Isolement des cellules myoépithéliales des glandes murines lacrimal et sous-mandibulaires adultes

Résumé

La glande lacrymale (LG) a deux types de cellules exprimant l’actine du muscle lisse α (αSMA): les cellules myoépithéliales (CEM) et les périoctets. Les CEM sont d’origine ectodermique, trouvées dans de nombreux tissus glandulaires, tandis que les périoctets sont des cellules musculaires lisses vasculaires d’origine endodermique. Ce protocole isole les CEM et les périoctets des LGs murins.

Résumé

La glande lacrymale (LG) est une glande tubuloacinaire exocrine qui sécrète une couche aqueuse de film lacrymal. L’arbre épithélial LG est composé d’acinar, d’épithélium Ductal et de cellules myoépithéliales (CEM). Les MECs expriment l’actine du muscle lisse alpha (αSMA) et ont une fonction contractile. Ils se retrouvent dans plusieurs organes glandulaires et sont d’origine ectodermique. De plus, le LG contient des cellules musculaires lisses vasculaires SMA + d’origine endodermique appelées périoctets: cellules contractiles qui enveloppent la surface des tubes vasculaires. Un nouveau protocole nous permet d’isoler à la fois les CEM et les périoctets des LGs murins adultes et des glandes sous-mandibulaires (SMGs). Le protocole est basé sur l’étiquetage génétique des CEM et des périoctets à l’aide de la souche de souris SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/fl , suivie par la préparation de la suspension à cellule unique LG pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS ). Le protocole permet la séparation de ces deux populations cellulaires d’origines différentes basées sur l’expression de la molécule d’adhérence des cellules épithéliales (EpCAM) par les CEM, alors que les périoctets n’expriment pas l’EpCAM. Des cellules isolées pourraient être utilisées pour la culture cellulaire ou l’analyse d’expression génique.

Introduction

Les cellules myoépithéliales (CEM) sont présentes dans de nombreuses glandes exocrines, y compris lacrimal, salivaire, Harderian, sueur, prostate et mammaire. Les MECs sont un type de cellule unique qui combine un phénotype épithélial et un muscle lisse. Les mecs expriment l’actine du muscle lisse α (SMA) et ont une fonction contractile^1,2. En plus des CEM, la glande lacrymale (LG) et la glande sous-mandibulaire (SMG) contiennent des cellules vasculaires SMA + appelées périoctets, qui sont des cellules d’origine endodermique qui enveloppent la surface des tubes vasculaires³. Bien que les mecs et les périoctets expriment de nombreux marqueurs, SMA est le seul marqueur qui n’est pas exprimé dans d’autres cellules LG et SMG^1,3.

Au cours des 40 dernières années, plusieurs laboratoires ont rapporté des essais de dissociation de différents tissus de la glande exocrine, dans lesquels des approches non enzymatiques et enzymatiques ont été appliquées. Dans l’un des premiers rapports publiés en 1980, Fritz et les coauteurs ont décrit un protocole pour isoler les parotides acini félin en utilisant la digestion séquentielle dans une solution de collagénase/trypsine⁴. En 1989, Hann et les coauteurs ajustaient ce protocole pour isoler les acini des LGs de rats à l’aide d’un mélange de collagénase, de hyaluronidase et de DNase⁵. En 1990, Cripps et ses collègues ont publié la méthode de dissociation non enzymatique de la glande lacrymal acini⁶. Plus tard, en 1998, Zoukhri et les coauteurs retournait à un protocole de dissociation enzymatique pour le suivi de l’imagerie ca^{2 +}sur le LG et l’acini isolé de SMG⁷. Au cours de la dernière décennie, les chercheurs se sont tournés vers l’isolement des cellules souches/progénitrices des glandes exocrines. Les Pringle et les coauteurs ont décrit un protocole en 2011 pour l’isolement des cellules souches de la souris SMG⁸. Cette méthode était basée sur l’isolement des salisphères contenant des cellules souches, qui ont été maintenues dans la culture. Les auteurs ont affirmé que les cellules proliférantes exprimant des marqueurs associés aux cellules souches pouvaient être isolées de ces salispheres⁸. Shatos et coauteurs ont publié le protocole pour l’isolement des cellules progénitrices des LGs de rats adultes non blessés utilisant la digestion enzymatique et la collecte des cellules «libérées»⁹. Plus tard, en 2015, Ackermann et les coauteurs ont ajusté cette procédure pour isoler les «cellules souches de glandes lacrymales» («mLGSCs») qui pourraient être propagées en tant que culture mono-couche sur plusieurs passages¹⁰. Cependant, aucune des procédures mentionnées précédemment n’a permis de distinguer les sous-types cellulaires et les populations individuelles de cellules épithéliales isolées. En 2016, Gromova et les coauteurs ont publié une procédure d’isolement des cellules souches/progénitrices de LG à partir de LGs murins adultes utilisant FACS¹¹. Cependant, ce protocole n’était pas destiné à isoler les CEM.

Récemment, nous avons montré que nous sommes en mesure d’isoler les cellules SMA + de 3 semaines de souris SMA-GFP¹². Cependant, à ce moment-là, nous n’avons pas séparé différentes populations de cellules SMA +. Nous avons ici établi une nouvelle procédure pour l’isolement direct des CEM et des périoctets différenciés des LGs et des SMG adultes.

Protocole

Tous les travaux sur les animaux ont été menés selon les directives de l’Institut national de la santé (NIH) et ont été approuvés par le Comité institutionnel de l’Institut de recherche sur les animaux. Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre de souris et leurs souffrances. Tous les animaux expérimentaux ont reçu un régime standard avec un accès gratuit à l’eau du robinet.

Remarque: Les principales étapes de l’isolement du MEC et du périoctet sont décrites schématiquement dans la figure 1a-F. Tous les réactifs et équipements utilisés pour cette procédure sont décrits dans le tableau 1.

1. souris et étiquetage des cellules SMA

1. Utilisation adulte (2-4 mois) tamoxifen-inductible, souris de reporter αSMA entraînée SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/fl.
   Remarque: La souche SMA^CreErt2 a été aimablement fournie par le Dr. Ivo Kalajzic¹³. Rosa26-Tdtomate^fl/fl (B6. La souche CG-gt (ROSA) 26Sor^{TM9 (CAG-tdTomato) HZE}/j, également connue sous le nom de Ai9) (# 007909) a été achetée chez Jackson Laboratory (Sacramento, ca). Les cellules SMA + ont été étiquetées par administration de tamoxifène (TM) intrapéritonéale.
2. Préparation de la solution de tamoxifène
   1. Préparez de l’huile de maïs filtrée. Utiliser un filtre à vide de 0,22 μM puisque l’huile de maïs est visqueuse.
   2. Transférer 1 g de poudre TM de la bouteille dans un tube de 50 mL. Ajouter 1 mL d’éthanol dans la bouteille, le bouchon et le secouer pour le rincer puis ajouter à un tube de 50 mL. Répéter une fois de plus avec un autre 1 mL d’éthanol.
   3. Ajouter de l’huile de maïs filtrée pour faire 50 mL d’une solution de 20 mg/mL TM. Vortex le tube, enveloppez-le dans une feuille, et le mettre dans un bain d’eau tremblante ou secouant l’incubateur à 45 ° c.
   4. Il peut prendre environ 12-24 h pour dissoudre le TM. De temps en temps, enlevez le tube et vérifiez les cristaux restants. Une fois la TM complètement dissoute, aliquote et stocker à-80 ° c. Une aliquote décongelé peut être réutilisée.
3. Pour étiqueter les cellules SMA +, injecter des souris intrapéritonéalement (IP) avec TM sur deux jours séquentiels.
   1. Injecter 3-4 semaines d’âge SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/f toutes les souris de sexe avec TM à 100 μl/20 g (ou 2 mg/20 g) de poids corporel (figure 1a). Les souris sont prêtes à être utilisées pour l’isolement cellulaire en 2-3 jours après la dernière injection de TM. Si nécessaire, les souris injectées peuvent être sacrifiées à plus longues périodes de temps après l’injection de TM.
      Remarque: Comme les contrôles pour la compensation appropriée pendant FACS, un type sauvage (C57Bl/6) souris et un SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/fl souris non injectée avec TM (avec "non colorées" mecs) du même âge serait nécessaire. Utilisez les mêmes calculs que pour les souris ^fl/fl de 2 SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato . Non injecté SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/fl permettra l’évaluation de l’arrière-plan DsRed. La souris C57Bl/6 servira de contrôle négatif des cellules non colorées.

2. solutions et tampons

Remarque: Le LG est une glande d’origine épithéliale qui contient une matrice extracellulaire qui rend difficile la dissociation des cellules. Par conséquent, l’utilisation d’une combinaison spéciale d’enzymes et d’un processus de digestion à plusieurs étapes décrit ci-dessous est recommandée.

1. Solution stock de type II Dispase (25x)
   1. Dissoudre 120 mg de poudre de Dispase de type II dans 2 mL de 50 mM de HEPES/150 mM de NaCl pour préparer une solution d’action 25x (la concentration finale de Dispase doit être de 30 unités/mL). Les unités par milligramme peuvent varier en fonction du nombre de souris et la concentration de la Dispase doit être ajustée en conséquence.
   2. Préparer 200 μL d’aliquotes et les entreposer à-70 ° c pendant plusieurs jours jusqu’à 6 mois ou 4 ° c. Ne pas congeler/décongeler l’aliquote de dissiase plus d’une fois pour prévenir la dégradation des enzymes.
2. Solution de stock de type I DNase
   1. Dissoudre 5 mg de poudre de type I de DNase dans une solution de 5 mL de 50% de glycérol, 20 mM de tampon tris (pH 7,5) et 1 mM de MgCl₂ (la concentration en stock devrait être d’environ 2000 unités/ml). Les unités par milligramme peuvent varier en fonction du nombre de souris et donc la concentration de DNase doit être ajustée en conséquence.
   2. Filtrer la solution en stock à l’aide d’un filtre de 0,22 μM et d’une seringue de 10 mL.
   3. Préparer 200 μL d’aliquotes et les entreposer à-70 ° c pendant plusieurs jours jusqu’à 6 mois ou 4 ° c. Ne pas congeler/décongeler plus d’une fois pour prévenir la dégradation des enzymes.
3. Milieu de digestion
   1. Pour 10 mL de DMEM faible en glucose sans glutamine, ajouter 100 μL de supplément de culture cellulaire (par exemple, Glutamax, voir tableau des matériaux) pour une dilution de 1:100.
   2. Pour 2 mL de DMEM faible teneur en glucose avec supplément de culture cellulaire, ajouter 6 mg de collagénase de type I et mélanger soigneusement par pipetage (enzyme sur la glace mouillée), 160 μL de solution stock de Dispase (2,4 U/mL de concentration finale), 16 μL de solution stock de DNase de type I (concentration finale 8 U/mL) et 12 μL de 1 M de CaCl₂ (concentration finale de 6 mm).
      Remarque: Le calcium est nécessaire pour augmenter l’activité enzymatique^14,15. Tous les calculs sont fournis pour l’isolement des cellules de quatre glandes lacrymales de deux souris adultes. Le volume du milieu de digestion peut varier en fonction de la quantité de tissu et du nombre de répétitions. Ne pas utiliser plus de 4 glandes lacrymales à partir de 2-4 mois de souris âgées par 2 mL de milieu.
4. Support de blocage I
   1. À 25 mL de DMEM/F-12, ajouter FBS (15% de concentration finale), 250 μL de supplément de culture cellulaire (voir tableau des matériaux) pour une dilution de 1:100, et 50 μl de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm de concentration finale).
      Remarque: Des différents types de médium qui ont été comparés pour ce protocole DMEM/F-12 a donné les meilleurs résultats. Ce milieu a également été utilisé par d’autres chercheurs pour isoler/culture cellules épithéliales^16,17.
5. Moyen de blocage II
   1. À 25 mL de PBS, ajouter 50 μL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (concentration finale de 1 mM).
6. Support de récupération
   1. Pour 2 mL de HBSS additionnés de 5 mM MgCl₂, ajouter 100 μl de solution de stock de DNase de type I à 100 U par concentration finale de 2 ml. Des concentrations relativement élevées de DNase-type I sont nécessaires pour réduire l’agrégation des cellules épithéliales.
7. Tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
   1. Pour 486,5 mL de PBS, ajouter 12,5 mL de sérum (2,5% de concentration finale) et 1 mL de 0,5 M d’EDTA pH 8,0 (concentration finale de 1 mM).
      Remarque: La mémoire tampon peut être stockée à 4 ° c pendant un maximum de 6 semaines.

3. récolte de la glande lacrimal de souris adulte et microdissection

1. Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane (ajuster le débit d’isoflurane ou la concentration à 5% ou plus) et le sacrifice par la dislocation cervicale. Effectuer l’anesthésie et l’euthanasie selon les recommandations institutionnelles de l’IACUC.
2. À l’aide de pinces fines et de ciseaux, enlevez la peau entre l’œil et l’oreille (figure 2a).
3. Pour disséquer un LG, tirez doucement LG en utilisant des pinces et en même temps gratter le tissu conjonctif autour du LG en utilisant la pointe pointue de petits ciseaux pour le libérer (figure 2b).
4. Évitez de couper avec des ciseaux, comme les glandes salivaires LG et parotide sont situés très près les uns des autres et doivent être séparés avant la dissection. Lorsque LG et les glandes parotides sont séparés, couper le LG à l’aide de ciseaux. Placer les glandes dans un plat de 35 mm avec 2 mL de PBS froid (conserver sur la glace) (figure 1b).
5. Comme le LG est recouvert d’une capsule/enveloppe de tissu conjonctif, coupez les graisses environnantes et le tissu conjonctif sous un microscope disséquant et enlevez la capsule de LG avec deux forceps.
   1. Répétez cette étape pour toutes les glandes.
6. Vérifier un petit morceau de tissu sous le microscope fluorescent pour assurer l’étiquetage des cellules (figure 1c).

4. préparation de la suspension à cellule unique LG

1. Transférer tous les LGs dans un plat de 35 mm avec 0,5 mL de milieu de digestion à température ambiante (RT) et hacher les LGs à l’aide de petits ciseaux en petits morceaux (environ 0,2-1 μM²). Normalement, il faut environ 3 min pour hachis 4 LGs (Figure 2c).
2. Transférer le tissu haché dans un tube à fond rond de 2 mL à l’aide d’une pointe de filtre à pipette à grand alésage. Utilisez un embout de pipette de taille normale avec l’embout coupé (figure 2D).
3. Ajouter jusqu’à 2 mL de milieu de digestion et mélanger en invertant le tube.
4. Placer le tube dans un incubateur (ou secouant le bain d’eau), à 37 ° c, 100-120 RPM pour 90 min.
5. Toutes les 30 min, les pièces de la glande 20-30 lentement à l’aide d’un embout filtrant de 1 000 μL avec la taille d’alésage décroissantes (figure 2D). Après incubation/trituration, prendre une aliquote de 10 μL et inspecter sous un microscope pour les grappes. Si les clusters persistent, continuez la digestion.
6. Après 90 min, passer l’échantillon 2-3 fois par une aiguille de seringue d’insuline (31G) pour libérer les cellules en suspension.
   Remarque: Aucune pièce de glande lacrymale visible ne doit rester dans la solution une fois la digestion terminée (figure 1d).
7. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et ajouter le type de support de blocage I à un total de 5 mL. Inverser le tube 2-3 fois pour mélanger.
8. Passer la suspension cellulaire à travers un tamis à cellules de 70 μm placé sur un tube de 50 mL. Lavez la crépine avec 1 mL de type de support de blocage I. Répétez l’étape 4,8.
9. Centrifuger les échantillons à 0,4 x g pendant 5 min à RT.
10. Aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 2 mL de milieu bloquant de type II à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL et transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 2 mL.
11. Centrifuger les cellules à 0,4 x g (rotor 24 x 1,5/2,0 ml; voir tableau des matériaux) pendant 3 min à RT.
12. Aspirate surnageant et résuspendez les cellules dans 1 mL de solution de détachement cellulaire (voir tableau des matériaux).
    Remarque: Ici, la solution de détachement de cellules est Accutase, une enzyme d’origine marine avec une activité protéolytique et collagénolytico qui détache/dissocie les cellules pour l’analyse des marqueurs de surface cellulaire.
13. Incuber les cellules à 37 ° c, à 100-120 tr/min pendant 2-3 min. la digestion excessive avec une solution de détachement cellulaire peut endommager les membranes cellulaires.
14. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL et additionner 10 mL de milieu bloquant de type I. tube à centrifuger à 0,4 x g (rotor de 24 x 1,5/2,0 ml; voir tableau des matériaux) pendant 5 min.
15. Jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans 6 mL de support de récupération et incubez les cellules pendant 30 min à RT.
16. Vérifier 10 μL de suspension cellulaire sous le microscope pour assurer une dissociation complète des cellules (figure 3).
17. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et de bleu trypan. Normalement, nous attendons 4 x 10⁵-6 x 10⁶ cellules de quatre LGS (un échantillon).
18. Centrifuger les cellules à 0,4 x g (rotor 24 x 1,5/2,0 ml; voir tableau des matériaux) pendant 3 min à RT et procéder à la coloration des anticorps.

5. coloration des anticorps

1. Ajouter jusqu’à 5 x10⁵ cellules à un tube de 2 ml contenant 400 μl de tampon FACS. Ajouter 5 μL de brillant violet 421 anti-souris CD326 (EpCAM) et 0,5 μL de Ghost Red 780 (colorant de viabilité).
2. En parallèle, préparez les contrôles pour ajuster la compensation FACS:
   Contrôle négatif-1 (cellules de la souris de type sauvage)
   Contrôle de fond des cellules non colorées de SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/fl
   Cy7-780 cellules colorées (cellules de la souris de type sauvage teinté avec le fantôme rouge 780 colorant de viabilité)
   EpCAM-Brilliant violet 421 (cellules de type sauvage souris colorées avec l’anticorps EpCAM-Brilliant violet 421).
   Remarque: Pour chaque échantillon de contrôle, utiliser un minimum de 1 x 10⁵ cellules par 400 μl de tampon FACS.
3. Après avoir ajouté chaque cellule de mélange de réactifs à fond par pipetage.
4. Envelopper le (s) tube (x) avec une feuille et faire pivoter les tubes pendant 45 min à 4 ° c.
5. Centrifuger les échantillons à 0,4 x g (rotor de 24 x 1,5/2,0 ml; voir tableau des matériaux) pendant 3 min à 4 ° c.
6. Resuspendre les cellules dans 1 mL de tampon FACS. Il est important de laver les cellules pour diminuer l’arrière-plan pendant la compensation.

6. tri des cellules activées par fluorescence

1. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes FACS de 5 mL et procéder à l’analyse FACS. Gardez les cellules sur la glace.
2. Réglez la compensation à l’aide de contrôles couleur uniques.
3. Trier les cellules à 20 psi à travers une buse de 100 μM à l’aide d’un cytomètre de flux approprié (voir tableau des matériaux). Le gating strategy18 est illustré à la figure 1e et à la figure 4.
4. Collectez les cellules triées dans des tampons de moyenne, d’ARN-postérieur, de FACS ou de lyse selon les procédures en aval (figure 1e, F).

Résultats

Modèle de souris pour isoler les SMA + MECs et les périoctets
Le protocole établi permet l’isolement de deux populations pures: les CEM et les périoctets des LGs et des SMGs (voir tableau 1). Ces deux types de cellules ont une taille et une apparence différentes. Les périoctets microvasculaires, se développent autour des parois des capillaires (figure 5A) et ont une forme carrée (figure 5B

Discussion

Ce manuscrit décrivait un protocole d’isolement de MEC et de périoctet de LG et de SMG. Cette procédure était basée sur l’étiquetage génétique de SMA, le seul biomarqueur fiable des CEM et des périoctets.

L’urgence d’élaborer ce protocole a été motivée par l’absence quasi totale de littérature soulignant l’isolement des CEM des LGs murins et des SMGs. Bien que l’étiquetage génétique ait déjà été utilisé, l’utilisation de souris SMA-GFP pour isoler les cell...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet	SterilCard Baker	19669.1	Class II type A/B3
10 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-910	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
10 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-908	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
15 mL High-clarity polypropylene conical tubes	Falcon	352196
25 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-900	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
5 mL FACS round-bottom tubes	Fisher Scientific, Falcon	14-959-11A
50 mL High-clarity polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15240-062
Appropriate filter and non-filter tips	Any available	Any available
BD Insulin Syringes	Becton Dickinson	328468	with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G
BD Syringes 10 mL	Becton Dickinson	309604	Sterile
Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM)	Biolegend	118225	Monoclonal Antibody (G8.8)
CaCl2 1M solution	BioVision	B1010	sterile
Cell culture dishes 35 mm	Corning	430165	Non-pyrogenic, sterile
Collagenase Type I	Wortington	LS004194
Corn oil	Any avaliable	Any avaliable	From grocery store
Corning cell strainer size 70 μm	Sigma-Aldrich	CLS431751-50EA
Digital Stirrer PC-410D	Corning	Item# UX-84302-50
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
Dissecting scissors, curved blunt	McKesson Argent	487350	Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle
DNase I	Akron Biotech, catalog number	AK37778-0050
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546-500ML	with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12)	Millipore	DF-042-B	without HEPES, L-glutamine
Easypet 3 pipette controller	Eppendorf	4430000018	with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	12-812
FlowJo version 10	Any available	Any available
Fluorescence binocular microscope Axioplan2	Carl Zeiss	ID# 094207
Ghost Red 780 Viability Dye	Tonbo Biosciences	13-0865-T100
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific, Gibco	35050061
Glycerol 99%	Sigma-Aldrich	G-5516
Hand tally counter	Heathrow Scientific	HEA6594
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma Millipore	H6648-500ML	Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14025092	With calcium, magnesium, no phenol red.
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B	02-671-51B
HEPES 1 M solution	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-080	Dilute 1/10 in ddH20
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007002E
Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution	JT Baker	5618-03	To adjust Tris buffer pH
Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator	New Brunswick Scientific	SKU#:	Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air
Iris scissors	Aurora Surgical	AS12-021	Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle
Isoflurane Inhalation Anesthetic	Southern Anesthesia Surgical (SAS)	PIR001325-EA
MgCl2 1 M solution	Sigma-Aldrich	63069-100ML
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	ThermoFisher Scientific	3451	Clear, graduated, sterile
Microsoft Power Point	Any available	Any available
NaCl powder	Sigma-Aldrich	S-3014
Nalgene 25 mm Syringe Filters	Fisher Scientific	724-2020
Pen Strep	Gibco	15140-122
pH 510 series Benchtop Meter	Oakton	SKU: BZA630092
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Pure Ethanol 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200
Red blood cell lysis buffer 10x	BioVision	5831-100
Roto-torque Heavy Duty Rotator	Cole Parmer	MPN: 7637-01
Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf Biopur	22600044	PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free
Scissors	Office Depot	375667
Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	With Summit 6.3 software
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002441	All centrifugation performed at RT
Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	ID# 21550	RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT
Stemi SV6 stereo dissecting microscope	Carl Zeiss	455054SV6	With transmitted light base
Tamoxifen	Millipore Sigma	T5648-1G
Trizma base powder	Sigma-Aldrich	T1503
Trypan blue solution	Millipore Sigma	T8154
Two Dumont tweezers #5	World Precision Instruments	500342	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips
Upright microscope	Any available	Any available	With transmitted light base
Vacuum filtration systems, standard line	VWR	10040-436
Variable volume micropipettes	Any available	Any available