成年小鼠泪液和下颌腺肌上皮细胞的分离

摘要

泪腺 (LG) 有两种细胞类型表达α平滑肌肌动蛋白 (αSMA): 肌上皮细胞 (Mec) 和周周细胞。Mec 是外胚层的起源, 发现在许多腺体组织, 而周围的血管平滑肌细胞的内皮起源。该协议将 Mec 和 pericytes 与小鼠 Lg 隔离开来。

摘要

泪腺 (LG) 是一种外分泌的管状腺, 分泌一层泪膜水层。LG 上皮树由腺泡、导管上皮细胞和肌上皮细胞 (Mec) 组成。Mec 表达α平滑肌肌动蛋白 (αSMA), 并具有收缩功能。它们存在于多个腺体器官中, 属于外胚层。此外, LG 还含有 SMA + 内皮源血管平滑肌细胞, 称为周长: 包围血管管表面的收缩细胞。一项新的协议允许我们从成年小鼠 Lg 和下颌腺体 (Smg) 中分离出 Mec 和外周。该协议基于Mec 和 pericytes 的基因标记使用 sma^cret2\+: rosa26-tdtomaato^{fl/fl 小}鼠菌株, 然后制备用于荧光活化细胞分选的 lg 单细胞悬浮液 (facs)).该协议允许根据 Mec 表达的上皮细胞粘附分子 (EpCAM) 分离这两个不同来源的细胞群, 而 pericytes 不表示 EpCAM。分离细胞可用于细胞培养或基因表达分析。

引言

肌上皮细胞 (Mec) 存在于许多外分泌腺体中, 包括泪液、唾液、哈德里安、汗液、前列腺和乳房。Mec 是一种独特的细胞类型, 结合了上皮和平滑肌表型。Mec 表达α平滑肌肌动蛋白 (sma), 并具有收缩功能^1,2。除 Mec 外, 泪腺 (LG) 和颌下腺 (SMG) 还含有称为外周的 SMA + 血管细胞, 它们是内皮源细胞, 包裹血管管表面³。虽然 mec 和 pericytes 表达了许多标记, 但 sma 是在其他 lg 和 smg 细胞^{1、3 中}唯一没有表达的标记。

在过去40年中, 一些实验室报告了不同外分泌腺组织的离解检测方法, 其中采用了非酶法和酶法。在1980年发表的第一份报告中, 弗里茨和合著者描述了一种使用胶原蛋白/胰蛋白酶溶液中的顺序消化分离猫科动物腮腺的协议.1989年, Hann 和合著者使用胶原酶、透明质酸酶和 DNase⁵的混合物调整了该协议, 以便从大鼠 lg 中分离出 acini。1990年, 克里普斯和他的同事们公布了泪腺6的非酶解离^方法。后来, 在 1998年, Zoukhri 和合著者回到了酶分离协议, 以跟踪 LG 和 SMG 隔离 acini 7 上的 Ca^{2 +}成像.在过去的十年里, 研究人员将注意力转向了从外分泌腺体中分离干细胞祖细胞。普林格尔和合著者在2011年描述了一项分离小鼠 SMG 干细胞^的协议。该方法是在分离培养中保持的含干细胞盐虫的基础上进行的。作者声称, 表达干细胞相关标记物的增殖细胞可以从这些盐球8中分离出来.Shatos 和合著者发布了利用酶消化和收集 "释放" 细胞9从未受伤的成年大鼠 Lg 中分离祖细胞的方案^.后来, 在 2015年, 阿克曼和合著者调整了这一程序, 以分离推定的 "小鼠泪腺干细胞" ("Mlgsc"), 这些细胞可以作为单层培养在多个通道¹⁰上传播。然而, 上述程序都不允许区分细胞亚型和孤立上皮细胞的个体群。2016年, 格罗莫娃和合著者公布了利用流式细胞仪¹¹从成年小鼠 lg 中分离 lg 干细胞的程序。但是, 此协议并不是为了隔离 Mec。

最近, 我们已经证明, 我们能够从3周大的 SMA-GFP 小鼠12只中分离出 SMA+ 细胞。然而, 在这个时候, 我们还没有分离不同的 SBA + 细胞的种群。在这里, 我们建立了一个新的程序, 直接隔离分化的 Mec 和 perictes 从成人 Lg 和 Smg。

研究方案

所有动物工作都是根据国家卫生研究所 (NIH) 的指导方针进行的, 并得到了斯克里普斯研究所动物护理和使用机构委员会的批准。尽一切努力尽量减少老鼠的数量和它们的痛苦。所有实验动物都接受了标准饮食, 可以免费获得自来水。

请注意:图 1A-F示意图概述了 mec 和周二叶隔离的主要步骤。表 1描述了用于此过程的所有试剂和设备。

1. 小鼠和贴标签的 SMA 细胞

1. 使用成虫 (2-4 大) 他莫西芬诱导, αSMA 驱动的记者小鼠 Sma^creert2+: Roma26-tdtocomato^fl/fl.
   请注意:Ivo Kalajzic 博士提供了Sma^creert2 菌株.Roasa26-tdtoato^fl/fl (B6。Gt(ROSA)26Sor^{tm9(CAG-Tdtomto) Hze/j}, 也被称为ai9) 菌株 (# 007909) 是从杰克逊实验室 (萨克拉门托加利福尼亚州) 购买的。SMA + 细胞用腹腔内他莫西芬 (TM) 给药贴上标签。
2. 他莫西芬溶液的制备
   1. 准备经过过滤的玉米油。使用0.22μm 真空过滤器, 因为玉米油是粘性的。
   2. 将1克 TM 粉末从瓶子中转移到50毫升管中。在瓶子中加入1毫升乙醇, 盖上盖子后再摇一摇, 然后加入50毫升的试管。用另一种1毫升乙醇重复一次。
   3. 加入过滤后的玉米油, 制成 20 mg/mL tm 溶液的50毫升。涡流管, 用铝箔包裹, 然后在45°C 时放入晃动的水浴或晃动的孵化器中。
   4. 溶解 TM 可能需要12-24小时左右的时间。不时地取出管子, 检查是否有剩余的晶体。一旦 TM 完全溶解, 脂肪并存储在-80°c。解冻的脂肪可以重复使用。
3. 要给 SMA + 细胞贴上标签, 请连续两天用 TM 腹腔 (IP) 注射小鼠。
   1. 注射3-4周大的 Sma^{creert2\ +}: rosa26-tdtomaato^fl2 任何性别小鼠的 tm 为 100μl/20 g (或 2 Mg/2 g) 体重 (图 1a)。在最后一次 TM 注射后的2-3天内, 老鼠就可以用于细胞隔离。如果需要, 注射的小鼠可以在 TM 注射后更长的时间内牺牲。
      请注意:作为在流式细胞仪期间适当补偿的控制, 需要一种野生类型 (c57bl6) 鼠标和一种sma^creert2\+: Roasa26-tdtomao^fl/fl 小鼠未注射 tm (带 "未染色" mec)。使用为2只 sma^{creert2\ +}: roasa26-tdtocoto^{fl/fl 小}鼠提供的相同计算。不注射^{sma creert2\ +}: rosa26-tdtomato^{fl/fl 将}允许评估 dsred 的背景。C57bl6 小鼠将作为一个负面的控制未染色的细胞。

2. 解决方案和缓冲器

请注意:LG 是一个上皮来源腺体, 包含细胞外基质, 使细胞的分离变得困难。因此, 建议使用酶的特殊组合和下面描述的多步骤消化过程。

1. 二类库存解决方案 (25x)
   1. 溶解120毫克的消解酶 ii 型粉末在2毫升 50 mm Hpes1, 150 mm Ncl, 以制备25x 的库存溶液 (最终浓度的溶解酶应为 30 Units/ml)。每毫克单位可能因小鼠数量而异, 并应相应调整消解酶的浓度。
   2. 准备200Μl 的等价物, 并将其存放在-70°c, 最长6个月或 4°c, 为期几天。不要将糖化酶的脂肪解冻一次以上, 以防止酶降解。
2. DNase i 型库存解决方案
   1. 在50% 甘油的5毫升溶液中溶解5毫克的 Dnase i 型粉末, 在 20 mM Tris 缓冲液 (pH 7.5) 和 1 mM MgCl₂中溶解5毫克 dnmed 粉末 (库存浓度应约为 2000 Units/ml)。每毫克单位可能因小鼠数量而异, 因此 DNase 的浓度应相应调整。
   2. 使用0.22μm 过滤器和10毫升注射器对库存溶液进行过滤。
   3. 准备200Μl 的等价物, 并将其存放在-70°c, 最长6个月或 4°c, 为期几天。不要多次冷冻解冻, 以防止酶降解。
3. 消化介质
   1. 在不含谷氨酰胺的 DMEM 低血糖中, 加入100Μl 的细胞培养补充剂 (如谷氨酸, 见材料表), 稀释为1:100。
   2. 加入2毫升 DMEM 低葡萄糖与细胞培养补充, 加入6毫克的胶原酶 i 型, 通过移液 (湿冰上的酶)、166μl 的溶解酶库存溶液 (2.4 U\ ml 最终浓度)、16μl 的 dnase i 型库存溶液 (8 U\ ml 最终浓度) 彻底混合和12μl 的 1 m Ccl₂ (6 mm 最终浓度)。
      请注意:钙需要增加酶活性^14,15。提供了从两个成年小鼠的四个泪腺中分离细胞的所有计算。消化介质的体积可能因组织数量和复制次数的不同而不同。每2毫升培养基不要使用2-4 大小鼠的4个泪腺。
4. 阻塞介质 I
   1. 在 DMEMCSEF-12 的25毫升中, 加入 FBS (15% 的最终浓度)、250μl 的细胞培养补充剂 (见材料表), 稀释为 1:100, 0.5 m edta ph 8.0 (1 mm 最终浓度) 为50μl。
      请注意:在该协议的不同类型的介质中, DMEMCSEF-12 给出了最好的结果。这种培养基也被其他研究人员用于分离培养上皮细胞^16,17。
5. 阻塞介质 II
   1. 在 PBS 的25毫升, 加入 50μl 0.5 m Edta pH 8.0 (1 mM 最终浓度)。
6. 恢复介质
   1. 以2毫升 HBSS 为补充, 加入100μl 的 dnase i 型库存溶液, 使其达到每2毫升最终浓度 100 U.需要相对较高浓度的 dnase i 型, 以减少上皮细胞的聚集。
7. 荧光活化细胞分选 (流式细胞仪) 缓冲液
   1. 在 486.5 mL 的 PBS 中, 加入 12.5 mL 的血清 (2.5% 的最终浓度) 和1毫升的 0.5 m EDTA ph 8.0 (1 mM 最终浓度)。
      请注意:缓冲液可在4°c 下存储, 最长6周。

3. 成年小鼠泪腺收获和显微解剖

1. 通过吸入异氟醚 (将异氟醚流量或浓度调整到5% 或更高) 和宫颈脱位牺牲小鼠。根据机构内的 Iacoc 建议进行麻醉和安乐死。
2. 使用精细的钳子和剪刀, 去除眼睛和耳朵之间的皮肤 (图 2a)。
3. 要解剖 LG, 用推子轻轻拉 LG, 同时用小剪刀尖尖划伤 LG 周围的结缔组织, 以释放它 (图 2B)。
4. 避免用剪刀切割, 因为 LG 和腮腺唾液腺彼此非常接近, 在解剖前必须分开。当 LG 和腮腺分离时, 用剪刀将 LG 剪掉。将腺体放入一个35毫米的盘子中, 中间有2毫升的冷 PBS (保持在冰上) (图 1 b)。
5. 由于 LG 被结缔组织包膜包覆着, 在解剖显微镜下修剪周围的任何脂肪和结缔组织, 并用两个钳子取出 LG 胶囊。
   1. 对所有腺体重复此步骤。
6. 在荧光显微镜下检查一小块组织, 以确保细胞标记 (图 1c)。

4. LG 单细胞悬浮液的制备

1. 将所有 Lg 转移到一个35毫米的盘子与0.5 毫升的室温 (RT) 消化介质和薄荷 Lg 使用小剪刀成非常小的件 (约 0.2-1 微米²)。通常情况下, 大约需要3分钟的时间来切碎 4 Lg (图 2c)。
2. 使用宽孔移液器滤嘴将碎组织转移到2毫升的圆底管中。使用正常尺寸的移液器尖端, 将吸头切断 (图 2d)。
3. 将高达2毫升的消化介质混合, 倒置管。
4. 将管子放置在晃动的孵化器 (或晃动的水浴) 中, 在 37°c, 10-120 转每分钟90分钟。
5. 每30分钟缓慢移液器压盖块20-30 次, 使用 1, 000Μl 滤嘴与减小孔尺寸 (图 2d)。孵育后, 取 10Μl aliquot, 并在显微镜下检查团簇。如果集群持续存在, 继续消化。
6. 90分钟后, 通过胰岛素注射器针 (31G) 将样品通过2-3 次, 以进一步将细胞释放到悬浮液中。
   请注意:消化完成后, 溶液中不应残留明显的泪腺块 (图 1d)。
7. 将细胞悬浮液转移到15毫升管, 并将 i 型阻滞介质添加到总共5毫升。反转管2-3 次混合。
8. 通过放置在 50 mL 管上的70μm 电池过滤器将细胞悬浮液通过。用1毫升的阻塞介质清洗过滤器 i. 再次重复步骤4.8。
9. 在 rt 以 0.4 x g 离心样品5分钟。
10. 吸收上清液。使用 1 mL 移液器尖端在2毫升的堵塞介质 ii 中重新悬浮细胞, 并将细胞悬浮液转移到2毫升的微离心管中。
11. 以 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 mL 转子; 见材料表) 离心电池 3分钟.
12. 在细胞分离溶液的1毫升中吸收上清液和再悬浮细胞 (见材料表)。
    请注意:在这里, 细胞分离溶液是依赖酶, 一种具有蛋白溶解和胶原蛋白溶解活性的海洋源酶, 分离分离细胞, 用于分析细胞表面标记物。
13. 在37°c、10-120 转的温度下培养细胞 2-3分钟, 通过细胞分离溶液过度消化可能会损害细胞膜。
14. 将细胞悬浮液转移到50毫升管中, 以 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 ml 转子; 见材料表) 的速度将堵塞介质 10 ml 的离心管添加5分钟。
15. 在 RT 中丢弃上清液并在6毫升的恢复培养基中重新悬浮细胞, 并孵育细胞30分钟。
16. 在显微镜下检查10Μl 的细胞悬浮液, 以确保完全的细胞离解 (图 3)。
17. 使用单元格计数器和 Trypan blue 对单元格进行计数。通常情况下, 我们期望 4 x^{10 5-6}x¹⁰ 6 细胞从四个 lg (一个样本)。
18. 离心细胞在 0.4 x克(24 x 1.5/2.0 ml 转子; 见材料表) 3分钟在 rt, 并进行抗体染色。

5. 抗体染色

1. 将最多 5x10^5个细胞添加到含有400ΜL 流式细胞仪缓冲液的2毫升管中。加入5μl 的明亮紫罗兰421抗鼠 CD326 (EpCAM) 和0.5μl 的幽灵红色 780 (活力染料)。
2. 同时, 准备调整流式细胞仪补偿的控制:
   负对照-1 (野生型小鼠的细胞)
   从sma^{Creert2\ +: rosa26-tdmatofl/fl 的背景}控制未染色的细胞
   Cy7-780 染色细胞 (细胞从野生类型老鼠染色与幽灵红色780活力染料)
   Epcam-明亮的紫罗兰 421 (细胞从野生类型的小鼠染色与 Epcam-辉煌紫罗兰421抗体)。
   请注意:对于每个控制样品, 每400μl 的流式细胞仪缓冲液至少使用 1 x 10 5个电池。
3. 加入每种试剂后, 通过移液彻底混合细胞。
4. 用铝箔包裹管, 在4°C 下旋转管45分钟。
5. 离心机样品在 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 ml 转子; 见材料表) 在4°C 下3分钟。
6. 在 FACS 缓冲液的1毫升中重新悬浮细胞。在补偿过程中清洗细胞以减少背景是很重要的。

6. 荧光活化细胞分选

1. 将细胞悬浮液转移到5毫升的流式细胞仪管中, 并进行流式细胞仪分析。让细胞保持在冰上。
2. 使用单色控件调整补偿。
3. 使用适当的流式细胞仪 (见材料表), 通过100微米的喷嘴对 20 psi 的细胞进行排序。Go型策略18如图 1e和图 4所示。
4. 根据下游程序将分类的细胞收集到介质、rna 后期、流式细胞仪或溶解缓冲液中 (图 1E,F)。

结果

鼠标模型隔离 SMA + Mec 和 perices
既定协议允许将两个纯种群隔离: Mec 和 perictes 与 Lg 和 Smg (见表 1)。这两种类型的细胞具有不同的大小和外观。微血管周长, 在毛细血管壁周围发展 (图 5a), 并有一个平方状 (图 5A), 而 mec 围绕 lg 分泌阿奇尼, 有很长的过程, 并占据一个相对较大的区域 (图 5...

讨论

这份手稿描述了一个协议的 MEC 和过氧化物隔离从 LG 和 SMG。该程序是基于 SMA 的遗传标记, 这是唯一可靠的 mec 和果皮生物标志物。

制定这一议定书的紧迫性是由于几乎完全没有文献强调 Mec 与小鼠 Lg 和 Smg 的隔离。虽然以前使用过基因标记, 使用 SMA-GFP 小鼠^从3周大的年轻 lg 12 中分离 sma + 细胞, 但由于成年小鼠信号的部分丢失, 不允许使用这些年龄较大的小?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet	SterilCard Baker	19669.1	Class II type A/B3
10 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-910	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
10 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-908	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
15 mL High-clarity polypropylene conical tubes	Falcon	352196
25 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-900	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
5 mL FACS round-bottom tubes	Fisher Scientific, Falcon	14-959-11A
50 mL High-clarity polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15240-062
Appropriate filter and non-filter tips	Any available	Any available
BD Insulin Syringes	Becton Dickinson	328468	with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G
BD Syringes 10 mL	Becton Dickinson	309604	Sterile
Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM)	Biolegend	118225	Monoclonal Antibody (G8.8)
CaCl2 1M solution	BioVision	B1010	sterile
Cell culture dishes 35 mm	Corning	430165	Non-pyrogenic, sterile
Collagenase Type I	Wortington	LS004194
Corn oil	Any avaliable	Any avaliable	From grocery store
Corning cell strainer size 70 μm	Sigma-Aldrich	CLS431751-50EA
Digital Stirrer PC-410D	Corning	Item# UX-84302-50
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
Dissecting scissors, curved blunt	McKesson Argent	487350	Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle
DNase I	Akron Biotech, catalog number	AK37778-0050
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546-500ML	with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12)	Millipore	DF-042-B	without HEPES, L-glutamine
Easypet 3 pipette controller	Eppendorf	4430000018	with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	12-812
FlowJo version 10	Any available	Any available
Fluorescence binocular microscope Axioplan2	Carl Zeiss	ID# 094207
Ghost Red 780 Viability Dye	Tonbo Biosciences	13-0865-T100
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific, Gibco	35050061
Glycerol 99%	Sigma-Aldrich	G-5516
Hand tally counter	Heathrow Scientific	HEA6594
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma Millipore	H6648-500ML	Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14025092	With calcium, magnesium, no phenol red.
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B	02-671-51B
HEPES 1 M solution	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-080	Dilute 1/10 in ddH20
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007002E
Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution	JT Baker	5618-03	To adjust Tris buffer pH
Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator	New Brunswick Scientific	SKU#:	Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air
Iris scissors	Aurora Surgical	AS12-021	Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle
Isoflurane Inhalation Anesthetic	Southern Anesthesia Surgical (SAS)	PIR001325-EA
MgCl2 1 M solution	Sigma-Aldrich	63069-100ML
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	ThermoFisher Scientific	3451	Clear, graduated, sterile
Microsoft Power Point	Any available	Any available
NaCl powder	Sigma-Aldrich	S-3014
Nalgene 25 mm Syringe Filters	Fisher Scientific	724-2020
Pen Strep	Gibco	15140-122
pH 510 series Benchtop Meter	Oakton	SKU: BZA630092
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Pure Ethanol 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200
Red blood cell lysis buffer 10x	BioVision	5831-100
Roto-torque Heavy Duty Rotator	Cole Parmer	MPN: 7637-01
Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf Biopur	22600044	PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free
Scissors	Office Depot	375667
Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	With Summit 6.3 software
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002441	All centrifugation performed at RT
Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	ID# 21550	RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT
Stemi SV6 stereo dissecting microscope	Carl Zeiss	455054SV6	With transmitted light base
Tamoxifen	Millipore Sigma	T5648-1G
Trizma base powder	Sigma-Aldrich	T1503
Trypan blue solution	Millipore Sigma	T8154
Two Dumont tweezers #5	World Precision Instruments	500342	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips
Upright microscope	Any available	Any available	With transmitted light base
Vacuum filtration systems, standard line	VWR	10040-436
Variable volume micropipettes	Any available	Any available