Isolamento de células mioepiteliais das glândulas lacrimal e submandibular de Murina adulta

Resumo

A glândula lacrimal (LG) tem dois tipos de células expressando α-actínio do músculo liso (αSMA): células mioepiteliais (MECs) e pericytes. Os MECS são de origem ectodérmica, encontrados em muitos tecidos glandulares, enquanto os pericitos são células musculares lisas vasculares de origem endodérmica. Este protocolo isola MECS e pericitos de LGS murino.

Resumo

A glândula lacrimal (LG) é uma glândula tubuloacinar exócrina que secreta uma camada aquosa de filme lacrimogêneo. A árvore epitelial da LG é composta de células acinares, Ductais epiteliais e mioepiteliais (MECs). MECS expressam o actina do músculo liso alfa (αsma) e têm uma função contrátil. Eles são encontrados em múltiplos órgãos glandulares e são de origem ectodérmica. Além disso, o LG contém células do músculo liso vascular SMA + de origem endodérmica chamada pericytes: células contrátil que envolvem a superfície dos tubos vasculares. Um novo protocolo nos permite isolar ambos os MECS e pericitos de LGS murino adulto e glândulas submandibulares (SMGS). O protocolo baseia-se na rotulagem genética de MECS e pericitos usando a cepa sma^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/FL mouse, seguida da preparação da suspensão de célula única LG para triagem de células ativadas por fluorescência (FACS ). O protocolo permite a separação destas duas populações da pilha de origens diferentes baseadas na expressão da molécula epithelial da adesão da pilha (epcam) por MECS, visto que os pericitos não expressam epcam. Células isoladas podem ser usadas para o cultivo de células ou análise de expressão gênica.

Introdução

As células mioepiteliais (MECs) estão presentes em muitas glândulas exócrinas, incluindo lacrimal, salivar, harderiana, suor, próstata e mamária. Os MECs são um tipo de célula único que combina um fenótipo epitelial e um músculo liso. MECS Express α-músculo liso actina (SMA) e tem uma função contrátil^1,2. Além dos MECs, a glândula lacrimal (LG) e a glândula submandibular (SMG) contém células vasculares de SMA + denominadas pericytes, que são células de origem endodérmica que envolvem a superfície dos tubos vasculares³. Embora MECS e pericitos expressem muitos marcadores, SMA é o único marcador que não é expresso em outras células LG e SMG^1,3.

Nos últimos 40 anos, vários laboratórios relataram ensaios para dissociação de diferentes tecidos da glândula exócrina, nos quais foram aplicadas abordagens não enzimáticas e enzimáticas. Em um dos primeiros relatórios publicados em 1980, Fritz e coautores descreveram um protocolo para isolar o ácinos felino do parotid usando a digestão seqüencial em uma solução do Collagenase/Trypsin⁴. Em 1989, Hann e os coautores ajustaram este protocolo para o isolamento do ácinos dos LGS do rato usando uma mistura do Collagenase, do hialuronidase e do DNase⁵. Em 1990, Cripps e colegas publicaram o método de dissociação não enzimática da glândula lacrimal ácinos⁶. Mais tarde, em 1998, zoukhri e coautores retornaram a um protocolo de dissociação enzimática para acompanhamento de CA^{2 +}-imagem em LG e SMG isolado ácinos⁷. Na última década, os pesquisadores voltaram seu foco no isolamento de células-tronco/progenitoras de glândulas exócrinas. Pringle e coautores descreveram um protocolo em 2011 para isolamento de células-tronco SMG do mouse⁸. Este método foi baseado no isolamento de salispheres contendo células-tronco, que foram mantidos em cultura. Os autores reivindicaram que as pilhas proliferating que expressam marcadores pilha-associados da haste poderiam ser isoladas destes salispheres⁸. Shatos e coautores publicaram o protocolo para o isolamento de células progenitoras de LGs de ratos adultos não lesionados usando digestão enzimática e coletando células "liberadas"⁹. Mais tarde, em 2015, Ackermann e os coautores ajustaram este procedimento para isolar as "pilhas de haste murine da glândula lacrimal presuntivo" ("mlgscs") que poderiam ser propagadas como uma cultura da mono-camada sobre passagens múltiplas¹⁰. No entanto, nenhum dos procedimentos antes mencionados permitiu distinguir subtipos celulares e populações individuais de células epiteliais isoladas. Em 2016, gromova e coautores publicaram um procedimento para a isolação de pilhas da haste/progenitor de LG dos LGS murino adultos usando FACS¹¹. Entretanto, este protocolo não foi pretendido isolar MECs.

Recentemente, temos demonstrado que somos capazes de isolar as células SMA + de 3 semanas de idade SMA-GFP camundongos¹². Entretanto, neste tempo nós não separamos populações diferentes de pilhas de SMA +. Aqui nós estabelecemos um procedimento novo para o isolamento direto de MECS e de pericitos diferenciados dos LGS e dos SMGs adultos.

Protocolo

Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com as diretrizes do National Institute of Health (NIH) e foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do Scripps Research Institute. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de camundongos e seu sofrimento. Todos os animais experimentais receberam uma dieta padrão com acesso livre à água da torneira.

Nota: Os principais passos para o MEC e o isolamento de pericyte são delineados esquematicamente na Figura 1a-F. Todos os reagentes e equipamentos utilizados para este procedimento estão descritos na tabela 1.

1. camundongos e rotulagem das células SMA

1. Use adulto (2-4 meses velho) tamoxifen-inducible, αSMA driven repórter camundongos sma^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/FL.
   Nota: A cepa sma^CreErt2 foi gentilmente cedido pelo Dr. Ivo kalajzic¹³. Rosa26-TdTomato^fl/FL (B6. CG-gt (ROSA) 26Sor^{tm9 (CAG-tdTomato) Hze}/j, também conhecido como Ai9) estirpe (# 007909) foram comprados de Jackson Laboratory (Sacramento, CA). As pilhas de SMA + foram etiquetadas pela administração intraperitoneal de tamoxifeno (TM).
2. Preparação da solução de tamoxifeno
   1. Prepare o óleo de milho filtrado. Use o filtro de vácuo de 0,22 μm desde que o óleo de milho é viscoso.
   2. Transfira 1 g de pó TM do frasco para um tubo de 50 mL. Adicione 1 mL de etanol ao frasco, tampe e agite-o para enxaguar, em seguida, adicione a um tubo de 50 mL. Repita mais uma vez com mais 1 mL de etanol.
   3. Adicione o óleo de milho filtrado para fazer 50 mL de uma solução de 20 mg/mL TM. Vortex o tubo, enrole-o na folha, e põr o em um banho de água de agitação ou em uma incubadora de agitação em 45 ° c.
   4. Pode demorar cerca de 12-24 h para dissolver o TM. De vez em quando, retire o tubo e verifique se há cristais restantes. Uma vez que a TM é completamente dissolvido, alíquota e armazenar em-80 ° c. Uma alíquota descongelada pode ser reutilizada.
3. Para etiquetar pilhas de SMA +, injete ratos via intraperitoneal (IP) com TM em dois dias sequenciais.
   1. Injetar 3-4 semanas de idade sma^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/f qualquer rato de género com TM a 100 μl/20 g (ou 2 mg/20 g) de peso corporal (Figura 1a). Os camundongos estão prontos para serem usados para isolamento celular em 2-3 dias após a última injeção de TM. Se necessário, os camundongos injetados podem ser sacrificados em períodos mais longos de tempo após a injeção de TM.
      Nota: Como controles para a compensação adequada durante FACS, um tipo selvagem (C57Bl/6) mouse e um sma^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/FL mouse não injetado com TM (com "não manchado" MECS) da mesma idade seria necessário. Use os mesmos cálculos fornecidos para 2 sma^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/FL camundongos. Não injetado sma^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/FL permitirá a avaliação do fundo dsred. O C57Bl/6 mouse servirá como um controle negativo de células não manchadas.

2. soluções e buffers

Nota: A LG é uma glândula de origem epitelial que contém uma matriz extracelular que dificulta a dissociação das células. Portanto, usando uma combinação especial de enzimas e um processo de digestão multistep descrito abaixo é recomendado.

1. Dispase tipo II solução de ações (25x)
   1. Dissolver 120 mg de Dispase tipo II em pó em 2 mL de 50 mM HEPES/150 mM NaCl para preparar uma solução de stock de 25x (a concentração final de Dispase deve ser de 30 unidades/mL). As unidades por miligrama podem variar dependendo do número de camundongos e a concentração do Dispase deve ser ajustada em conformidade.
   2. Prepare 200 μL de alíquotas e guarde-os a-70 ° c por até 6 meses ou 4 ° c durante vários dias. Não congele/descongelar a alíquota de Dispase mais de uma vez para evitar a degradação da enzima.
2. DNase tipo I solução de estoque
   1. Dissolver 5 mg de DNase tipo I em pó numa solução de 5 mL de 50% de glicerol, 20 mM de tampão Tris (pH 7,5) e 1 mM de MgCl₂ (a concentração de ações deve ser de aproximadamente 2000 unidades/ml). As unidades por miligrama podem variar dependendo do número de camundongos e, assim, a concentração de DNase deve ser ajustada em conformidade.
   2. Filtre a solução de estoque usando um filtro de 0,22 μm e uma seringa de 10 mL.
   3. Prepare 200 μL de alíquotas e guarde-os a-70 ° c por até 6 meses ou 4 ° c durante vários dias. Não congele/descongelar mais de uma vez para evitar a degradação da enzima.
3. Meio de digestão
   1. Para 10 mL de DMEM baixa glicose sem glutamina, adicionar 100 μL de suplemento de cultura celular (por exemplo, Glutamax, ver tabela de materiais) para uma diluição de 1:100.
   2. Para 2 mL de DMEM baixa glicose com suplemento de cultura celular, adicionar 6 mg de Collagenase tipo I e misture bem com pipetagem (enzima em gelo molhado), 160 μL de solução de estoque Dispase (2,4 U/mL de concentração final), 16 μL de DNase tipo I solução de estoque (8 U/mL de concentração final) e 12 μL de 1 M de CaCl₂ (6 mm de concentração final).
      Nota: O cálcio é necessário para aumentar a atividade enzimática^14,15. Todos os cálculos são fornecidos para a isolação das pilhas de quatro glândulas lacrimal de dois ratos adultos. O volume de meio de digestão pode variar dependendo da quantidade de tecido e número de repetições. Não use mais de 4 glândulas lacrimais de 2-4 meses de ratos velhos por 2 mL de meio.
4. Meio de bloqueio I
   1. Para 25 mL de DMEM/F-12, adicionar FBS (15% concentração final), 250 μL de suplemento de cultura celular (ver tabela de materiais) para uma diluição de 1:100, e 50 μL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm de concentração final).
      Nota: Dos diferentes tipos de médias que foram comparados para este protocolo DMEM/F-12 deu os melhores resultados. Este meio também tem sido utilizado por outros pesquisadores para isolar/cultura células epiteliais^16,17.
5. Bloqueio médio II
   1. Para 25 mL de PBS, adicionar 50 μL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM de concentração final).
6. Meio de recuperação
   1. Para 2 mL de HBSS suplementado com 5 mM MgCl₂, adicionar 100 ΜL de DNase tipo I solução de ações para 100 U por 2 ml de concentração final. As concentrações relativamente elevadas de DNase-tipo I são exigidas para reduzir a agregação de pilhas epithelial.
7. Buffer de triagem de célula ativada por fluorescência (FACS)
   1. Para 486,5 mL de PBS, adicionar 12,5 mL de soro (2,5% concentração final) e 1 mL de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM de concentração final).
      Nota: O tampão pode ser armazenado em 4 ° c por um máximo de 6 semanas.

3. colheita e microdissecção da glândula lacrimal do rato adulto

1. Anestesiar o rato por inalação de isoflurano (ajustar a taxa de fluxo de isoflurano ou a concentração para 5% ou maior) e sacrificar por luxação cervical. Realize anestesia e eutanásia de acordo com as recomendações institucionais do IACUCs.
2. Usando pinças finas e tesouras, retire a pele entre o olho e a orelha (Figura 2a).
3. Para dissecar um LG, puxe suavemente LG usando pinças e, ao mesmo tempo arranhar o tecido conjuntivo em torno da LG usando a ponta afiada de pequenas tesouras para liberá-lo (Figura 2b).
4. Evite cortar com tesouras, porque as glândulas salivares do LG e do parotid são situadas muito perto de se e devem ser separadas antes da dissecção. Quando a LG e as glândulas parótidas são separadas, cortar o LG fora usando tesouras. Coloque as glândulas em um prato de 35 mm com 2 mL de PBS frio (manter no gelo) (Figura 1b).
5. Como a LG é coberta por uma cápsula do tecido conjuntivo/envelope, aparar qualquer tecido adiposo e conjuntivo circundante um microscópio de dissecação e remover a cápsula LG com dois fórceps.
   1. Repita este passo para todas as glândulas.
6. Verifique um pequeno pedaço de tecido microscópio fluorescente para garantir a rotulagem celular (Figura 1C).

4. preparação da suspensão de célula única LG

1. Transfira todos os LGs para um prato de 35 mm com 0,5 mL de meios de digestão de temperatura ambiente (RT) e mince LGs usando pequenas tesouras em pedaços muito pequenos (aproximadamente 0,2-1 μm²). Normalmente, demora cerca de 3 min para mince 4 LGs (Figura 2C).
2. Transfira o tecido picado para um tubo inferior redondo de 2 mL usando uma ponta de filtro de pipeta de furo largo. Use uma ponta de pipeta de tamanho normal com a ponta cortada (Figura 2D).
3. Adicione até 2 mL de meio de digestão e misture invertendo o tubo.
4. Coloque o tubo em uma incubadora de agitação (ou agitando o banho de água), em 37 ° c, 100-120 rpm para 90 minutos.
5. Cada 30 min lentamente pipeta glândula peças 20-30 vezes usando uma ponta de filtro 1.000 μL com o tamanho do furo decrescente (Figura 2D). Após a incubação/trituração, tome uma alíquota de 10 μL e inspecione um microscópio para aglomerados. Se os clusters persistirem, continue a digestão.
6. Após 90 min, passe a amostra 2-3 vezes através de uma agulha de seringa de insulina (31G) para liberar as células em suspensão.
   Nota: Nenhuma peça de glândula lacrimal visível deve permanecer na solução após a conclusão da digestão (Figura 1D).
7. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL e adicione o tipo de mídia de bloqueio I a um total de 5 mL. Inverta o tubo 2-3 vezes para misturar.
8. Passe a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 μm colocado em um tubo de 50 mL. Lave o filtro com 1 mL de tipo de mídia de bloqueio I. Repita o passo 4,8 novamente.
9. Centrifugue amostras em 0,4 x g por 5 minutos em RT.
10. Aspirar o sobrenadante. Re-suspender as células em 2 mL de bloqueio médio tipo II usando uma ponta de pipeta de 1 mL e transferir a suspensão da célula em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
11. Centrifugar as células a 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml de rotor; ver tabela de materiais) durante 3 min em RT.
12. Aspirar sobrenadante e re-suspender as células em 1 mL de solução de descolamento celular (ver tabela de materiais).
    Nota: Aqui, a solução do destacamento da pilha é accutase, uma enzima da marinho-origem com atividade proteolíticas e gelatinolitica que separa/dissociates pilhas para a análise de marcadores de superfície da pilha.
13. Incubar células a 37 ° c, a 100-120 rpm por 2-3 min. excesso de digestão com solução de descolamento celular pode danificar as membranas celulares.
14. Transfira a suspensão da pilha em um tubo de 50 mL e adicione-o acima de 10 mL do tipo médio de bloqueio I. tubo de centrifugação a 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml de rotor; ver tabela de materiais) por 5 min.
15. Descarte o sobrenadante e Resuspenda as células em 6 mL de meios de recuperação e incubar células por 30 min em RT.
16. Verificar 10 μL de suspensão celular o microscópio para garantir a dissociação completa da célula (Figura 3).
17. Contagem de células usando um contador de células e azul de trypan. Normalmente, esperamos 4 x 10⁵-6 x 10⁶ células de quatro LGS (uma amostra).
18. Células centrífugas a 0,4 x g (24 x 1,5/2,0 ml de rotor; ver tabela de materiais) durante 3 min em RT e proceder à coloração de anticorpos.

5. coloração do anticorpo

1. Adicione até 5 x10⁵ células a um tubo de 2 ml contendo 400 μL de tampão FACS. Adicionar 5 μL de violeta brilhante 421 anti-mouse CD326 (EpCAM) e 0,5 μL de Ghost Red 780 (viabilidade corante).
2. Em paralelo, prepare os controles para ajustar a compensação FACS:
   Negativo Control-1 (células do tipo Wild mouse)
   Controle de fundo células não manchadas de sma^CreErt2/+: Rosa26-tdtomato^fl/FL
   Cy7-780 células manchadas (células do tipo Wild mouse manchado com o Ghost Red 780 viabilidade corante)
   EpCAM-Brilliant Violet 421 (células do rato tipo selvagem coradas com o anticorpo EpCAM-Brilliant Violet 421).
   Nota: Para cada amostra de controle, use um mínimo de 1 x 10⁵ células por 400 μL de tampão FACS.
3. Após a adição de cada reagente misturar as células completamente por pipetagem.
4. Enrole o tubo (s) com a folha e gire os tubos para 45 min a 4 ° c.
5. Amostras de centrifugação a 0,4 x g (rotor de 24 x 1,5/2,0 ml; ver tabela de materiais) durante 3 min a 4 ° c.
6. Resuspender células em 1 mL do buffer FACS. É importante para lavar as células para diminuir o fundo durante a compensação.

6. fluorescência ativada célula de triagem

1. Transfira a suspensão da pilha em 5 tubos de mL FACS e prossiga com a análise de FACS. Mantenha as células no gelo.
2. Ajuste a compensação usando controles de cor única.
3. Classifique as células a 20 psi através de um bocal de 100 μm usando o citometro de fluxo apropriado (ver tabela de materiais). A gating strategy18 é mostrada na Figura 1e e na Figura 4.
4. Colete células classificadas em meio, RNA-mais tarde, FACS ou buffers de Lise dependendo dos procedimentos downstream (Figura 1e, F).

Resultados

Modelo do rato para isolar sma + MECS e pericitos
O protocolo estabelecido permite o isolamento de duas populações puras: MECS e pericitos de LGS e SMGs (ver tabela 1). Esses dois tipos de células têm um tamanho e aparência diferentes. Os pericytes microvasculares, desenvolvem-se em torno das paredes dos capilares (Figura 5a) e têm uma forma quadrada (Figura 5b), enquanto os MECS cercam ...

Discussão

Este manuscrito descreveu um protocolo de isolamento MEC e pericyte da LG e SMG. Este procedimento foi baseado na rotulagem genética de SMA, o único biomarcador de confiança de MECs e pericytes.

A urgência de desenvolver este protocolo foi motivada pela ausência quase total de literatura destacando o isolamento de MECs de LGs murino e SMGs. Embora a rotulagem genética fosse usada previamente, usando ratos de SMA-GFP para isolar pilhas de SMA + dos jovens três-week-old LGs

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety Cabinet	SterilCard Baker	19669.1	Class II type A/B3
10 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-910	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
10 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-908	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
15 mL High-clarity polypropylene conical tubes	Falcon	352196
25 mL Disposable serological pipets	VWR	89130-900	Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged
5 mL FACS round-bottom tubes	Fisher Scientific, Falcon	14-959-11A
50 mL High-clarity polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15240-062
Appropriate filter and non-filter tips	Any available	Any available
BD Insulin Syringes	Becton Dickinson	328468	with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G
BD Syringes 10 mL	Becton Dickinson	309604	Sterile
Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM)	Biolegend	118225	Monoclonal Antibody (G8.8)
CaCl2 1M solution	BioVision	B1010	sterile
Cell culture dishes 35 mm	Corning	430165	Non-pyrogenic, sterile
Collagenase Type I	Wortington	LS004194
Corn oil	Any avaliable	Any avaliable	From grocery store
Corning cell strainer size 70 μm	Sigma-Aldrich	CLS431751-50EA
Digital Stirrer PC-410D	Corning	Item# UX-84302-50
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
Dissecting scissors, curved blunt	McKesson Argent	487350	Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle
DNase I	Akron Biotech, catalog number	AK37778-0050
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546-500ML	with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12)	Millipore	DF-042-B	without HEPES, L-glutamine
Easypet 3 pipette controller	Eppendorf	4430000018	with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	12-812
FlowJo version 10	Any available	Any available
Fluorescence binocular microscope Axioplan2	Carl Zeiss	ID# 094207
Ghost Red 780 Viability Dye	Tonbo Biosciences	13-0865-T100
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific, Gibco	35050061
Glycerol 99%	Sigma-Aldrich	G-5516
Hand tally counter	Heathrow Scientific	HEA6594
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma Millipore	H6648-500ML	Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14025092	With calcium, magnesium, no phenol red.
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B	02-671-51B
HEPES 1 M solution	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-080	Dilute 1/10 in ddH20
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007002E
Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution	JT Baker	5618-03	To adjust Tris buffer pH
Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator	New Brunswick Scientific	SKU#:	Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air
Iris scissors	Aurora Surgical	AS12-021	Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle
Isoflurane Inhalation Anesthetic	Southern Anesthesia Surgical (SAS)	PIR001325-EA
MgCl2 1 M solution	Sigma-Aldrich	63069-100ML
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	ThermoFisher Scientific	3451	Clear, graduated, sterile
Microsoft Power Point	Any available	Any available
NaCl powder	Sigma-Aldrich	S-3014
Nalgene 25 mm Syringe Filters	Fisher Scientific	724-2020
Pen Strep	Gibco	15140-122
pH 510 series Benchtop Meter	Oakton	SKU: BZA630092
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Pure Ethanol 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200
Red blood cell lysis buffer 10x	BioVision	5831-100
Roto-torque Heavy Duty Rotator	Cole Parmer	MPN: 7637-01
Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf Biopur	22600044	PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free
Scissors	Office Depot	375667
Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	With Summit 6.3 software
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002441	All centrifugation performed at RT
Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	ID# 21550	RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT
Stemi SV6 stereo dissecting microscope	Carl Zeiss	455054SV6	With transmitted light base
Tamoxifen	Millipore Sigma	T5648-1G
Trizma base powder	Sigma-Aldrich	T1503
Trypan blue solution	Millipore Sigma	T8154
Two Dumont tweezers #5	World Precision Instruments	500342	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips
Upright microscope	Any available	Any available	With transmitted light base
Vacuum filtration systems, standard line	VWR	10040-436
Variable volume micropipettes	Any available	Any available