PGP9.5 a permis l'évidence d'une innervation étendue de la peau humaine de mammifères d'épiderme^3. PGP9.5 est un hydrolase carboxyl-terminal également réparti le long des axones du système nerveux central et périphérique (PNS). La disponibilité de cet anticorps a permis non seulement de clarifier la morphologie et l'anatomie de PNS dans la peau, mais a également mis en œuvre l'étude des maladies qui lui sont associées^3,4. La biopsie de peau a contribué à définir une nouvelle entité clinique : la neuropathie de petite fibre. Plusieurs groupes internationaux ont démontré l'association entre la perte des fibres nerveuses intraépidermiques et des symptômes/signes de la neuropathie de petite fibre⁵ par l'analyse de biopsie de peau et ont fourni des protocoles normalisés pour la morphométrie de nerf aussi bien que valeurs de référence normatives à utiliser dans la pratique clinique^6,7,8.

Récemment, une grande quantité de preuves a montré que les maladies neurodégénératives, caractérisées par des accumulations de protéines mal repliées dans le système nerveux central, sont des pathologies multi-systèmes⁹. En effet, la DP se caractérise par une accumulation de Syn dans le neurone dopaminergique de la substantia nigra, mais il a été démontré que le Syn et sa forme pathologique, phosphorylée Syn (P-Syn), pouvaient être détectés également dans les tissus périphériques. La muqueuse gastro-intestinale¹⁰, glandes salivaires¹¹, fibres autonomes de la peau entourant les glandes sudoripares et les muscles pilomoteurs^12,13,14, montrent l'immunoréactivité aux formes pathogènes de 'Syn, en conformément à l'hypothèse de Braak qui postulent intrigantement que la pathologie de Syn peut commencer dans PNS bien à l'avance, avant son accumulation dans le cerveau¹⁵. En outre, la présence de p-Syn a été démontrée dans les nerfs de peau des patients présentant des désordres de comportement de REM qui sont considérés prodromal^16,17 ainsi la peau pathologique - Syn peut être considérée un périphérique tôt prometteur marqueur histopathologique de synucleinopathy.

L'association de la neuropathie de petite fibre dans a été démontrée précédemment et il a été constaté que la densité intraepidermal de fibres de nerf reflète la progression de la maladie^18,19. Par conséquent, la biopsie de peau est un outil utile pour étudier la neurodégénérescence dans la MP et pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de la maladie. En effet, la biopsie de la peau a un grand avantage d'être une procédure facilement accessible et peu invasive, permettant l'analyse des tissus nerveux enclins à la pathologie. Enfin, la possibilité de répéter la biopsie de la peau au cours du suivi des mêmes patients permet d'étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie.

Dans notre laboratoire, l'exploitation d'une double immuno-coloration avec PGP9.5 et l'anticorps monoclonal 5G4 conformation-spécifique, qui reconnaît les formes spécifiques de la maladie de 'Syn y compris les petits agrégats^20,21, nous avons pu montrer le présence d'agrégats syn dans les nerfs de la peau avec une efficacité diagnostique élevée prometteuse¹⁹. L'analyse d'immunofluorescence de la biopsie de peau dans les maladies conformationnelles se distingue comme source prometteuse de biomarqueurs en combinant à la fois la détection des agrégats protéiques et la mesure de la neurodégénérescence in vivo. Par la suite, nous illustrons un protocole facile et polyvalent sur la manipulation de la biopsie de peau et l'exécution de la coloration d'immunofluorescence flottante libre pour détecter des agrégats de Syn. En outre, ce protocole peut être adapté pour cibler toute autre protéine d'intérêt exprimée dans la peau PNS.

Le protocole d'étude suivant a été utilisé pour évaluer l'utilité diagnostique de l'analyse agrégée de Syn dans le PNS de la MP par biopsie de peau^19. Les critères d'inclusion pour la étaient : un diagnostic clinique défini selon les critères diagnostiques de banque de cerveau du R-U, la durée de la maladie au moins 3 ans, aucune histoire de famille, et aucune affaiblissement cognitif majeur ou symptômes dysautonomic principaux dans l'histoire. Les critères d'exclusion étaient des causes connues de neuropathie (hémoglobine glyquée, créatinine, vitamine B12, TSH, immunofixation du sérum, VIH, VHC, syphilis et borréliose). Chaque sujet a subi des biopsies de peau de 3 millimètres de diamètre à trois emplacements anatomiques (cou au niveau dermatomal de C8, cuisse 10 cm au-dessus du genou, jambe 10 cm au-dessus du malleolus latéral) sur le côté, qui a été médicalement plus affecté. En général, le protocole suivant consiste à traiter la biopsie de la peau et à effectuer la coloration et l'analyse de l'immunofluorescence flottante. Par conséquent, il peut être adapté et utilisé pour la détection d'autres protéines d'intérêt dans les tissus cutanés.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité cantonal d'éthique et tous les sujets inscrits ont donné leur consentement éclairé écrit à l'étude.

