Dirigido a agregados de alfa sinucleína en fibras nerviosas periféricas cutáneas por el ensayo de inmunofluorescencia de flotación libre

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de inmunofluorescencia indirecta de flotación libre en secciones de biopsia de piel que permite la identificación de variantes de conformación específicas de la enfermedad de la sinucleína alfa implicadas en la enfermedad de Parkinson y múltiples proteínas de la sistema nervioso periférico.

Resumen

Hasta la fecha, para la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas sólo se dispone de un diagnóstico definitivo histopatológico post mortem. Para la enfermedad de Parkinson (PD), el diagnóstico todavía se basa sólo en los signos clínicos de afectación motora que aparecen más adelante en el curso de la enfermedad, cuando la mayoría de las neuronas dopaminérgicas ya se han perdido. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de un biomarcador que pueda identificar a los pacientes al comienzo de la enfermedad o a riesgo de desarrollarla. En los últimos años, la biopsia de piel ha demostrado ser una excelente herramienta de investigación y diagnóstico para enfermedades de los nervios periféricos como la neuropatía de fibra pequeña. Curiosamente, una pequeña neuropatía de fibra y depósitos neuronales alfa de sinucleína (Syn) se han demostrado mediante biopsia de piel en pacientes con DP. De hecho, la biopsia de piel tiene la gran ventaja de ser un procedimiento fácilmente accesible, mínimamente invasivo e indoloro que permite el análisis de tejido nervioso periférico propenso a la patología. Además, la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento del mismo paciente permite estudiar la correlación longitudinal con la progresión de la enfermedad. Creamos un protocolo estandarizado y confiable para investigar la presencia de agregados de Syn en las fibras nerviosas de la piel del paciente con DP. Este protocolo implica algunos pasos cortos de fijación, un corte criotomo y luego una doble tinción de inmunofluorescencia flotante con dos anticuerpos específicos: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) para marcar las fibras nerviosas cutáneas y anti 5G4 para detectar Agregados de Syn. Es un protocolo versátil, sensible y fácil de realizar que también se puede aplicar para apuntar a otras proteínas de interés en los nervios de la piel. La capacidad de marcar los agregados de La sinción es otro paso adelante en el uso de la biopsia de piel como herramienta para establecer un diagnóstico histopatológico premortem de DP.

Introducción

La biopsia de piel ha adquirido una gran importancia como herramienta de diagnóstico e investigación en el campo de los trastornos neurológicos¹. De hecho, la epidermis y la dermis contienen abundantes fibras nerviosas sensoriales somáticas (mielinizadas y no mielinizadas), terminaciones nerviosas libres nociceptivas, receptores sensoriales e inervación autonómica de glándulas sudoríparas, vasos, glándulas sebáceas y arrector muscular pilorum ².

A mediados del siglo XX, la configuración de la inmunohistoquímica del anticuerpo PGP9.5 permitió la evidencia de una extensa ertración de la piel de mamífero de epidermis humana³. PGP9.5 es una hidrolasa carboxilo-terminal distribuida equitativamente a lo largo de los axones del sistema nervioso central y periférico (PNS). La disponibilidad de este anticuerpo permitió no sólo aclarar la morfología y anatomía del PNS en la piel, sino que también implementó el estudio de enfermedades asociadas a él^3,4. La biopsia de piel contribuyó a definir una nueva entidad clínica: la neuropatía de fibra pequeña. Varios grupos internacionales demostraron la asociación entre la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmicas y los síntomas/signos de la neuropatía de fibra pequeña⁵ mediante el análisis de biopsia de piel y proporcionaron protocolos estandarizados para la morfometría nerviosa, así como valores de referencia normativaqueales que se utilizarán en la práctica clínica^6,7,8.

Recientemente una gran cantidad de evidencia ha demostrado que las enfermedades neurodegenerativas, caracterizadas por acumulacionesde proteínas mal plegadas en el sistema nervioso central, son patologías multisistema 9. De hecho, la DP se caracteriza por la acumulación de Sinyn en la neurona dopaminérgica de la sustancia nigra,pero se ha demostrado que el syn y su forma patológica, fosforilado sinyn (P-Syn), podrían ser detectados también en los tejidos periféricos. Mucosa gastro-intestinal¹⁰, glándulas salivales¹¹, fibras autonómicas de la piel que rodean las glándulas sudoríparas y los músculos pilomotor12,^13,14, muestran inmunorreactividad a las formas patógenas de la sinía, en de acuerdo con la hipótesis de Braak de que intrigantemente postular que la patología de La Sinis puede comenzar en PNS con mucha antelación, antes de su acumulación en el cerebro¹⁵. Además, se ha demostrado la presencia de p-Syn en los nervios de la piel de pacientes con Trastornos del Comportamiento REM que se consideran PD¹⁶prodrómico,¹⁷ por lo tanto patológico de la piel - Syn puede ser considerado un prometedor periférico temprano periférico marcador histopatológico de la sinucleinopatía.

La asociación de la neuropatía de fibra pequeña en la DP se ha demostrado previamente y se ha encontrado que la densidad de las fibras nerviosas intraepidémicas refleja la progresión de la enfermedad^18,19. Por lo tanto, la biopsia de piel es una herramienta útil para estudiar la neurodegeneración en PD y para establecer un diagnóstico histopatológico premortem de la enfermedad. De hecho, la biopsia de piel tiene una gran ventaja de ser un procedimiento fácilmente accesible y mínimamente invasivo, permitiendo el análisis de tejido nervioso propenso a la patología. Finalmente, la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento de los mismos pacientes permite estudiar la correlación longitudinal con la progresión de la enfermedad.

En nuestro laboratorio, explotando una doble inmuno-mancha con PGP9.5 y el anticuerpo monoclonal 5G4 específico de la conformación, que reconoce las formas específicas de la enfermedad de Syn incluyendo pequeños agregados^20,21, pudimos mostrar el presencia de agregados de la piel con una alta eficiencia diagnóstica^{prometedora 19}. El análisis de inmunofluorescencia de la biopsia de piel en enfermedades conformacionales destaca como una fuente prometedora de biomarcadores al combinar tanto la detección de agregados proteicos como la medida de la neurodegeneración in vivo. A partir de ahora, ilustramos un protocolo fácil y versátil sobre el manejo de la biopsia de piel y la realización de la tinción de inmunofluorescencia flotante para detectar agregados de Syn. Además, este protocolo se puede adaptar para atacar cualquier otra proteína de interés expresada en el PNS de la piel.

El siguiente protocolo de estudio se ha utilizado para evaluar la utilidad diagnóstica del análisis agregado de Syn en el PNS de la DP mediante biopsia de piel¹⁹. Los criterios de inclusión para la DP fueron: un diagnóstico clínico definitivo de acuerdo con los criterios de diagnóstico del Banco del Cerebro del Reino Unido, duración de la enfermedad al menos 3 años, sin antecedentes familiares y sin deterioro cognitivo importante o síntomas disautonómicos importantes en la historia. Los criterios de exclusión eran causas conocidas de neuropatía (hemoglobina glicada, creatinina, vitamina B12, TSH, inmunofijación sérica, VIH, VHC, sífilis y borreliosis). Cada sujeto se sometió a biopsias cutáneas de 3 mm de diámetro en tres sitios anatómicos (cuello a nivel dermatómico C8, muslo 10 cm por encima de la rodilla, pierna 10 cm por encima del maléolo lateral) en el lado, que fue clínicamente más afectado. En general, el siguiente protocolo trata de manejar la biopsia de piel y realizar la tinción y análisis de inmunofluorescencia flotante. Por lo tanto, se puede adaptar y utilizar para la detección de otras proteínas de interés en el tejido de la piel.

Protocolo

El protocolo ha sido aprobado por el Comité Cantonal de ética y todos los sujetos inscritos dieron su consentimiento informado por escrito al estudio.

1. Colección de biopsia de piel

1. Permita que un médico calificado realice la biopsia de piel en un entorno clínico adecuado.
2. Elija el área para realizar la biopsia de piel y límpiela con un hisopo de alcohol.
3. Preparar la solución anestésica con 1 cc de lidocaína 2%.
4. Con la aguja paralela a la zona, inyecte anestesia local por vía subcutánea.
5. Después de comprobar el efecto de la anestesia, tomar el punzón desechable de 3 mm y aplicar presión descendente rotacional y delicada para girarlo hacia abajo a través de la epidermis y la dermis, hasta que se alcance la grasa subcutánea.
6. Retira el ponche.
7. Utilice fórceps desechables para tirar suavemente del tapón de la piel.
8. Use tijeras para cortar la base de la muestra a nivel del tejido graso.
9. Coloque la muestra en un tubo que contenga 10 ml de solución fijadora de periodo-lisina-paraformaldehído (PLP).
10. Desinfectar el área y cubrirla con un vendaje adhesivo.

2. Fijación y almacenamiento de tejidos

1. Realice una solución fijativa PLP fresca (ver Tabla 1).
2. Inmediatamente después de la recolección de la biopsia de piel, sumergirla en un tubo que contenga 10 ml de solución fijadora plP e incubarla durante la noche (O/N) a 4 oC.
3. Al día siguiente, bajo la campana de humos, retire el fijador PLP suavemente y en el mismo tubo, lave la biopsia 3 veces durante 5 min con 5 ml de la solución de 0,1 M Sorensen (Tabla1).
4. Deseche la solución del Sorensen e incubar la biopsia con 5 ml de solución crioprotectora O/N a 4oC.
5. Conservar la biopsia a 4oC si el corte con criotome se realiza en el plazo de 1 semana; almacenar la biopsia a -20 oC si el corte se realiza en un plazo de 3 meses; incrustar la biopsia en un criomold (pasos 3.2-3.4) y almacenarla a -80 oC para conservarla durante un período de tiempo más largo.

3. Corte de tejido con un criotome

1. Poner el criotome a -20 oC.
2. Toma un criomold y llénalo con el medio de incrustación crio- Evite crear burbujas.
3. Usando pinzas sumergir la biopsia en el medio de incrustación crio-con el eje longitudinal (epidermis - dermis) paralelo a la parte inferior del criomold.
4. Congele la muestra con nitrógeno líquido para obtener un cubo sólido de medio de incrustación criogénica que contenga la biopsia en la orientación correcta.
5. Ponga la muestra en el criostato y espere 30 minutos para permitir que la biopsia se aclimate.
6. Fijar la muestra en el criostato y cortar secciones de 50 m.
7. Con la ayuda de un cepillo pequeño, transfiera las criosecciones en una placa de 96 pocillos que contenga 200 ml de solución anticongelante en cada pocil. Una sección por pozo.
8. Conservar a -20oC.
   NOTA: Si no se analiza el análisis completo de la biopsia, córtala solo parcialmente. En este caso, las secciones deben almacenarse a -20 oC y la parte restante de la biopsia a -80 oC para conservarla durante un período de tiempo más largo.

4. Mancha de inmunofluorescencia

1. Llene una placa de 96 pocillos, con 100 ml de solución de lavado.
2. Transfiera las secciones a analizar de la placa de almacenamiento a la nueva que contenga la solución de lavado. 1 sección por cada pozo (4 secciones por sitio anatómico, por paciente: por lo general un total de 12 secciones por paciente).
3. Deje la sección en la solución de lavado durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). Transfiera la sección a otro pozo que contenga la misma solución y repita el lavado.
4. Mover las secciones a nuevos pozos que contengan 100 ml de solución de bloqueo e incubar durante al menos 90 min y durante un máximo de 4 h a RT.
5. Diluir los anticuerpos primarios anti-PGP9.5 (Rabbit polyclonal, 1:1000) y anti-5G4 (Ratón monoclonal, 1:400) en la solución de trabajo.
6. Transfiera las secciones a nuevos pozos que contengan 100 ml de la solución de trabajo de los anticuerpos primarios e incubarlas en RT.
7. Como paso 4.3, lave las secciones 2 veces durante al menos 10 minutos a RT, con 100 sal de solución de lavado.
8. Diluir los anticuerpos secundarios (conjugadocon diferentes fluoróforos) Cabra anti-Conejo para detectar PGP9.5 (1:700) y un anti-ratón de cabra para detectar 5G4 (1:700) en la solución de trabajo.
9. Transfiera las secciones a nuevos pozos que contengan 100 ml de la solución de trabajo de los anticuerpos secundarios durante 90 minutos a RT. A partir de este punto, cubrir la placa de 96 pozos con papel de aluminio para evitar el blanqueo de fluoróforo conjugado con anticuerpos secundarios.
10. Como paso 4.3, lave las secciones 2 veces durante al menos 10 min, con 100 sL de la solución de lavado.
11. Transfiera las secciones a nuevos pozos que contengan 100 ml de DAPI (diluido 1:5.000 en PBS 1x) durante 5 min en RT.
12. Como paso 4.3, lave las secciones 2 veces durante al menos 10 min, con 100 sL de la solución de lavado.
13. Monte las secciones de una diapositiva en la posición correcta evitando el desdoblamiento.
14. Agregue unas gotas del medio de montaje en la diapositiva y cúbrala con un cubreobjetos.
15. Deje que los portaobjetos se sequen con O/N antes de utilizar el microscopio confocal/fluorescencia.
16. Conservar las diapositivas en una caja adecuada a 4oC evitando la exposición a la luz. Si se almacena con precisión, la señal será visible durante unos 6 meses.
    NOTA: La transferencia de una sección de la placa de pozo 96 que contiene las rodajas recién cortadas a la placa de 96 pozos que contiene la solución de lavado (paso 4.1) se realiza utilizando un pequeño cepillo que ayuda a recoger la biopsia. Después de la transferencia de la sección al primer pozo, cada vez que la rebanada necesita ser incubada con una solución diferente, muévela de bien a pozo con la ayuda del cepillo.

5. Imágenes de inmunofluorescencia

1. Vea secciones bajo un microscopio de fluorescencia invertida o un microscopio confocal (aumento 20X, 40x o superior, utilice fotogramas sucesivos de incrementos de 2 m en un plan de pila Z para obtener mejores resultados).
2. Adquirir imágenes por una cámara conectada por microscopio
3. Utilice un software de imagen adecuado (es decir, ImageJ) para analizar señales positivas en secciones en términos de distribución espacial e intensidad de la señal. Para ello, realice los pasos mencionados a continuación.
   1. Abra el archivo con el software ImageJ.
   2. Haga clic en Imagen > color > canales divididos para analizar cada canal de color.
   3. Haga clic en Imagen > pila > Proyecto Z para obtener una combinación de varias adquisiciones de sección.
   4. Haga clic en Imagen > color > fusionar canales para obtener una combinación de diferentes canales de color de la misma adquisición.

Solución anticongelante (almacenar a 4 oC durante un máximo de 6 meses)	30% Glicerol 30% Etilenglicol 30% dH2O 10% 2x tampón de fosfato
Solución de bloqueo (prepárese en este momento)	4% Suero normal de cabra 1% Tritón X-100 en Solución de lavado
Crio-protector (almacenar a 4 oC durante un máximo de 6 meses)	20% Glicerol 80% solución de Sorensen
Solución de fosfato de hidrógeno disódico (almacenar en RT hasta 6 meses)	0.45M Fosfato de hidrógeno disódico (Na2HPO4) en dH2O Filtrar en una botella estéril
Solución de lisina (almacenar a 4oC hasta 3 semanas)	50% de 0.3M Solución de monohidrocloruro de L-lisina 50% de la solución de 0.1M Sorensen pH7.6 pH 7.4, filtrar en una botella estéril
Paraformaldehyde (PFA) 8% (preparar bajo la campana de humo y almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes)	2.6M PFA en dH2O (a 55oC_no exceder los 60oC para evitar la formación de ácido fórmico) filtro en una botella estéril
Tampón de fosfato 2x (almacenar a 4 oC durante un máximo de 6 meses)	6% Solución de fosfato monosódico (NaH2PO4) 45% Solución de fosfato disódico (Na2HPO4) en dH2O
Solución fijativa PLP (prepárese en este momento, bajo la campana de humos)	25% Paraformaldehyde 8% 0.01M Sodium (meta)periodato 75% Solución de lisina<
Fosfato dihidrógeno sódico monohidrato (almacenar en RT hasta 6 meses)	0.52M Fosfato dihidrógeno sódico monohidrato (NaH2PO4*H2O) en dH2O Filtrar en una botella estéril.
Solución de Sorensen (almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes)	2.5% Solución de fosfato monosódico 18,7% Solución de fosfato disódico pH7.6, en dH2O
Solución de lavado (prepárese en este momento)	Base Trizma de 0.25M 0.26M NaCl pH7.6, en dH2O
Solución de trabajo (prepárese en este momento)	Solución de bloqueo del 50% 50% Solución de lavado

Tabla 1: Soluciones requeridas. Lista de soluciones necesarias para el protocolo y una breve descripción de cómo prepararlo.

Resultados

Siguiendo el procedimiento descrito (Figura1), detectamos los agregados de Syn, etiquetados con anticuerpo 5G4, en fascículos nerviosos dérmicos que inercen estructuras autonómicas de pacientes con DP. La morfología de los depósitos de alfa-sinucleína aparece como una señal punteada a lo largo de los axónicos de los nervios dérmicos (Figura2). De hecho, aprovechando este protocolo en 19 pacientes con DP y 17 controles en biopsias de piel en tres sitios ...

Discusión

Describimos un ensayo de inmunofluorescencia flotante para biopsias de piel para el diagnóstico de DP: explota la inmunomancha doble con anticuerpo anti-PGP9.5, un marcador panaxonal y anti-5G4, un anticuerpo específico de conformación que reconoce la forma agregada de Syn.

Las grandes ventajas de la biopsia de piel con fines diagnósticos en DP y posiblemente en otros trastornos de la conformación de proteínas son: 1) el acceso directo al tejido nervioso propenso a la enfermedad mediante...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium