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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Tränendrüse (LG) hat zwei Zelltypen, die α-glatte Muskelaktin (αSMA) ausdrücken: Myoepithelialzellen (MECs) und Pericytes. MECs sind ektodermaler Herkunft, der in vielen Drüsengeweben zu finden ist, während die Periicyten vaskuläre glatte Muskelzellen endodermalen Ursprungs sind. Dieses Protokoll isoliert MECs und Periicytes von murinen LGs.

Zusammenfassung

Die Tränendrüse (LG) ist eine exokrine Tubuloacinardrüse, die eine wässrige Schicht Tränenfilm abscheidet. Der LG-Epithelbaum besteht aus Akinar-, duktalen Epithel-und Myoepithelzellen (MECs). MECs drücken alpha glatte Muskelaktin (αSMA) aus und haben eine kontraktile Funktion. Sie sind in mehreren Drüsenorganen zu finden und sind ektodermalen Ursprungs. Darüber hinaus enthält das LG SMA + Gefäßglatte Muskelzellen endodermalen Ursprungs, die als Periicytes bezeichnet werden: Kontraktile Zellen, die die Oberfläche von Gefäßröhren umhüllen. Ein neues Protokoll ermöglicht es uns, sowohl MECs als auch Periicyte aus erwachsenen Murin-LGs und submandibulären Drüsen (SMGs) zu isolieren. Das Protokoll basiert auf der genetischen Kennzeichnung von MECs und Periicytes mit dem SMA CreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/. ). Das Protokoll erlaubt die Trennung dieser beiden Zellpopulationen unterschiedlicher Herkunft auf der Grundlage des Ausdrucks des epithelialen Zellhaftmoleküls (EpCAM) durch MECs, während Pericytes EpCAM nicht ausdrücken. Isolierte Zellen könnten für die Zellkultivierung oder Genexpressionsanalyse verwendet werden.

Einleitung

Myoepitheliale Zellen (MECs) sind in vielen exokrinen Drüsen vorhanden, darunter Tränendrüsen, Speichel, Harderian, Schweiß, Prostata und Säugetiere. MECs sind ein einzigartiger Zelltyp, der einen Epithel-und einen glatten Muskelphenotyp kombiniert. MECs drücken α-smooth Muskelaktin (SMA) aus und haben eine kontraktile Funktion1,2. Die Tränendrüse (LG) und die submandibuläre Drüse (SMG) enthalten neben MECs auch SMA + Gefäßzellen, die Periicytes genannt werden, also Zellen endodermalen Ursprungs, die die Oberfläche von Gefäßrohren 3 umhüllen. Obwohl MECs und Periicytes viele Marker ausdrücken, ist SMA der einzige Marker, der nicht in anderen LG und SMG-Zellen1,3 ausgedrückt wird.

In den letzten 40 Jahren berichteten mehrere Labore von Untersuchungen zur Dissoziation verschiedener exokriner Drüsengewebe, in denen nicht-enzymatische und enzymatische Ansätze angewandt wurden. In einem der ersten Berichte, die 1980 veröffentlicht wurden, beschrieben Fritz und Co-Autoren ein Protokoll zur Isolierung von Katzenparotid acini mit sequenzieller Verdauung in einer Collagenase/Trypsin Lösung4. Im Jahr 1989 haben Hann und Coauthors dieses Protokoll für die Isolierung von Rat LGs mit einer Mischung aus Collagenase, Hyaluronidase und DNase5angepasst. 1990 veröffentlichten Cripps und Kollegen die Methode der nicht-enzymatischen Dissoziation der Tränendrüseacini 6. Später, im Jahr 1998, kehrten Zoukhri und Coautoren zu einem enzymatischen Dissoziationsprotokoll zurück, weil sie Ca2 +-Bildgebung auf LGundSMG isolierten acini 7 nachstellten. In den letzten zehn Jahren haben die Forscher ihren Fokus auf die Isolierung von Stamm/-Vorläuferzellen aus exokrinen Drüsen gerichtet. Pringle und Coauthors beschrieben 2011 ein Protokoll zur Isolierung von Mäuse-SMG-Stammzellen8. Diese Methode basierte auf der Isolierung von stammzellhaltigen Salisphären, die in der Kultur beibehalten wurden. Die Autoren behaupteten, dass sich vermehrende Zellen, die Stammzellmarker ausdrücken, von diesen Salisphären8isolieren könnten. Shatos und Coautoren veröffentlichten das Protokoll zur Vorläuferzellenisolierung von ungeschädigten erwachsenen Ratten-LGs mit enzymatischer Verdauung und dem Sammelnvon"befreiten" Zellen 9. Später, im Jahr 2015, passten Ackermann und Mitautoren dieses Verfahren an, um mutmaßliche "Murine-Tränendrein-Stammzellen" ("mLGSCs") zu isolieren, die sich als Einschichtkultur über mehrerePassagen 10 verbreiten ließen. Allerdings ist keines der oben genannten Verfahren erlaubt, um zelluläre Subtypen und einzelne Populationen isolierter Epithelzellen zu unterscheiden. Im Jahr 2016 veröffentlichten Gromova und Coautoren ein Verfahren zur Isolierung von LG-Stem/Vorläuferzellen von erwachsenen Murin-LGs mit FACS11. Dieses Protokoll war jedoch nicht dazu gedacht, MECs zu isolieren.

Vor kurzem haben wir gezeigt, dass wir in der Lage sind, SMA +-Zellen von 3 Wochen alten SMA-GFP-Mäuse 12 zu isolieren. Zum jetzigen Zeitpunkt haben wir jedoch keine verschiedenen Populationen von SMA +-Zellen getrennt. Hier haben wir ein neues Verfahren zur direkten Isolierung von differenzierten MECs und Pericytes von erwachsenen LGs und SMGs eingeführt.

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Protokoll

Alle Tierarbeiten wurden nach den Richtlinien des Nationalen Instituts für Gesundheit (NIH) durchgeführt und vom Institutionellen Ausschuss für Tierhaltung und-nutzung des Forschungsinstituts Scripps genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der Mäuse und ihr Leid zu minimieren. Alle Versuchstiere erhielten eine Standarddiät mit freiem Zugang zu Leitungswasser.

NOTE: Die wichtigsten Schritte für die MEC-und Perizdämmung sind schematisch in Abbildung 1A-Fdargestellt. Alle Reagenzien und Geräte, die für dieses Verfahren verwendet werden, sind in Tabelle 1beschrieben.

1. Mäuse und Beschriftung der SMA-Zellen

  1. Verwenden Sie erwachsene (2-4 Monate alt) Tamoxifen-induzierbaren, αSMA-getriebenen Reporter Mäusen SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl.
    NOTE: Die SMACreErt2 -Sorte wurde freundlicherweise von Dr. Ivo Kalajzic13zur Verfügung gestellt. Rosa26-TdTomatofl/fl (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm9-CAG-tdTomato) Hze/J, auch bekannt als Ai9) Sorte (# 007909) wurden von Jackson Laboratory (Sacramento, CA) gekauft. SMA +-Zellen wurden durch die intraperitoneale Tamoxifen (TM)-Administration gekennzeichnet.
  2. Vorbereitung der Tamoxifen-Lösung
    1. Bereiten Sie gefiltertes Maisöl vor. Verwenden Sie 0,22 μm Vakuumfilter, da Maisöl viskose ist.
    2. 1 g TM-Pulver von der Flasche in ein 50 ml Rohr. 1 ml Ethanol in die Flasche geben, mit einer Kappe befüllen und abschütteln, um sie zu spülen und dann zu einem 50 mL Rohr hinzufügen. Wiederholen Sie noch einmal mit einem weiteren 1 ml Ethanol.
    3. Fügen Sie gefiltertes Maisöl hinzu, um 50 ml einer 20 mg/mL TM-Lösung zu machen. Das Rohr anziehen, in Folie wickeln und in ein Schüttelwasserbad oder ein Schüttelinkubator bei 45 ° C geben.
    4. Es kann etwa 12-24 Stunden dauern, um die TM aufzulösen. Entfernen Sie von Zeit zu Zeit die Röhre und überprüfen Sie die verbleibenden Kristalle. Sobald die TM vollständig aufgelöst ist, aliquot und bei-80 ° C lagern. Ein aufgetauter Aliquot kann wiederverwendet werden.
  3. Um SMA +-Zellen zu kennzeichnen, injizieren Sie Mäuse intraperitoneal (IP) mit TM an zwei sequenziellen Tagen.
    1. 3-4 Wochen altes SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/f alle Gender-Mäuse mit TM bei 100 μL/20 g (oder 2 mg/20 g) Körpergewicht (Abbildung 1A). Mäuse sind bereit, in 2-3 Tagen nach der letzten TM-Injektion zur Zellisolierung eingesetzt zu werden. Bei Bedarf können injizierte Mäuse nach der TM-Injektion in längeren Zeiträumen geopfert werden.
      NOTE: Als Bedienelemente für die richtige Kompensation während der FACS, eine wilde Art (C57Bl/6) Maus und eine SMA CreErt2/+:Rosa26 -TdTomato fl/maus nicht mit TM (mit "ungefärbten" MECs) des gleichen Alters injiziert werden, wäre erforderlich. Verwenden Sie die gleichen Berechnungen für 2 SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Mäuse. Nicht injiziert SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl wird die Auswertung der DSRed-Background ermöglichen. Die C57Bl/6-Maus dient als negative Kontrolle von unbefleckten Zellen.

2. Lösungen und Puffer

NOTE: Die LG ist eine epitheliale Ursprungsdrüse, die eine extrazelluläre Matrix enthält, die die Trennung von Zellen erschwert. Daher wird empfohlen, eine spezielle Enzymkombination und einen mehrstufigen Verdauungsprozess zu verwenden, der unten beschrieben wird.

  1. Dispase-Typ II Lagerlösung (25x)
    1. Lösen Sie 120 mg Dispas-Pulver Typ II in 2 mL von 50 mM HEPES/150 mM NaCl auf, um eine 25x Lagerlösung vorzubereiten (die endgültige Konzentration des Disdispases sollte 30 Units/mL betragen). Einheiten pro Milligramm können je nach Anzahl der Mäuse variieren und die Konzentration des Dispases sollte entsprechend angepasst werden.
    2. 200 μL Aliquots vorbereiten und bei-70 ° C für bis zu 6 Monate oder 4 ° C für mehrere Tage lagern. Nicht gefrieze/Tauwetter die Aliquot der Dispute mehr als einmal, um Enzymabbau zu verhindern.
  2. DNase-Typ I Bestandslösung
    1. Lösen Sie 5 mg DNase-Pulver in einer 5-mL-Lösung von 50% Glycerin, 20 mM-Tris-Puffer (pH 7,5) und 1 mM MgCl2 (Lagerkonzentration sollte etwa 2000 Units/mL). Einheiten pro Milligramm können je nach Anzahl der Mäuse variieren und daher sollte die DNasenkonzentration entsprechend angepasst werden.
    2. Filtern Sie die Lagerlösung mit einem 0,22 μm Filter und einer 10 mL-Spritze.
    3. 200 μL Aliquots vorbereiten und bei-70 ° C für bis zu 6 Monate oder 4 ° C für mehrere Tage lagern. Nicht mehr als einmal gefrieze/Tauwetter, um Enzymabbau zu verhindern.
  3. Verdauungsmittel
    1. Zu 10 ml DMEM-niedriger Glukose ohne Glutamin, 100 μL Zellkultur-Ergänzung (z. B. Glutamax, siehe Materialtabelle) für eine Verdünnung von 1:100 hinzufügen.
    2. Bis zu 2 mL DMEM niedrige Glukose mit Zellkultur-Ergänzung, Fügen Sie 6 mg Collagenase Typ I hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipettieren (Enzym auf nassen Eis), 160 μL Dispase-Bestandslösung (2,4 U/mL Endkonzentration), 16 μL DNase-Typ I Bestandslösung (8 U/mL Endkonzentration) , und 12 μL von 1 M CaCl2 (6 mM Endkonzentration).
      NOTE: Kalzium wird benötigt,umdie enzymatische Aktivität14,15zuerhöhen. Alle Berechnungen sind für die Isolierung von Zellen von vier Tränendrüsen von zwei erwachsenen Mäusen vorgesehen. Das Volumen des Verdauungsmediums kann je nach Gewebemenge und Anzahl der Replikate variieren. Verwenden Sie nicht mehr als 4 Tränendrüsen von 2-4 Monate alten Mäusen pro 2 ml Medium.
  4. Sperrmittel I
    1. Auf 25 ml DMEM/F-12, FBS (15% Endkonzentration), 250 μL Zellkultur-Ergänzung (siehe Materialtabelle) für eine Verdünnung von 1:100, und 50 μL von 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM-Endkonzentration).
      NOTE: Von den verschiedenen Arten von Medium, die für dieses Protokoll verglichen wurden, lieferte DMEM/F-12 die besten Ergebnisse. Dieses Medium wurde auch von anderen Forschern verwendet, um isolate/Kultur Epithelzellen16,17.
  5. Sperrmittel II
    1. Auf 25 mL PBS 50 μL von 0,5 M EDTA pH 8.0 (1 mM Endkonzentration).
  6. Rückeroberungsmedium
    1. Zu 2 mL HBSS, ergänzt durch 5 mM MgCl2, 100 μL DNase-Typ I stock-Lösung auf 100 U pro 2 mL Endkonzentration. Relativ hohe Konzentrationen des DNase-Typs I sind erforderlich, um die Aggregation der Epithelzellen zu reduzieren.
  7. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Puffer
    1. Auf 486,5 mL PBS, 12,5 mL Serum (2,5% Endkonzentration) und 1 mL von 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM Endkonzentration).
      NOTE: Der Puffer kann bei 4 ° C für maximal 6 Wochen gelagert werden.

3. Adult Maus Lacrimal Gland Ernte und Mikrodissection

  1. Die Maus durch die Inhalation von Isoflurane anästhetisieren (die isoflurane Strömungsgeschwindigkeit oder-konzentration auf 5% oder mehr anpassen) und durch Gebärmutterhalskrebs opfern. Führen Sie Anästhesie und Sterbehilfe nach institutionellen Empfehlungen der IACUCs aus.
  2. Mit feinen Zangen und Scheren die Haut zwischen Auge und Ohr entfernen (Abbildung 2A).
  3. Um ein LG zu zerlegen, ziehen Sie LG mit Pinzette sanft und zerkratzen gleichzeitig das Bindegewebe um das LG mit der scharfen Spitze der kleinen Schere, um es zu befreien (Abbildung 2B).
  4. Vermeiden Sie das Schneiden mit einer Schere, da die LG und Parotid Salivariendrüsen sehr nah beieinander liegen und vor der Trennung getrennt werden müssen. Wenn LG und Parotiddrüsen getrennt sind, schneiden Sie das LG mit einer Schere aus. Die Drüsen in eine 35-mm-Schale mit 2 ml kaltem PBS (auf Eis halten) (Abbildung 1B).
  5. Da das LG mit einer Bindegewebskapelle bedeckt ist, schneiden Sie jedes umgebende Fett und Bindegewebe unter einem Trennmikroskop und entfernen Sie die LG-Kapsel mit zwei Zangen.
    1. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Drüsen.
  6. Überprüfen Sie ein kleines Stück Gewebe unter fluoreszierendem Mikroskop, um die Zellbeschriftung zu gewährleisten (Abbildung 1C).

4. Vorbereitung der LG Single-Zell-Sparte

  1. Übertragen Sie alle LGs in eine 35-mm-Schüssel mit 0,5 ml Raumtemperatur (RT) Verdauungsmedien und Hackfleisch LGs mit kleinen Scheren in sehr kleine Stücke (ca. 0,2-1 μm 2). Normalerweise dauert es etwa 3 Minuten bis zu minus 4 LGs (Abbildung 2C).
  2. Mit einer Breitbader Pipette filtern Sie Hackgewebe in ein 2 mL rundes Unterrohr. Verwenden Sie eine normal große Pipette-Spitze mit der abgeschnittenen Spitze (Abbildung 2D).
  3. Bis zu 2 mL Verdauungsmittel dazugeben und durch Umkehrung des Rohres vermischen.
  4. Legen Sie die Röhre in einen Schüttelinkubator (oder Schüttelwasserbad), bei 37 ° C, 100-120 U/min für 90 min.
  5. Alle 30 Minuten langsam pipette Drüsenstücke 20-30 mal mit einer 1.000 μL-Filterspitze mit der abnehmenden Bohrgröße(Abbildung 2D). Nach der Inkubation/Trituration, nehmen Sie einen 10 μL Aliquot und inspizieren Sie unter einem Mikroskop für Cluster. Wenn Cluster fortbestehen, fahren Sie weiter mit der Verdauung.
  6. Nach 90 Minuten die Probe 2-3 mal durch eine Insulinspurnadel (31G) passieren, um die Zellen weiter in die Aufhängung zu entlassen.
    NOTE: Nach der Verdauung sollten keine sichtbaren Tränendrüsenstücke in der Lösung verbleiben (Abbildung 1D).
  7. Übertragen Sie die Zellaufhängung auf ein 15 mL-Rohr und fügen Sie die Blockierung des Medientyps I auf insgesamt 5 mL. Die Röhre 2-3 mal umkehren, um sie zu mischen.
  8. Die Zellaufhängung durch einen 70 μm Zellglane auf einem 50 mL-Rohr passieren. Waschen Sie den Sieb mit 1 ml blockierender Medientyp I. Wiederholen Sie Schritt 4.8.
  9. Zentrifugenproben mit 0,4 x g für 5 min bei RT.
  10. Die Supernatante aufschwingen. Die Zellen in 2 mL blockiertem Medium Typ II mit einer 1 mL-Pipette-Spitze neu aussetzen und die Zellaufhängung in ein 2-mL-Mikrozentrifugenrohr übertragen.
  11. Zentrifugen Sie die Zellen auf 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 mL Rotor ; siehe Materialtabelle) für 3 min bei RT.
  12. Aspirate supernatant und wieder aussetzen Zellen in 1 ml Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle).
    NOTE: Hier ist die Zellablösungslösung Accutase, ein Meeresher-Enzym mit proteolytischer und kollagenolytischer Aktivität, das Zellen zur Analyse von Zelloberflächenmarkern detailliert/.
  13. Inkubate Zellen bei 37 ° C, bei 100-120 U/min für 2-3 min. Überverdauung mit Zellablösungslösung kann die Zellmembranen schädigen.
  14. Die Zellaufhängung in ein 50 mL-Rohr übertragen und bis zu 10 mL Blockiermedium vom Typ I addieren . Zentrifugenrohr bei 0,4 x g (24 x 1,5 /2,0 mL Rotor; siehe Materialtabelle) für 5 min.
  15. Discard supernatant und wieder Suspendierung von Zellen in 6 ml von Rückgewinnungsmedien und Inkubatzellen für 30 Minuten bei RT.
  16. Überprüfen Sie 10 μL Zellaufhängung unter dem Mikroskop, um eine vollständige Zelldissoziation zu gewährleisten (Abbildung 3).
  17. Zählen Sie Zellen mit einem Zellzähler und Trypan blau. Normalerweise erwarten wir 4 x 105-6 x 10 6 Zellen von vier LGs (eine Probe).
  18. Zentrifugenzellen mit 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 mL Rotor; siehe Materialtabelle) für 3 min bei RT und gehen zur Antikörper-Färbung über.

5. Antibody Staining

  1. Fügen Sie bis zu 5 x10 5 Zellen zu einem 2 ml-Röhre mit 400 μL FACS-Puffer hinzu. Fügen Sie 5 μL von Brilliant Violet 421 Anti-Mause-CD326 (EpCAM) und 0,5 μL von Ghost Red 780 (Viability Dye) hinzu.
  2. Parallel dazu werden die Kontrollen vorbereitet, um die FACS-Vergütung anzupassen:
    Negative Kontrolle-1 (Zellen von wilder Maus)
    Hintergrundkontrolle ungefärbter Zellen von SMACreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl
    Cy7-780 gefärbte Zellen (Zellen aus dem wilden Typ Maus mit dem Ghost Red 780 Viability Dye gefärbt)
    EpCAM-Brilliant Violet 421 (Zellen aus wilder Maus mit dem EpCAM-Brilliant Violet 421 Antikörper).
    NOTE: Für jede Kontrollprobe mindestens 1 x 105 Zellen pro 400 μL FACS-Puffer verwenden.
  3. Nach dem Hinzufügen jeder Reagenzmischung Zellen gründlich durch Pipettieren.
  4. Wickelschlauch (n) mit Folie und rotierende Rohre für 45 min bei 4 ° C.
  5. Zentrifugenproben mit 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 mL Rotor; siehe Materialtabelle) für 3 min auf 4°C.
  6. Die Zellen in 1 mL FACS-Puffer neu aussetzen. Es ist wichtig, Zellen zu waschen, um den Hintergrund während der Kompensation zu verringern.

6. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung

  1. Übertragen Sie die Zellaufhängung in 5 mL FACS-Rohre und gehen Sie mit der FACS-Analyse fort. Halten Sie die Zellen auf Eis.
  2. Passen Sie die Kompensation mit einzelnen Farbkontrollen an.
  3. Sortieren Sie Zellen mit einem geeigneten Strömungszytometer mit 20 psi durch eine 100 μm Düse (siehe Materialtabelle). Die Gating-Strategie 18 ist in Abbildung 1E und Abbildung 4zu sehen.
  4. Sammeln Sie sortierte Zellen in Medium, RNA-later, FACS oder Lysis-Puffer, abhängig von nachgelagerten Verfahren (Abbildung 1E,F).

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Ergebnisse

Mausmodell zur Isolierung von SMA + MECs und-pericytes
Das etablierte Protokoll ermöglicht die Isolierung von zwei reinen Populationen: MECs und Periicytes von LGs und SMGs (siehe Tabelle1). Diese beiden Zelltypen haben eine unterschiedliche Größe und ein anderes Aussehen. Mikrovaskuläre Periicyten, die sich um die Wände der Kapillaren entwickeln (Abbildung 5A) und eine quadratische Form haben (Abbildung 5B), während...

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Diskussion

Dieses Manuskript beschrieb ein Protokoll von MEC und Perizyten-Isolierung von LG und SMG. Dieses Verfahren basierte auf der genetischen Kennzeichnung von SMA, dem einzigen zuverlässigen Biomarker von MECs und Periicytes.

Die Dringlichkeit, dieses Protokoll zu entwickeln, wurde durch das fast völlige Fehlen von Literatur motiviert, die die Isolierung von MECs von Murine LGs und SMGs hervorhob. Obwohl früher eine genetische Kennzeichnung verwendet wurde, die SMA-GFP-Mäuse zur Isolierung von...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen und keine Konflikte anderer Interessen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Ivo Kalajzic für die Bereitstellung der SMA CreErt2-Maus-Stamm, Takeshi Umazume für das Mäuseschießen und Genotyping, Mark Shelley für den Erwerb von professionellen Bildern für Abbildung 2. Wir danken auch dem Scripps Council of Scientific Editors und Mark Shelley für die redaktionelle Bearbeitung von Scientific English. Wir danken dem Scripps Research Institute Flow Cytometry Core für die Unterstützung bei der Zellsortierung und Dr. Robin Willenbring für mehrere Diskussionen/Beratung zur FACS-Datenanalyse.

Diese Arbeit wurde unterstützt von den National Institutes of Health, National Eye Institute Grants 5 R01 EY026202 und 1 R01 EY028983 bis H.P.M.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety CabinetSterilCard Baker19669.1Class II type A/B3
10 mL Disposable serological pipetsVWR89130-910Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
10 mL Disposable serological pipetsVWR89130-908Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
15 mL High-clarity polypropylene conical tubesFalcon352196
25 mL Disposable serological pipetsVWR89130-900Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
5 mL FACS round-bottom tubesFisher Scientific, Falcon14-959-11A
50 mL High-clarity polypropylene conical tubesFalcon352070
Antibiotic-antimycoticInvitrogen15240-062
Appropriate filter and non-filter tipsAny availableAny available
BD Insulin SyringesBecton Dickinson328468with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G
BD Syringes 10 mLBecton Dickinson309604Sterile
Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM)Biolegend118225Monoclonal Antibody (G8.8)
CaCl2 1M solutionBioVisionB1010sterile
Cell culture dishes 35 mmCorning430165Non-pyrogenic, sterile
Collagenase Type IWortingtonLS004194
Corn oilAny avaliableAny avaliableFrom grocery store
Corning cell strainer size 70 μmSigma-AldrichCLS431751-50EA
Digital Stirrer PC-410DCorningItem# UX-84302-50
Dispase IISigma-AldrichD4693-1G
Dissecting scissors, curved bluntMcKesson Argent487350Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle
DNase IAkron Biotech, catalog numberAK37778-0050
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM)Sigma-AldrichD5546-500MLwith 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12)MilliporeDF-042-Bwithout HEPES, L-glutamine
Easypet 3 pipette controllerEppendorf4430000018with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL
EthanolSigma-AldrichE7023-500ML
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE6758
Fisher Vortex Genie 2Fisher Scientific12-812
FlowJo version 10Any availableAny available
Fluorescence binocular microscope Axioplan2Carl ZeissID# 094207
Ghost Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
GlutaMAX SupplementThermoFisher Scientific, Gibco35050061
Glycerol 99%Sigma-AldrichG-5516
Hand tally counterHeathrow ScientificHEA6594
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma MilliporeH6648-500MLModified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)ThermoFisher Scientific14025092With calcium, magnesium, no phenol red.
Hausser Bright-Line Phase HemocytometerFisher Scientific02-671-51B02-671-51B
HEPES 1 M solutionThermoFisher Scientific, Gibco15630-080Dilute 1/10 in ddH20
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificSH3007002E
Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric SolutionJT Baker5618-03To adjust Tris buffer pH
Innova 4230 Refrigerated Benchtop IncubatorNew Brunswick ScientificSKU#:Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air
Iris scissorsAurora SurgicalAS12-021Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle
Isoflurane Inhalation AnestheticSouthern Anesthesia Surgical (SAS)PIR001325-EA
MgCl2 1 M solutionSigma-Aldrich63069-100ML
Microcentrifuge tubes 1.5 mLThermoFisher Scientific3451Clear, graduated, sterile
Microsoft Power PointAny availableAny available
NaCl powderSigma-AldrichS-3014
Nalgene 25 mm Syringe FiltersFisher Scientific724-2020
Pen StrepGibco15140-122
pH 510 series Benchtop MeterOaktonSKU: BZA630092
Phosphate buffered saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023pH 7.4
Pure Ethanol 200 ProofPharmco-Aaper111000200
Red blood cell lysis buffer 10xBioVision5831-100
Roto-torque Heavy Duty RotatorCole ParmerMPN: 7637-01
Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mLEppendorf Biopur22600044PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free
ScissorsOffice Depot375667
Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQBeckman CoulterB25982With Summit 6.3 software
Sorvall Legend Micro 17R MicrocentrifugeThermo Scientific75002441All centrifugation performed at RT
Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated CentrifugeThermo ScientificID# 21550RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT
Stemi SV6 stereo dissecting microscopeCarl Zeiss455054SV6With transmitted light base
TamoxifenMillipore SigmaT5648-1G
Trizma base powderSigma-AldrichT1503
Trypan blue solutionMillipore SigmaT8154
Two Dumont tweezers #5World Precision Instruments50034211 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips
Upright microscopeAny availableAny availableWith transmitted light base
Vacuum filtration systems, standard lineVWR10040-436
Variable volume micropipettesAny availableAny available

Referenzen

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