1. Collection de biopsie de peau

1. Laissez un médecin qualifié effectuer la biopsie de la peau dans un cadre clinique approprié.
2. Choisissez la zone pour effectuer la biopsie de la peau et nettoyez-la avec un écouvillon d'alcool.
3. Préparer la solution anesthésique avec 1 cc de lidocaïne 2%.
4. Avec l'aiguille parallèle à la région, injecter sous-cutanée l'anesthésie locale.
5. Après avoir vérifié l'effet de l'anesthésie, prendre le poinçon jetable de 3 mm et appliquer une pression rotatif et délicate vers le bas pour le faire pivoter à travers l'épiderme et le derme, jusqu'à ce que la graisse sous-cutanée soit atteinte.
6. Retirez le poinçon.
7. Utilisez des forceps jetables pour tirer doucement le bouchon de la peau vers le haut.
8. Utilisez des ciseaux pour découper la base du spécimen au niveau du tissu adipeux.
9. Placez le spécimen dans un tube contenant 10 ml de solution fixative paropérienne-lysine-paraformaldéhyde (PLP).
10. Désinfecter la zone et la recouvrir d'un bandage adhésif.

2. Fixation et stockage des tissus

1. Faire une solution fixative PLP fraîche (voir tableau 1).
2. Immédiatement après la collecte de la biopsie de la peau, immerger dans un tube contenant 10 ml de solution fixative PLP et l'incuber pendant la nuit (O/N) à 4 oC.
3. Le lendemain, sous le capot de fumée, retirer le fixatif PLP doucement et dans le même tube, laver la biopsie 3 fois pendant 5 min avec 5 ml de la solution de 0,1 M Sorensen (tableau 1).
4. Jeter la solution du Sorensen et couver la biopsie avec 5 ml de solution cryo-protectrice O/N à 4 oC.
5. Conserver la biopsie à 4 oC si la coupe avec un cryotome est effectuée dans un délai d'une semaine; conserver la biopsie à -20 oC si la coupe est effectuée dans un délai de 3 mois; intégrer la biopsie dans un cryomold (étapes 3.2-3.4) et la stocker à -80 oC pour la conserver pendant une plus longue période de temps.

3. Coupe de tissu avec un Cryotome

1. Fixer le cryotome à -20 oC.
2. Prenez un cryomold et remplissez-le avec le milieu cryo-embedding. Évitez de créer des bulles.
3. À l'aide d'une pince à épiler, immerger la biopsie dans le milieu cryo-encastré avec l'axe longitudinal (épiderme - derme) parallèle au fond du cryomold.
4. Congelez l'échantillon avec de l'azote liquide pour obtenir un cube solide de milieu cryo-encastré contenant la biopsie dans la bonne orientation.
5. Mettre l'échantillon dans le cryostat et attendre 30 min pour permettre à la biopsie de s'acclimater.
6. Fixer l'échantillon sur le cryostat et couper des sections de 50 m.
7. À l'aide d'une petite brosse, transférer les cryosections dans une plaque de puits de 96 contenant 200 l de solution antigel dans chaque puits. Une section par puits.
8. Conserver à -20 oC.
   REMARQUE: Si l'analyse de la biopsie entière n'est pas analysée, coupez-la seulement partiellement. Dans ce cas, les sections doivent être stockées à -20 oC et la partie restante de la biopsie à -80 oC pour la conserver pendant une plus longue période de temps.

4. Staining immunofluorescence

1. Remplir une assiette de 96 puits, avec 100 l de solution de lavage.
2. Transférer les sections à analyser de la plaque de stockage à la nouvelle contenant la solution de lavage. 1 section par puits (4 sections par site anatomique, par patient : habituellement un total de 12 sections par patient).
3. Laissez la section dans la solution de lavage pendant 10 min à température ambiante (RT). Transférer la section dans un autre puits contenant la même solution et répéter le lavage.
4. Déplacer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 l de solution de blocage et incuber pendant au moins 90 min et pour un maximum de 4 h à RT.
5. Diluer les anticorps primaires anti-PGP9.5 (Rabbit polyclonal, 1:1000) et anti-5G4 (Mouse monoclonal, 1:400) dans la solution de travail.
6. Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 l de la solution de travail des anticorps primaires et les incuber O/N à RT.
7. À l'étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min à RT, avec 100 ll de solution de lavage.
8. Diluer les anticorps secondaires (conjugués avec différents fluorophores) Chèvre anti-Rabbit pour détecter PGP9.5 (1:700) et un anti-souris de chèvre pour détecter 5G4 (1:700) dans la solution de travail.
9. Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 l de la solution de travail des anticorps secondaires pendant 90 min à RT. À partir de ce point, couvrir la plaque de puits 96 avec du papier d'aluminium pour éviter le blanchiment du fluorophore conjugué avec des anticorps secondaires / ies.
10. À l'étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min, avec 100 l de la solution de lavage.
11. Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 L de DAPI (dilué 1:5 000 en PBS 1x) pendant 5 min à RT.
12. À l'étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min, avec 100 l de la solution de lavage.
13. Montez les sections sur une glissière dans la bonne position en évitant les erreurs de pliage.
14. Ajouter quelques gouttes du support de montage sur la glissière et couvrir d'un bordereau.
15. Laisser sécher les o/N avant d'utiliser le microscope confocal/fluorescence.
16. Conservez les diapositives dans une boîte appropriée à 4 oC en évitant l'exposition à la lumière. S'il est stocké avec précision, le signal sera visible pendant environ 6 mois.
    REMARQUE: Le transfert d'une section de la plaque de puits 96 contenant les tranches nouvellement coupées à la plaque de puits 96 contenant la solution de lavage (étape 4.1) est effectué à l'aide d'une petite brosse qui aide à ramasser la biopsie. Après le transfert de la section dans le premier puits, chaque fois que la tranche doit être incubée avec une solution différente, déplacez-la de bien à bien avec l'aide de la brosse.

5. Imagerie immunofluorescence

1. Afficher les sections sous un microscope à fluorescence inversée ou un microscope confocal (20X, 40x ou grossissement supérieur, utiliser des cadres successifs de 2 par incréments de m sur un plan Z-stack pour de meilleurs résultats).
2. Acquérir des images par une caméra connectée au microscope
3. Utiliser un logiciel d'imagerie adéquat (c.-à-d. ImageJ) pour analyser les signaux positifs en sections en termes de distribution spatiale et d'intensité du signal. Pour ce faire, effectuer les étapes mentionnées ci-dessous.
   1. Ouvrez le fichier avec le logiciel ImageJ.
   2. Cliquez sur l'image 'gt; couleur 'gt; canaux de fractionnement afin d'analyser chaque canal de couleur.
   3. Cliquez sur L'image 'gt; pile 'gt; Z projet pour obtenir une fusion d'acquisitions de sections multiples.
   4. Cliquez sur L'image 'gt; couleur 'gt; fusionner les canaux pour obtenir une fusion de différents canaux de couleur de la même acquisition.

Solution antigel (magasinà à 4 oC jusqu'à 6 mois)	30% de glycérol 30% d'éthylène glycol 30% dH2O 10% 2x tampon de phosphate
Solution de blocage (préparer pour le moment)	4% Sérum de chèvre normal 1% Triton X-100 dans la solution de lavage
Cryo-protecteur (magasinà à 4 oC jusqu'à 6 mois)	20% de glycérol 80% la solution de Sorensen
Solution de phosphate d'hydrogène disodium (magasin à RT jusqu'à 6 mois)	0.45M Phosphate d'hydrogène disodium (Na2HPO4) en dH2O Filtrer dans une bouteille stérile
Solution Lysine (magasinà à 4 oC jusqu'à 3 semaines)	50% de la solution monohydrochlorure L-Lysine de 0,3 M 50% de la solution de 0,1M Sorensen pH7.6 pH 7.4, filtre dans une bouteille stérile
Paraformaldéhyde (PFA) 8% (préparer sous le capot de fumée et le conserver à 4 oC jusqu'à 1 mois)	2,6 M PFA en dH2O (à 55 oC, ne dépasse pas 60 oC pour éviter la formation d'acide formique) filtre dans une bouteille stérile
Tampon de phosphate 2x (magasinà à 4 oC jusqu'à 6 mois)	6% De phosphate monosodique (NaH2PO4) solution 45% phosphate de disodium (Na2HPO4) solution en dH2O
Solution fixative PLP (préparer pour le moment, sous le capot de fumée )	25% Paraformaldéhyde 8% 0,01 M sodium (méta)période 75% Lysine solution-lt;
Monohydrate de phosphate de dihydrogène de sodium (magasin à RT jusqu'à 6 mois)	0.52M Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate (NaH2PO4-H2O) en dH2O Filtrer dans une bouteille stérile.
La solution de Sorensen (magasinà à 4 oC jusqu'à 1 mois)	2,5% Solution de phosphate monosodique 18,7% Solution de phosphate de disodium pH7.6, en dH2O
Solution de lavage (préparer pour le moment)	0.25M Base de Trizma 0,26 M NaCl pH7.6, en dH2O
Solution de travail (préparer pour le moment)	50% Solution de blocage 50% Solution de lavage

Tableau 1 : Solutions requises. Liste des solutions requises pour le protocole et brève description de la façon de le préparer.

Résultats

Après la procédure décrite (Figure 1), nous avons détecté des agrégats de Syn, étiquetés avec l'anticorps 5G4, dans les fascicles de nerf dermique intériorisant des structures autonomes des patients de. La morphologie des dépôts d'alpha-synucléine apparaît comme un signal pointillé le long des axones des nerfs dermiques (Figure 2). En effet, en exploitant ce protocole dans 19 patients de et 17 contrôles dans des biopsies de peau à trois emplaceme...

Discussion

Nous décrivons un analyse d'immunofluorescence flottante pour des biopsies de peau pour le diagnostic de : il exploite l'immunostaining double avec l'anticorps anti-PGP9.5, un marqueur panaxonal, et anti-5G4, un anticorps spécifique de conformation qui reconnaît la forme agrégée de Syn.

Les grands avantages de la biopsie de peau pour le but diagnostique dans la MP et probablement dans d'autres désordres conformationnels de protéine sont : 1) l'accès direct au tissu nerveux enclin à la...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium