Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Kutane periphere Nervenfasern durch frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für einen frei schwebenden indirekten Immunfluoreszenz-Assay auf Hautbiopsieabschnitten vor, das die Identifizierung von krankheitsspezifischen Konformationsvarianten von Alpha-Synuclein ermöglicht, die an der Parkinson-Krankheit und mehreren Proteinen der peripheren Nervensystems.

Zusammenfassung

Bis heute steht für die meisten neurodegenerativen Erkrankungen nur eine postmortale histopathologische definitive Diagnose zur Verfügung. Bei der Parkinson-Krankheit (PD) beruht die Diagnose immer noch nur auf klinischen Anzeichen einer motorischen Beteiligung, die später im Krankheitsverlauf auftreten, wenn die meisten dopaminergen Neuronen bereits verloren sind. Daher besteht ein starker Bedarf an einem Biomarker, der Patienten zu Beginn der Krankheit oder mit dem Risiko, sie zu entwickeln, identifizieren kann. In den letzten Jahren hat sich die Hautbiopsie als ausgezeichnetes Forschungs- und Diagnoseinstrument für periphere Nervenkrankheiten wie kleine Faserneuropathie erwiesen. Interessanterweise, eine kleine Faser Neuropathie und Alpha-Synuclein (Syn) neuronale Ablagerungen wurden durch Hautbiopsie bei PD-Patienten gezeigt. Tatsächlich hat die Hautbiopsie den großen Vorteil, dass sie ein leicht zugängliches, minimalinvasives und schmerzloses Verfahren ist, das die Analyse von peripherem Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, die Hautbiopsie im Zuge der Nachbeobachtung desselben Patienten zu wiederholen, die Untersuchung der Längskorrelation mit dem Krankheitsverlauf. Wir haben ein standardisiertes, zuverlässiges Protokoll eingerichtet, um das Vorhandensein von Syn-Aggregaten in den Hautnervenfasern des PD-Patienten zu untersuchen. Dieses Protokoll beinhaltet nur wenige kurze Fixierungsschritte, eine Kryotome-Sektion und dann eine frei schwebende Immunfluoreszenz-Doppelfärbung mit zwei spezifischen Antikörpern: Antiprotein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), um die hautförmigen Nervenfasern zu markieren, und Anti-5G4 zum Nachweis Syn-Aggregate. Es ist ein vielseitiges, empfindliches und einfach durchzuführendes Protokoll, das auch für andere Proteine angewendet werden kann, die für Hautnerven von Interesse sind. Die Fähigkeit, Syn-Aggregate zu markieren, ist ein weiterer Schritt nach vorn bei der Verwendung der Hautbiopsie als Werkzeug zur Etablierung einer vor-mortem histopathologischen Diagnose von PD.

Einleitung

Die Hautbiopsie hat als diagnostisches und forschungsmedizinisches Instrument im Bereich neurologischer Erkrankungen¹eine große Bedeutung erlangt. Tatsächlich enthalten Epidermis und Dermis reichlich somatische sensorische Nervenfasern (myeliniert und unmyeliniert), nozizeptive freie Nervenenden, sensorische Rezeptoren und autonome Innervation von Schweißdrüsen, Gefäßen, Talgdrüsen und Muskelarrector Pilorum ².

In der Mitte des 20. Jahrhunderts erlaubte das Setup für die Immunhistochemie von PGP9.5-Antikörpern den Nachweis einer umfangreichen Innervation der menschlichen Epidermis-Säugetierhaut³. PGP9.5 ist eine Carboxyl-Terminal-Hydrolase, die gleichmäßig entlang von Axonen des zentralen und peripheren Nervensystems (PNS) verteilt ist. Die Verfügbarkeit dieses Antikörpers ermöglichte es nicht nur, die Morphologie und Anatomie von PNS in der Haut zu klären, sondern auch die Untersuchung von damit verbundenen Krankheiten^3,4. Die Hautbiopsie trug zur Definition einer neuen klinischen Einheit bei: der kleinen Faserneuropathie. Mehrere internationale Gruppen demonstrierten den Zusammenhang zwischen dem Verlust von intraepidermalen Nervenfasern und Symptomen/Zeichen einer kleinen Faserneuropathie⁵ durch Hautbiopsieanalyse und lieferten standardisierte Protokolle für die Nervenmorphometrie sowie normative Referenzwerte, die in der klinischen Praxis verwendet werden sollen^6,7,8.

Kürzlich hat eine große Menge an Beweisen gezeigt, dass neurodegenerative Erkrankungen, gekennzeichnet durch falsch gefaltete Proteinansammlungen im zentralen Nervensystem, Multisystempathologien^{sind 9}. In der Tat, PD ist gekennzeichnet durch die Syn-Akkumulation im dopaminergen Neuron von Substantia nigra, aber es wurde gezeigt, dass ,Syn und seine pathologische Form, phosphoryliertes Syn (P-Syn), auch in den peripheren Geweben nachgewiesen werden konnte. Magen-Darm-Schleimhaut¹⁰, Speicheldrüsen¹¹, hautautonome Fasern um Schweißdrüsen und pilomotorische Muskeln^12,13,14, zeigen Immunreaktivität zu pathogenen Formen von Syn, in nach Braak Hypothese, dass faszinierend postulieren, dass 'Syn Pathologie kann in PNS lange im Voraus beginnen, vor seiner Akkumulation im Gehirn¹⁵. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von p-Syn in Hautnerven von Patienten mit REM-Verhaltensstörungen nachgewiesen, die als prodromal PD¹⁶,¹⁷ gelten, so dass hautpathologische Syn als vielversprechende frühe periphere histopathologischen Marker der Synukenopathie.

Der Zusammenhang der kleinen Faserneuropathie in PD wurde bereits gezeigt und es wurde festgestellt, dass intraepidermale Nervenfasern Dichte reflektiert Krankheitsprogression^18,19. Daher ist die Hautbiopsie ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Neurodegeneration bei PD und für die Etablierung einer vor-mortem histopathologischen Diagnose der Krankheit. Tatsächlich hat die Hautbiopsie einen großen Vorteil, ein leicht zugängliches und minimalinvasives Verfahren zu sein, das die Analyse von Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist. Schließlich ermöglicht die Möglichkeit, die Hautbiopsie im Zuge der Nachbeobachtung der gleichen Patienten zu wiederholen, die Untersuchung der Längskorrelation mit dem Fortschreiten der Erkrankung.

In unserem Labor, die Nutzung einer doppelten Immunfärbung mit PGP9.5 und dem konformen monoklonalen 5G4-Antikörper, der krankheitsspezifische Formen von Syn einschließlich kleiner Aggregate^20,21, erkennt, konnten wir die Vorhandensein von Syn-Aggregaten in Hautnerven mit einer vielversprechenden hohen diagnostischen Effizienz¹⁹. Die Immunfluoreszenzanalyse der Hautbiopsie bei Konformationserkrankungen zeichnet sich als vielversprechende Quelle von Biomarkern aus, indem sowohl der Nachweis von Proteinaggregaten als auch das Maß der Neurodegeneration in vivo kombiniert werden. Im Folgenden veranschaulichen wir ein einfaches und vielseitiges Protokoll über den Umgang mit der Hautbiopsie und die Durchführung der frei schwebenden Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis von Syn-Aggregaten. Darüber hinaus kann dieses Protokoll angepasst werden, um jedes andere Protein von Interesse, das in Haut-PNS ausgedrückt wird, zu zielen.

Das folgende Studienprotokoll wurde verwendet, um den diagnostischen Nutzen der aggregierten Syn-Analyse in den PNS von PD durch Hautbiopsie¹⁹zu bewerten. Inklusionskriterien für PD waren: eine definitive klinische Diagnose nach den diagnostischen Kriterien der UK Brain Bank, die Krankheitsdauer von mindestens 3 Jahren, keine Familiengeschichte und keine größeren kognitiven Beeinträchtigungen oder großen dysautonomen Symptome in der Geschichte. Ausschlusskriterien waren bekannte Ursachen der Neuropathie (glykiertes Hämoglobin, Kreatinin, Vitamin B12, TSH, Serumimmunfixation, HIV, HCV, Syphilis und Borreliose). Jedes Subjekt wurde an drei anatomischen Stellen (Hals bei C8-Dermatomal, Oberschenkel 10 cm über dem Knie, Bein 10 cm über seitlichem Malleolus) seitlich mit 3 mm Durchmesser biopsien, was klinisch stärker betroffen war. Im Allgemeinen geht es im folgenden Protokoll um den Umgang mit der Hautbiopsie und die Durchführung der frei schwebenden Immunfluoreszenzfärbung und -analyse. Daher kann es angepasst und für den Nachweis anderer Proteine von Interesse im Hautgewebe verwendet werden.

Protokoll

Das Protokoll wurde von der kantonalen Ethikkommission genehmigt und alle eingeschriebenen Probanden gaben der Studie schriftlich ihre Zustimmung.

1. Hautbiopsie-Sammlung

1. Lassen Sie einen qualifizierten Arzt die Hautbiopsie in einem geeigneten klinischen Umfeld durchführen.
2. Wählen Sie den Bereich, um die Hautbiopsie durchzuführen und reinigen Sie sie mit einem Alkoholtupfer.
3. Bereiten Sie die Anästhetikumlösung mit 1 cc Lidocain 2%.
4. Mit der Nadel parallel zum Bereich, injizieren lokale Anästhesie subkutan.
5. Nach der Überprüfung der Wirkung der Anästhesie, nehmen Sie die 3 mm Einweg-Stanz und wenden Sie Rotations- und empfindlichen Abwärtsdruck, um es nach unten durch die Epidermis und Dermis zu drehen, bis das subkutane Fett erreicht ist.
6. Ziehen Sie den Stempel zurück.
7. Verwenden Sie Einwegzange, um den Hautstecker vorsichtig nach oben zu ziehen.
8. Verwenden Sie eine Schere, um die Basis der Probe auf der Ebene des Fettgewebes auszuschneiden.
9. Legen Sie die Probe in ein Rohr, das 10 ml Periodat-Lysin-Paraformaldehyd (PLP) fixative Lösung enthält.
10. Desinfizieren Sie den Bereich und bedecken Sie ihn mit einem Klebeband.

2. Gewebefixierung und Lagerung

1. Erstellen Sie eine neue PLP-Fixierungslösung (siehe Tabelle 1).
2. Unmittelbar nach der Entnahme der Hautbiopsie in ein Rohr mit 10 ml PLP-Fixierlösung tauchen und über Nacht (O/N) bei 4 °C inkubieren.
3. Am Tag danach, unter der Dunstabzugshaube, entfernen Sie die PLP Fixativ sanft und in der gleichen Röhre, waschen Sie die Biopsie 3 mal für 5 min mit 5 ml von 0,1 M Sorensen Lösung (Tabelle 1).
4. Entsorgen Sie die Lösung des Sorensen und inkubieren Sie die Biopsie mit 5 ml kryoschützender Lösung O/N bei 4 °C.
5. Die Biopsie bei 4 °C aufbewahren, wenn der Schnitt mit einem Kryotom innerhalb von 1 Woche durchgeführt wird; die Biopsie bei -20 °C aufbewahren, wenn der Schnitt innerhalb von 3 Monaten durchgeführt wird; die Biopsie in einen Kryomold (Schritte 3.2-3.4) einbetten und bei -80 °C lagern, um sie über einen längeren Zeitraum zu konservieren.

3. Gewebeschnitt mit einem Kryotome

1. Setzen Sie das Kryotome auf -20 °C.
2. Nehmen Sie einen Kryomold und füllen Sie es mit dem Kryo-Einbettungsmedium. Vermeiden Sie blasen.
3. Mit einer Pinzette tauchen Sie die Biopsie in das Kryo-Einbettungsmedium mit der Längsachse (Epidermis - Dermis) parallel zum Boden des Kryomolds ein.
4. Fangen Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein, um einen festen Würfel mit Kryo-Einbettungsmedium zu erhalten, das die Biopsie in der richtigen Ausrichtung enthält.
5. Legen Sie die Probe in den Kryostat und warten Sie 30 min, damit sich die Biopsie akklimatisiert.
6. Fixieren Sie die Probe auf dem Kryostat und schneiden Sie 50 m Abschnitte.
7. Mit Hilfe einer kleinen Bürste die Kryo-Sektionen in eine 96-Well-Platte mit 200 l Frostschutzlösung in jedem Brunnen übertragen. Ein Abschnitt pro Brunnen.
8. Bei -20 °C lagern.
   HINWEIS: Wenn die Analyse der gesamten Biopsie nicht analysiert wird, schneiden Sie sie nur teilweise. In diesem Fall müssen die Abschnitte bei -20 °C und der verbleibende Teil der Biopsie bei -80 °C gelagert werden, um sie über einen längeren Zeitraum zu konservieren.

4. Immunfluoreszenz Färbung

1. Füllen Sie eine 96-Well-Platte mit 100 l Waschlösung.
2. Übertragen Sie die zu analysierenden Abschnitte von der Lagerplatte auf die neue, die die Waschlösung enthält. 1 Abschnitt pro Brunnen (4 Abschnitte pro anatomischer Stelle, pro Patient: in der Regel insgesamt 12 Abschnitte pro Patient).
3. Lassen Sie den Abschnitt in der Waschlösung für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Übertragen Sie den Abschnitt in einen anderen Brunnen, der die gleiche Lösung enthält, und wiederholen Sie die Wäsche.
4. Verschieben Sie die Abschnitte in neue Brunnen, die 100 l Blockierlösung enthalten, und brüten Sie für mindestens 90 min und für maximal 4 h bei RT.
5. Verdünnen Sie die primären Antikörper Anti-PGP9.5 (Rabbit polyklonal, 1:1000) und Anti-5G4 (Maus monoklonal, 1:400) in der Arbeitslösung.
6. Übertragen Sie die Abschnitte in neue Brunnen, die 100 l der Arbeitslösung der primären Antikörper enthalten, und inkubieren Sie sie O/N bei RT.
7. Waschen Sie die Abschnitte in Schritt 4.3 2 mal für mindestens 10 min bei RT, mit 100 l Waschlösung.
8. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper (Konjugat mit verschiedenen Fluorophoren) Ziege Anti-Rabbit, um PGP9.5 (1:700) und eine Ziege Anti-Maus zu erkennen, um 5G4 (1:700) in der Arbeitslösung zu erkennen.
9. Übertragen Sie die Abschnitte in neue Brunnen, die 100 l der Arbeitslösung der Sekundärantikörper für 90 min bei RT enthalten. Von diesem Punkt aus bedecken Sie die 96-Well-Platte mit Aluminiumfolie, um das Bleichen von Fluorophor konjugiert mit Sekundärantikörpern zu vermeiden.
10. Waschen Sie die Abschnitte in Schritt 4.3 2 mal für mindestens 10 min, wobei 100 l der Waschlösung.
11. Übertragen Sie die Abschnitte in neue Brunnen mit 100 l DAPI (verdünnt 1:5.000 in PBS 1x) für 5 min bei RT.
12. Waschen Sie die Abschnitte in Schritt 4.3 2 mal für mindestens 10 min, wobei 100 l der Waschlösung.
13. Montieren Sie die Abschnitte auf einer Folie in der richtigen Position, um Fehlfalten zu vermeiden.
14. Fügen Sie ein paar Tropfen des Montagemediums auf dem Schlitten und Abdeckung mit einem Deckelschlupf.
15. Lassen Sie die Dias O/N trocknen, bevor Sie das Konfokal-/Fluoreszenzmikroskop verwenden.
16. Bewahren Sie die Dias in einer geeigneten Box bei 4 °C auf, um die Lichteinwirkung zu vermeiden. Bei genauer Speicherung ist das Signal ca. 6 Monate lang sichtbar.
    HINWEIS: Die Übertragung eines Abschnitts von der 96-Wellplatte mit den neu geschnittenen Scheiben auf die 96-Well-Platte mit der Waschlösung (Schritt 4.1) erfolgt mit einer kleinen Bürste, die hilft, die Biopsie aufzunehmen. Nach der Übertragung des Abschnitts in den ersten Brunnen, jedes Mal, wenn die Scheibe mit einer anderen Lösung inkubiert werden muss, bewegen Sie es von gut zu gut mit Hilfe des Pinsels.

5. Immunfluoreszenz-Bildgebung

1. Zeigen Sie Abschnitte unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop (20X, 40x oder höher Vergrößerung, verwenden Sie aufeinanderfolgende Frames von 2 m Schritten auf einem Z-Stack-Plan für beste Ergebnisse).
2. Bilder mit einer mit dem Mikroskop verbundenen Kamera erfassen
3. Verwenden Sie eine geeignete Bildgebungssoftware (z.B. ImageJ), um positive Signale in Abschnitten in Bezug auf räumliche Verteilung und Intensität des Signals zu analysieren. Führen Sie dazu die unten beschriebenen Schritte aus.
   1. Öffnen Sie die Datei mit ImageJ-Software.
   2. Klicken Sie auf Bild > Farbe > Geteilte Kanäle, um jeden Farbkanal zu analysieren.
   3. Klicken Sie auf Bild > Stapel > Z-Projekt, um eine Zusammenführung mehrerer Abschnittserfassungen zu erhalten.
   4. Klicken Sie auf Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen, um eine Zusammenführung verschiedener Farbkanäle derselben Erfassung zu erhalten.

Frostschutzlösung (bei 4 °C bis zu 6 Monate lagern)	30% Glycerin 30% Ethylenglykol 30% dH2O 10% 2x Phosphatpuffer
Blockierlösung (vorbereitung im Moment)	4% Normales Ziegenserum 1% Triton X-100 in Waschlösung
Kryo-Schutz (bei 4 °C bis zu 6 Monate lagern)	20% Glycerin 80% Sorensens Lösung
Dinatriumhydrogenphosphatlösung (Lager bei RT bis zu 6 Monate)	0,45M Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) in dH2O Filter in einer sterilen Flasche
Lysin-Lösung (bei 4 °C bis zu 3 Wochen lagern)	50% der 0,3 M L-Lysin-Monohydrochloridlösung 50% der 0,1Mio Sorensen-Lösung pH7,6 pH 7,4, Filter in einer sterilen Flasche
Paraformaldehyd (PFA) 8% (unter Rauchhaube vorbereiten und bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern)	2,6 M PFA in dH2O (bis 55°C_nicht überschreiten 60 °C, um die Bildung von Ameisensäure zu vermeiden) Filter in einer sterilen Flasche
Phosphatpuffer 2x (bei 4 °C bis zu 6 Monate lagern)	6% Mononatriumphosphat (NaH2PO4) Lösung 45% Dinatriumphosphat (Na2HPO4) Lösung in dH2O
PLP-Fixlösung (bereiten Sie sich im Moment, unter Rauchhaube )	25% Paraformaldehyd 8% 0,01M Natrium (Meta)Periodat 75% Lysin-Lösung<
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (Lager bei RT bis zu 6 Monate)	0,52M Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4*H2O) in dH2O Filtern Sie in einer sterilen Flasche.
Sorensens Lösung (bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern)	2,5% Mononatriumphosphatlösung 18,7% Dinatriumphosphatlösung pH7.6, in dH2O
Waschlösung (vorbereitung im Moment)	0,25 M Trizma Basis 0,26 M NaCl pH7.6, in dH2O
Arbeitslösung (vorbereitung im Moment)	50% Blockierlösung 50% Waschlösung

Tabelle 1: Erforderliche Lösungen. Liste der erforderlichen Lösungen für das Protokoll und kurze Beschreibung der Vorbereitung.

Ergebnisse

Nach dem beschriebenen Verfahren (Abbildung 1) haben wir Syn-Aggregate, mit 5G4-Antikörpern gekennzeichnet, in dermalen Nervenfasziden festgestellt, die autonome Strukturen von PD-Patienten innervieren. Die Morphologie der Alpha-Synuclein-Ablagerungen erscheint als gepunktetes Signal entlang der Axone dermaler Nerven (Abbildung 2). In der Tat, ausnutzen dieses Protokoll bei 19 PD-Patienten und 17 Kontrollen in Hautbiopsien an drei anatomischen Stelle (Zervix, O...

Diskussion

Wir beschreiben einen frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay für Hautbiopsien zur Diagnose von PD: Er nutzt die doppelte Immunfärbung mit Anti-PGP9.5-Antikörpern, einem panaxonalen Marker und Anti-5G4, einem konformationsspezifischen Antikörper, der die aggregierte Form erkennt. von Syn.

Die großen Vorteile der Hautbiopsie zu diagnostischen Zwecken bei PD und möglicherweise bei anderen Proteinkonformationsstörungen sind: 1) der direkte Zugang zu krankheitsanfälligem Nervengewebe durch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium