בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

Summary

בלוטת lacrimal (LG) יש שני סוגי תאים המבטא α-השריר החלקה אקטין (αSMA): מיואפיתל תאים (mecs) ו קרום הלב. MECs הם של מוצא העורי, נמצא ברקמות הבלוטות רבות, בעוד קרום הלב הם תאים שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי. פרוטוקול זה מבודד מנות וכלי קרום.

Abstract

בלוטת הדמעות (LG) היא בלוטת tubuloacexlayer האקסוקרינית אשר מפריש שכבה מימית של סרט דמעה. העץ האפיתל של LG מורכב של שכבתית, האפיתל ductal, ו מיואפיתל תאים (MECs). Mecs מבטא אלפא שריר חלק שרירים אקטין (αSMA) ויש להם פונקציה הקונאקטולה. הם נמצאים באברים בבלוטות מרובים והם בעלי המקור העורי. בנוסף, LG מכיל את התאים SMA שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי הנקרא קרום הלב: תאים הקונאקטולה לעטוף את פני השטח של צינורות כלי דם. פרוטוקול חדש מאפשר לנו לבודד הן MECs ו-קרום הלב של LGs מבוגרים מורלין ובלוטות הלסת התחתונה (SMGs). הפרוטוקול מבוסס על התיוג הגנטי של MECs ו קרום הלב באמצעות SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^{חליל/חליל} העכבר להתאמץ, ואחריו הכנה של LG תא יחיד ההשעיה עבור מיון התא המופעל פלואורסצנט (facs ). הפרוטוקול מאפשר הפרדה של שתי אוכלוסיות תאים אלה של מקורות שונים בהתבסס על הביטוי של המולקולה הדבקה תא האפיתל (EpCAM) על ידי MECs, ואילו קרום הלב לא לבטא EpCAM. ניתן להשתמש בתאים מבודדים לעיבוד תאים או לניתוח ביטוי גנטי.

Introduction

מיואפיתל תאים (MECs) נמצאים בבלוטות אקסוקרינית רבות כולל לקטמל, הרוק, הרדמי, זיעה, ערמונית, ופטמות. MECs הם סוג תא ייחודי המשלב האפיתל ואת שריר החלק פנוטיפים. Mecs express α-השריר החלקה אקטין (SMA) ויש להם פונקציה הקונאקטולה^1,2. בנוסף ל-MECs, בלוטת lacrimal (LG) ואת בלוטת הלסת התחתונה (SMG) מכיל התאים SMA + כלי דם בשם קרום הלב, אשר הם תאים של מקור אנדועורי האופפים את פני השטח של צינורות וסקולרית³. למרות mecs ו קרום הלב לבטא סמנים רבים, SMA הוא הסמן היחיד שאינו מבוטא LG אחרים בתאי smg^1,3.

בתוך 40 השנים האחרונות, מספר מעבדות שדווחו על הדיסוציאציה של רקמות בלוטת אקסוקרינית שונים, שבו הוחלו גישות לא אנזימטית ואנזימטית. באחד הדיווחים הראשונים שפורסמו בשנת 1980, פריץ ומחברים מתוארים בפרוטוקול לבודד את הפרוטריטיד החתול באמצעות עיכול רציף בתמיסה הקולגן/טריפסין פתרון⁴. ב 1989, Hann ומחברים הסתגלו פרוטוקול זה עבור בידוד acini מ-LGs חולדה באמצעות תערובת של הקולגן, hyaluronidase ו DNase⁵. ב 1990, Cripps ועמיתיו פרסמו את השיטה של דיסוציאציה לא אנזימטית של בלוטת לקטמל⁶. מאוחר יותר, בשנת 1998, Zoukhri ומחברים חוזרים לפרוטוקול דיסוציאציה אנזימטית עבור הבאים Ca^{2 +}-הדמיה ב-LG ו smg מבודדים acini⁷. בתוך העשור האחרון, החוקרים הפכו את המיקוד שלהם על בידוד של תאים גזע/מחולל קדמון בלוטות אקסוקרינית. Pringle ומחברים תיאר פרוטוקול ב 2011 לבידוד של העכבר בתאי גזע SMG⁸. שיטה זו התבססה על בידוד של תאי גזע המכילים כדורי סאליריים, אשר שמרו בתרבות. המחברים טענו כי תאים מתרבים המבטא תא גזע הקשורים סמנים יכול להיות מבודד אלה כדורי הערבה⁸. שטואים ומחברי החוליה פרסמו את הפרוטוקול עבור בידוד תא מחולל קדמון מידי מבוגרים שנפגעו LGs חולדה באמצעות עיכול אנזימטי ואיסוף "משוחרר" תאים⁹. מאוחר יותר, בשנת 2015, אקרמן ומחברים הסתגלו הליך זה כדי לבודד שוערת "מורין לקטמל תאי גזע בלוטת" ("mLGSCs") כי ניתן להפיץ כתרבות מונו שכבה על פני מספר מעברים¹⁰. עם זאת, אף אחד ההליכים לפני שהוזכר מותר להבדיל בין תת-סוגי הסלולר אוכלוסיות בודדות של תאים אפיתל מבודדים. בשנת 2016, מחלק מהגרובה והקוסופרים פרסמו הליך לבידוד של תאי גזע/מחולל בוגרים מ-LGs מבוגרים באמצעות FACS¹¹. עם זאת, פרוטוקול זה לא נועד לבודד את MECs.

לאחרונה, הראינו כי אנו מסוגלים לבודד את התאים SMA + מתוך 3 שבוע בן SMA-GFP עכברים¹². עם זאת, בשלב זה לא הפרידו אוכלוסיות שונות של SMA + תאים. כאן הקמנו הליך חדש עבור הבידוד הישיר של MECs הבדיל, קרום הלב מבוגרים LGs ו-SMGs.

Protocol

כל העבודות בעלי החיים נערכו על פי הנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH) ואושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והשימוש של מכון המחקר סקריפס. כל המאמצים נעשו כדי למזער את מספר העכברים ואת סבלם. כל החיות הנסיוניות קיבלו תזונה סטנדרטית עם גישה חופשית למים מהברז.

הערה: השלבים העיקריים עבור בידוד של MEC וכלי הקרום מתוארים באופן שולי באיור 1A-F. כל החומרים הריאגנטים והציוד המשמשים להליך זה מתוארים בטבלה 1.

1. עכברים ותוויות התאים SMA

1. השימוש מבוגר (2-4 חודשים בן) טמוקסיפן-inducible, αSMA עכברים כתבת מונחה SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/fl.
   הערה: הזן SMA^CreErt2 היה באדיבות סיפק ד ר Ivo kalajzic¹³. Rosa26-TdTomato^{חליל/חליל} (B6. Cg-Gt (רוזה) 26Sor^{tm9 (קאג-tdTomato) Hze}/j, הידוע גם בשם Ai9) זן (007909) נרכשו מהמעבדה ג'קסון (סקרמנטו, CA). התאים SMA + היו מסומנים על ידי מינהל טמוקסיפן הצפק (TM).
2. הכנת תמיסת טמוקסיפן
   1. הכינו שמן תירס מסונן. השימוש 0.22 יקרומטר מסנן ואקום מאז שמן תירס הוא צמיגי.
   2. העבר 1 גר' אבקת TM מהבקבוק לתוך צינור 50 mL. הוסף 1 מ ל של אתנול לבקבוק, כובע לנער אותו לשטוף ולאחר מכן להוסיף לצינור 50 mL. חזור שוב עם עוד 1 מ ל של אתנול.
   3. הוסף שמן תירס מסוננים כדי להפוך 50 mL של 20 מ"ג/mL TM פתרון. מערבולת הצינור, לעטוף אותו בנייר כסף, ולשים אותו באמבט מים רועד או לרעוד בחממה ב 45 ° c.
   4. זה עשוי לקחת כ 12-24 h כדי לפזר את TM. מפעם לפעם, הסר את השפופרת ובדוק אם יש קריסטלים נותרים. לאחר TM הוא התפרקה לחלוטין, סדרת מחלקים ו לאחסן ב-80 ° c. ניתן לעשות שימוש חוזר בליquot מופעד.
3. כדי לתייג את התאים SMA +, הכנס עכברים intraperitoneally (IP) עם TM בשני ימים רציפים.
   1. הכנס 3-4 שבועות הישן SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^חליל/f כל עכברים מגדר עם TM ב 100 μl/20 גרם (או 2 מ"ג/20 גרם) משקל הגוף (איור 1a). עכברים מוכנים לשמש לבידוד התא ב 2-3 ימים לאחר הזרקת TM האחרון. במקרה הצורך, עכברים מוזרק ניתן להקריב בפרקי זמן ארוכים יותר לאחר הזרקת TM.
      הערה: כפקדים עבור פיצוי הולם במהלך FACS, סוג אחד פראי (C57Bl/6) עכבר אחד SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^{חליל/חליל} עכבר לא הוזרק עם TM (עם "מוכתם" mecs) של אותו גיל יהיה צורך. השתמש באותם חישובים שסופקו עבור 2 SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^{חליל/חליל} עכברים. לא מוזרק SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^{חליל/חליל} יאפשר הערכה של הרקע dsred. העכבר C57Bl/6 ישמש שליטה שלילית של תאים בלתי מוכתמים.

2. פתרונות ומאגרים

הערה: LG היא מקור האפיתל בלוטת המכילה מטריצה מתוך החילוץ שהופך את הדיסוציאציה של תאים קשה. לכן, מומלץ להשתמש בשילוב מיוחד של אנזימים ובתהליך עיכול מרובה צעדים המתואר להלן.

1. מניות הקלד מניה סוג II (25x)
   1. התמוססות 120 מ ג של מסוג dispase 2 מ מ של 50 mM HEPES/150 מ"מ הנאקל להכין פתרון מניות 25x (הריכוז הסופי של dispase צריך להיות 30 יחידות/mL). יחידות לכל מיליגרם עשויות להשתנות בהתאם למספר העכברים והריכוז של ה-dispase להתאמה בהתאם.
   2. הכינו 200 μL ואחסן אותם ב-70 ° צ' עד 6 חודשים או 4 ° c למשך מספר ימים. לא להקפיא/להפשיר את סדרת מחלקים של dispase יותר מפעם אחת כדי למנוע השפלה אנזימים.
2. מניות סוג DNase I
   1. לפזר 5 מ"ג של DNase סוג אני אבקת בתמיסה 5 mL של 50% גליצרול, 20 מ"מ מאגר Tris (pH 7.5), ו 1 מ"מ MgCl₂ (ריכוז במלאי צריך להיות כ 2000 יחידות/mL). יחידות לכל מיליגרם עשויות להשתנות בהתאם למספר העכברים ולכן יש לכוונן את הריכוז של DNase בהתאם.
   2. סנן את פתרון המניה באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ומזרק 10 מ"ל.
   3. הכינו 200 μL ואחסן אותם ב-70 ° צ' עד 6 חודשים או 4 ° c למשך מספר ימים. אין להקפיא/להפשיר יותר מפעם אחת כדי למנוע השפלה אנזימים.
3. מדיום לעיכול
   1. עד 10 מ ל של גלוקוז נמוך Dמאמ ללא גלוטמין, להוסיף 100 μL של תוסף תרבות התא (למשל, גלוטמקס, ראה טבלת חומרים) עבור דילול של 1:100.
   2. כדי 2 mL של גלוקוז נמוך dמאמ עם תוספת של תרבות התא, להוסיף 6 מ"ג של קולגן הסוג אני ולערבב ביסודיות על ידי ליטוף (אנזים על קרח רטוב), 160 μl של פתרון מניות dispase (2.4 u/ml הריכוז הסופי), 16 μl של dnase סוג I מניות פתרון (8 u/ml הריכוז ה , ו 12 μL של 1 M CaCl₂ (6 מ"מ ריכוז סופי).
      הערה: סידן נדרש כדי להגדיל את פעילות אנזימטית^14,15. כל החישובים ניתנים לבידוד של תאים מארבע בלוטות לקונות משני עכברים מבוגרים. הנפח של מדיום העיכול עשוי להשתנות בהתאם לכמות הרקמה ומספר השכפל. אין להשתמש ביותר מ 4 בלוטות lacrimal מ 2-4 חודשים של עכברים ישנים למדיום 2 mL.
4. חסימת בינונית I
   1. כדי 25 מ ל של DMEM/F-12, להוסיף FBS (15% הריכוז הסופי), 250 μL של תוסף תרבות התא (ראה טבלת חומרים) עבור דילול של 1:100, ו 50 μl של 0.5 M Edta pH 8.0 (1 מ"מ ריכוז סופי).
      הערה: מבין הסוגים השונים של המדיום ששושוו לפרוטוקול זה/F-12 נתן את התוצאות הטובות ביותר. בינונית זו שימש גם חוקרים אחרים כדי לבודד/תרבות תאים אפיתל^16,17.
5. חסימת בינונית 2
   1. כדי 25 מ ל של PBS, להוסיף 50 μL של 0.5 M EDTA pH 8.0 (1 מ"מ ריכוז סופי).
6. מדיום שחזור
   1. כדי 2 mL של HBSS בתוספת עם 5 mM MgCl₂, להוסיף 100 μl של dnase סוג אני מניות פתרון 100 U לכל 2 mL ריכוז סופי. ריכוזים גבוהים יחסית של DNase-סוג אני נדרש כדי להפחית את הצבירה של תאים אפיתל.
7. מיון תאים מופעל מפני קרינה פלואורסצנטית (FACS)
   1. כדי 486.5 mL של PBS, להוסיף 12.5 mL של סרום (2.5% הריכוז הסופי) ו 1 mL של 0.5 M EDTA pH 8.0 (1 מ"מ ריכוז סופי).
      הערה: ניתן לאחסן את המאגר ב -4 ° c במשך 6 שבועות לכל היותר.

3. העכבר למבוגרים לקציר קצירת בלוטת מיקרודיסקציה

1. התקן את העכבר על-ידי אינהלציה של שאיפה (כוונן את קצב הזרימה של isofלאנה או את הריכוז ל-5% או יותר) והקרבת הקורבן באמצעות נקע בצוואר הרחם. לבצע הרדמה והמתת חסד על פי המלצות IACUCs מוסדיים.
2. באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים, להסיר את העור בין העין והאוזן (איור 2A).
3. כדי לנתח LG, בעדינות למשוך LG באמצעות מספריים באותו זמן לשרוט את רקמת החיבור סביב LG באמצעות קצה חדה של מספריים קטנים כדי לשחרר אותו (איור 2B).
4. הימנע חיתוך עם מספריים, כמו LG בלוטות הרוק הפרוטיד ממוקמים קרוב מאוד זה לזה ויש להפריד לפני ניתוח. כאשר בלוטות הפרוטיד LG ו מופרדים, לחתוך את LG החוצה באמצעות מספריים. מניחים בלוטות לתוך צלחת 35 מ"מ עם 2 מ ל של ה-PBS קר (לשמור על הקרח) (איור 1B).
5. כמו LG מכוסה על ידי כמוסה רקמת חיבור/מעטפה, לקצץ כל שומן סביב רקמת החיבור תחת מיקרוסקופ מבתר ולהסיר את הקפסולה LG עם שני מלקחיים.
   1. חזור על שלב זה עבור כל הבלוטות.
6. בדוק פיסת רקמה קטנה תחת מיקרוסקופ פלורסנט כדי להבטיח תיוג תאים (איור 1C).

4. הכנת מתלה חד תאי LG

1. העבר את כל lgs לתוך צלחת 35 mm עם 0.5 mL של טמפרטורת החדר (RT) מדיה העיכול ו lgs האוהב באמצעות מספריים קטנים לתוך חתיכות קטנות מאוד (כ 0.2-1 יקרומטר²). בדרך כלל, זה לוקח בערך 3 דקות כדי האוהב 4 LGs (איור 2C).
2. העברת רקמות כתוש לתוך הצינור התחתון 2 מ ל בתוך התחתית באמצעות מסנן לרוחב מנשא צינורות. השתמש בעצה בגודל רגיל של פיפטה כאשר הקצה נחתך (איור 2D).
3. הוסיפו עד 2 מדיום לעיכול וערבבו על ידי היפוך הצינורית.
4. מניחים צינור באינקובטור רועד (או אמבט מים מטלטל), ב 37 ° c, 100-120 סל"ד עבור 90 דקות.
5. כל 30 דקות לאט בלוטת פיפטה חתיכות 20-30 פעמים באמצעות טיפ 1,000 μL מסנן עם הגודל היורד (איור 2D). לאחר דגירה/trituration, לקחת 10 μl סדרת מחלקים ולבדוק תחת מיקרוסקופ עבור אשכולות. אם האשכולות ממשיכים להתמיד, המשיכו בעיכול.
6. לאחר 90 דקות, לעבור את המדגם 2-3 פעמים דרך מחט מזרק אינסולין (31G) כדי לשחרר עוד תאים לתוך השעיה.
   הערה: אין לראות חתיכות בלוטת לפני ה, צריך להישאר בפתרון לאחר השלמת העיכול (איור 1D).
7. העברת תא הבולם לצינור 15 מ"ל ולהוסיף חסימת סוג המדיה אני עד סך של 5 מ ל. היפוך הצינור 2-3 פעמים כדי לערבב.
8. להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 יקרומטר ממוקם על שפופרת 50 mL. שטוף את מסננת עם 1 mL של חסימת סוג מדיה I. חזור על שלב 4.8 שנית.
9. דגימות צנטריפוגה ב 0.4 x g עבור 5 דקות ב RT.
10. . ומכה את הסופרנטאנט Re-להשעות תאים ב 2 מ ל של חסימת בינונית סוג II באמצעות קצה הצינור 1 mL ולהעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL.
11. צנטריפוגה את התאים ב 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 מ ל רוטור; ראה טבלה של חומרים) עבור 3 דקות ב RT.
12. משוף מחדש את התאים בתוך 1 מ ל של פתרון ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים).
    הערה: כאן, הפתרון לניתוק התא הוא Accutase אנזים מקור ימיים עם פרוטנוגד חרדה ו הקולגן פעילות הניתוק/התנתק תאים לניתוח של סמני פני השטח התא.
13. התאים הדגירה ב 37 ° צ', ב 100-120 rpm עבור 2-3 דקות. העיכול עם פתרון ניתוק תאים עלול להזיק לקרומים הסלולריים.
14. העברת תא הבולם לתוך צינור 50 mL ולהוסיף 10 מ ל של חסימת סוג בינוני I. צנטריפוגה הצינור ב 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 הרוטור מ ל; ראה לוח חומרים) עבור 5 דקות.
15. להיפטר supernatant ו-להשעות מחדש תאים ב 6 מ ל של מדיית התאוששות ותאי דגירה עבור 30 דקות ב RT.
16. בדוק 10 μL של השעיית תא מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח את הדיסוציאציה המלאה של התא (איור 3).
17. ספירת תאים באמצעות מונה תאים וטריבין כחול. בדרך כלל, אנו מצפים 4 x 10⁵-6 x 10⁶ תאים מארבע lgs (מדגם אחד).
18. בתאי צנטריפוגה ב 0.4 x g (24 x 1.5/2.0 הרוטור mL; ראה טבלה של חומרים) עבור 3 דקות ב RT ולהמשיך לצביעת נוגדנים.

5. מכתים את הנוגדן

1. הוסף עד 5 x10⁵ תאים לצינור 2 מ ל המכיל 400 μl של מאגר facs. להוסיף 5 μL של סגול מבריק 421 נגד עכבר CD326 (EpCAM) ו 0.5 μL של Ghost אדום 780 (הכדאיות צבען).
2. במקביל, הכן פקדים להתאמת הפיצוי של FACS:
   שליטה שלילית -1 (תאים מעכבר סוג פראי)
   בקרת רקע תאים בלתי מוכתמים מתוך SMA^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^{חליל/חליל}
   Cy7-780 תאים ויטראז (תאים מן העכבר סוג פראי ומוכתם עם Ghost אדום 780 הכדאיות צבען)
   EpCAM-מבריק סגול 421 (תאים מעכבר סוג פראי מוכתם עם EpCAM-מבריק ויולט 421 נוגדן).
   הערה: עבור כל מדגם פקד להשתמש לפחות 1 x 10⁵ תאים לכל 400 μl של מאגר facs.
3. לאחר הוספת כל לערבב תאים מגיב ביסודיות על ידי ליטוף.
4. לעטוף שפופרת (s) עם נייר כסף ולסובב צינורות עבור 45 דקות ב 4 ° c.
5. דגימות צנטריפוגה ב 0.4 x g (הרוטור 24 x 1.5/2.0 mL; ראה לוח חומרים) עבור 3 דקות ב 4 ° c.
6. השהה מחדש תאים ב-1 mL של מאגר FACS. חשוב לשטוף תאים כדי להקטין את הרקע במהלך הפיצוי.

6. מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

1. העברת תא ההשעיה לתוך 5 מ ל FACS צינורות ולהמשיך עם ניתוח FACS. . לשמור על התאים בקרח
2. התאם פיצוי באמצעות פקדי צבע יחיד.
3. מיון תאים ב 20 psi דרך זרבובית 100 יקרומטר באמצעות הזרימה המתאימה cytometer (ראה טבלת חומרים). Strategy18 מוצג באיור 1E ובאיור 4.
4. לאסוף תאים ממוינים לתוך בינונית, RNA-מאוחר יותר, FACS או מאגרי הליזה בהתאם להליכי המטה (איור 1E, F).

תוצאות

מודל העכבר כדי לבודד SMA + MECs ו קרום הלב
הפרוטוקול הוקם מאפשר בידוד של שתי אוכלוסיות טהורות: MECs ו קרום הלב מ-LGs ו-SMGs (ראה שולחן 1). לשני סוגי תאים אלה יש גודל ומראה שונים. קרום הלב מיקרוציטים, לפתח סביב קירות נימים (איור 5A) ויש להם צורת בריבוע (<...

Discussion

כתב יד זה תיאר פרוטוקול של בידוד לקרום הלב של LG ו-SMG. הליך זה היה מבוסס על תיוג גנטי של SMA, הסמנים האמינים היחיד של MECs ו קרום הראש.

הדחיפות לפיתוח פרוטוקול זה היה מונע על ידי העדר כמעט מוחלט של ספרות המדגיש את הבידוד של MECs מ murine LGs ו-SMGs. למרות תיוג גנטי שימש בעבר, שימוש בעכברים SMA-GFP ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet	SterilCard Baker	19669.1	Class II type A/B3
10 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-910	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
10 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-908	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
15 mL High-clarity polypropylene conical tubes	Falcon	352196
25 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-900	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
5 mL FACS round-bottom tubes	Fisher Scientific, Falcon	14-959-11A
50 mL High-clarity polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15240-062
Appropriate filter and non-filter tips	Any available	Any available
BD Insulin Syringes	Becton Dickinson	328468	with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G
BD Syringes 10 mL	Becton Dickinson	309604	Sterile
Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM)	Biolegend	118225	Monoclonal Antibody (G8.8)
CaCl2 1M solution	BioVision	B1010	sterile
Cell culture dishes 35 mm	Corning	430165	Non-pyrogenic, sterile
Collagenase Type I	Wortington	LS004194
Corn oil	Any avaliable	Any avaliable	From grocery store
Corning cell strainer size 70 μm	Sigma-Aldrich	CLS431751-50EA
Digital Stirrer PC-410D	Corning	Item# UX-84302-50
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
Dissecting scissors, curved blunt	McKesson Argent	487350	Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle
DNase I	Akron Biotech, catalog number	AK37778-0050
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546-500ML	with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12)	Millipore	DF-042-B	without HEPES, L-glutamine
Easypet 3 pipette controller	Eppendorf	4430000018	with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	12-812
FlowJo version 10	Any available	Any available
Fluorescence binocular microscope Axioplan2	Carl Zeiss	ID# 094207
Ghost Red 780 Viability Dye	Tonbo Biosciences	13-0865-T100
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific, Gibco	35050061
Glycerol 99%	Sigma-Aldrich	G-5516
Hand tally counter	Heathrow Scientific	HEA6594
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma Millipore	H6648-500ML	Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14025092	With calcium, magnesium, no phenol red.
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B	02-671-51B
HEPES 1 M solution	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-080	Dilute 1/10 in ddH20
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007002E
Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution	JT Baker	5618-03	To adjust Tris buffer pH
Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator	New Brunswick Scientific	SKU#:	Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air
Iris scissors	Aurora Surgical	AS12-021	Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle
Isoflurane Inhalation Anesthetic	Southern Anesthesia Surgical (SAS)	PIR001325-EA
MgCl2 1 M solution	Sigma-Aldrich	63069-100ML
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	ThermoFisher Scientific	3451	Clear, graduated, sterile
Microsoft Power Point	Any available	Any available
NaCl powder	Sigma-Aldrich	S-3014
Nalgene 25 mm Syringe Filters	Fisher Scientific	724-2020
Pen Strep	Gibco	15140-122
pH 510 series Benchtop Meter	Oakton	SKU: BZA630092
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Pure Ethanol 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200
Red blood cell lysis buffer 10x	BioVision	5831-100
Roto-torque Heavy Duty Rotator	Cole Parmer	MPN: 7637-01
Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf Biopur	22600044	PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free
Scissors	Office Depot	375667
Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	With Summit 6.3 software
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002441	All centrifugation performed at RT
Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	ID# 21550	RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT
Stemi SV6 stereo dissecting microscope	Carl Zeiss	455054SV6	With transmitted light base
Tamoxifen	Millipore Sigma	T5648-1G
Trizma base powder	Sigma-Aldrich	T1503
Trypan blue solution	Millipore Sigma	T8154
Two Dumont tweezers #5	World Precision Instruments	500342	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips
Upright microscope	Any available	Any available	With transmitted light base
Vacuum filtration systems, standard line	VWR	10040-436
Variable volume micropipettes	Any available	Any available