探头电喷电镀质谱的样品制备

摘要

本文介绍了一种基于环境质谱的独特实时分析方法的样品制备方法。这种方法使我们能够对体内的生物分子进行实时分析，无需任何特殊的预处理。

摘要

质谱（MS）是分析化学中一种强有力的工具，因为它提供了非常准确的分子信息，如质量-电荷比（m/z），这些信息有助于推导分子量和结构。虽然它本质上是一种破坏性的分析方法，但环境电离技术的最新进展使我们能够获取数据，同时使组织在完整性方面处于相对完整的状态。探头电喷雾电化（PESI）是一种所谓的直接方法，因为它不需要对样品进行复杂而耗时的预处理。细针用作样品拾取器和电电化发射器。基于探针尖端非常尖锐和精细的特性，对样品的破坏是最小的，使我们能够从原地生物获取实时分子信息。在这里，我们介绍了PESI-MS技术的三个应用，这些应用对生物医学的研究和发展是有用的。一是固体组织的应用，是该技术在医学诊断中的基本应用。由于此技术只需要 10 毫克的样品，它可能在常规临床设置中非常有用。第二个应用是体外医学诊断，其中测量人血清。测量流体样品的能力在各种生物实验中也很有价值，因为无法为常规分析技术提供足够的样品量。第三个应用倾向于在活体动物中直接应用探针，我们可以在特定的器官中获得代谢物或药物的实时动力学。在每个应用中，我们可以推断MS检测到的分子，或者使用人工智能来获得医学诊断。

引言

质谱（MS）是一种还原论的技术实现;它将分析对象减少到一个可以基于分子物种或级联解释的单位。因此，它是分析化学的一种代表性方法。它由四个过程组成:电电化、分析、检测和光谱采集。由于分子电电化是质谱学的第一个过程，它通常限制分析物的加工形式。大多数电电化过程都需要破坏有机样品的结构、形态和实时生物过程。例如，电喷雾电电化 （ESI） MS 要求样品处于液态，以便实现高效的电^电1。因此，样品必须经过复杂的生化制备，从而改变分子的组成。另外，虽然基质辅助激光解吸电离（MALDI）MS可以重建薄切片组织^2、3的分子图，但其电离效率太低，无法检测样品中的所有分子，在分析脂肪酸方面尤为差。考虑到这些限制，探针电喷电电（PESI）4可用于观察生物系统在原位的实时变化，而不会破坏结构完整性^5，而被观测的生物体在技术上处于生存状态。在这种情况下，使用非常精细的针头，同时用作样品拾取器和辐射体。这意味着可以绕过复杂的样品预处理序列，以获得反映原位生命系统分子成分的质量光谱。

还有其他几种电电化方法与PESI-MS相媲美。一个是快速蒸发电电化质谱（REIMS）6。这种技术在手术中效果很好，因为它用电刀组装，并收集切口过程中产生的电羽。虽然REIMS对手术非常有用，但它本质上是一种破坏性方法，需要组织电消融。因此，在准备样品或实验室分析中，它对于细胞和组织的详细分析没有用处。此外，由于它收集了大量含有组织碎片的羽状物，因此每次使用后都需要对设备进行长时间的维护，从而将这种机器的使用限制在特殊的外科手术中。一种类似的方法，称为激光脱吸电团质谱法（LDI-MS）7，是另一种非侵入性的技术，对表面分析有用。由于该技术擅长扫描标本表面，因此实现了像MALDI成像质谱^仪8、9等综合二维分析。然而，由于LDI-MS仅适用于表面分析，PESI-MS有利于分析样品，例如组织内的样品。另一种技术，MasSpec Pen^10，据报道，在诊断甲状腺癌时达到高特异性和灵敏度，但探针的直径是毫米的，它是特定于表面分析，这意味着它不能检测癌症或深度局部病变的小结节。此外，由于该方法使用嵌入在探针笔中的微毛细管流管，因此必须考虑交叉污染，类似于 LDI-MS。其他技术已经应用于临床设置，如流动探针和电电化形式拭^11，但它们并不普遍。

PESI 是 ESI 的极端小型化，其中纳米电喷的毛细管收敛在尖曲半径为几百 nm 的固体针上。电离发生在针尖的极限区，形成泰勒锥体，样品一直保留，直到尖端上所有液体的电离完成^12。如果分析物停留在金属针尖上，则在金属针和分析物之间的界面处连续产生过量电荷。因此，分子的连续电电化取决于其表面活性。此属性使针尖成为一种色谱图，根据分析物的表面活动分离分析物。更从技术上讲，表面活性较强的分子会进入泰勒锥体表面，并且比表面活性较弱的分子更早电离，这些分子会粘附在针的表面直到电离过程结束。因此，所有被针拾取的分子完全电电化是^13。此外，由于这种技术不涉及在样品中添加多余的溶剂，几百个飞升足以得到足够强的质谱，以便进一步分析^14。这些特性有利于分析完整的生物样品。然而，PESI-MS 的一个主要缺点是电电位不连续，因为针沿垂直轴的往复运动类似于锯床。仅当孔孔的高度与水平轴对齐时，探头尖端达到最高点时才会发生电一合。当针拾取样品时，电电停止，因此电电化的稳定性不等于传统ESI。因此，PESI-MS 不是蛋白质组学的理想方法。

迄今为止，PESI-MS主要应用于生物系统的分析，涵盖从基础研究到临床环境的广泛领域。例如，对手术期间准备的人体组织的直接分析能够揭示出肾细胞癌¹⁵和咽癌¹⁶中三乙甘油的积累。这种方法还可以测量液体样品，如血液，以专注于脂质轮廓。例如，在兔子的饮食变化过程中，一些分子被划定;据介绍，其中一些分子在实验初期就减少了，表明该系统对^{临床诊断具有很高的}灵敏度和实用性。此外，直接应用于活的动物允许在禁食⁵一晚后检测肝脏的生化变化。Zaitsu等人¹⁸日再次对实验⁵进行了重新实验，以几乎相同的方式分析了肝脏的代谢特征，结果增强了我们原始方法的稳定性和可重复性。此外，我们利用这项技术¹⁹区分小鼠的癌症组织与周围非癌性肝脏。因此，这是一种多功能质谱技术，在各种环境中（包括体内和体外）都很有用。从另一个角度来看，PESI 模块可以通过调整安装附件来适应各种质谱仪。在这篇短文中，我们介绍了应用的基本和示例（图1），包括带有活体动物的应用程序^5。

根据每个国家的条例和法律，需要修订本议定书的某些部分，以满足每个机构的标准。应用于活生物体是最有趣和最具挑战性的，因为它可以在原位活动物的组织中或器官中提供生化或代谢变化。虽然这项申请在2013^年得到了山梨大学动物护理机构委员会的批准，但由于最近动物实验法规的变更，现在需要再进行一轮批准。因此，对实验方案进行一些修改是可取的。关于实验中获得的质谱，考虑到每次测量之间的质谱波动，没有核苷酸测序界共有的光谱信息共享系统。操作者处理针头时必须小心，以避免针棒事故，尤其是在从针架上取下针头时。分离针头的特殊装置对于此用途非常有用。由于 PESI 模块的隔间是一个密封、封闭的腔室，因此，如果根据说明操作质谱仪，则不会发生电羽泄漏。

研究方案

山梨大学动物护理机构委员会批准了本文所述的所有协议和实验动物的使用。人工样本的使用得到了山梨大学机构伦理委员会的批准。

1. 固体组织制备

注:样品从动物或人体中取出后，必须保存在冰上，以保持组织的新鲜度。如果测量不立即进行解剖，建议将组织储存在-80°C。不建议将组织放在任何类型的缓冲液或盐水中，因为它们可能从组织中提取某些内容物。已用醛固定或嵌入石蜡/蜡或冷冻凝胶的组织不适合 MS 测量。

1. 使用手术刀或刀将组织标本切割至约 2 x 2 x 2 mm。或者，用用于皮肤检查的颤音（一次性活检冲床，孔径 3 mm）打孔样品。在这种情况下，将列的长度修剪为 2 mm。
   注:任何组织都可以使用这种方法进行分析。在这项实验中，对肝¹⁵和肾¹⁹进行了成功的分析，获得了质谱。一般来说，皮质器官提供良好的质谱，而那些有纤维成分的器官则不能。
2. 如果组织被血液污染，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水短暂清洗。
   注:为了尽量减少死后组织损伤，请尽快在室温下完成此步骤。如果不立即进行测量，将组织冷冻在液氮中并储存在-80°C。
3. 将切割或打孔样品（约 10 mg）放入塑料微管中，加入 100 μL 的 50% 乙醇。
   注: 样品的确切重量尚未确定，因为该系统中使用的质谱法不提供定量数据。约10毫克是最佳的，为皮质组织。
4. 使用微微器对样本进行均质化。
5. 将10μL的均质物放入墨盒的井中（图2）。
6. 将墨盒放在质谱仪的电光室中，并安装用于样品电电化的不锈钢针探头（图2）。
   注:探头针由制造商提供。它们由不锈钢制成，曲率半径约为 400 nm。
7. 牢牢合合住造型室盖，自动激活安全装置。
8. 单击"开始"图标进行分析，启动板载计算机。使用屏幕面板，对针施加 2.3 kV 的电压以产生电喷，并确保针的频率为 3 Hz。
9. 等待 30 s 完成测量。
   注: 数据采集完成后，会话将自动停止。分析的质量由总电子色谱图 （TIC） 监控。测量时间是为了获得具有代表性的质谱而定义的，可以缩短或延长。
10. 测量每个样品后，将墨盒和针头处理在生物危害处理器中。
    注:一次只能测量一个样品。每次测量前无需校准机器;校准取决于供应商每六个月进行一次定期检查。
11. 分析质谱并使用与质谱仪相关的软件（参见材料表）导出质谱文本数据（图3）。
    1. 单击软件的数据文件浏览器窗口中的lcd文件。
    2. 选择并单击质量光谱窗口上的单个峰值，并自动描述提取的电子色谱图 （EIC）。
    3. 检查 TIC 和 EIC 并单击平均频谱图标以选择生成质量频谱的时间范围窗口。
       注:在此分析中，目标分子出现在质量-电荷比（m/z）窗口中 （图 3）。此外，由于针运动单冲程的电电化持续时间很短，因此获得的所有质谱基本上都是平均光谱超过 10 s（300 次扫描）。
    4. 单击"导出"选项卡进行进一步分析，生成包含m/z和 ion 强度的文本文件。此文本文件可以存储在任何文件夹中。
       注:任何RNA防腐剂都会影响样品的原生光谱模式。此外，建议在没有任何液体（如磷酸盐缓冲盐水）的情况下处理和储存组织，以防止在储存过程中将分子成分从组织洗脱到液体中。理想情况下，使用未经任何处理的新鲜或新鲜冷冻样品。

2. 体液（血清）制剂

注:整个过程几乎与用于固体组织的程序相同。液体样品的墨盒可从制造商获得。由于红血球（RBC）的污染会大大降低预期成分（血浆或血清）的光谱采集效率，因此在测量前一定要通过离心来消除所有红细胞。

1. 取10μL的血清样本，并将其放入1.5 mL微管中。
   注:可使用新鲜血清和储存血清。
2. 将190 μL的50%乙醇加入1.5 mL管中，然后在室温下涡旋2分钟。
3. 在 4°C 下将液体在 15，000 x g下离心 1-5 分钟。
4. 将 10 μL 的上清液转移到墨盒的井中。
5. 将墨盒放在机器的电感室中，并安装用于样品电电化的不锈钢针探头（图2）。
6. 牢牢合合住造型室盖，自动激活安全装置。
7. 单击"开始"图标进行电子化，启动板载计算机。
8. 测量完成后，请丢弃样品盒和针头，如 1.10 中所述。
9. 如下所述分析获得的 EIC 集（图 3）。
   1. 打开数据浏览器上的lcd 文件。
   2. 单击单个峰值以显示 TIC 和 EIC。
   3. 使用平均光谱图标选择生成质谱的时间范围窗口。
   4. 通过单击监视器上的导出选项卡导出包含相应峰值的m/z和 ion 强度的生成的文件。
      注:此程序也适用于唾液、尿液和其他体液。

3. 活体中PESI-MS的体内准备

注:在本节中，介绍了在活小鼠模型中监测5-Fluoro-2'-脱氧尿氨酸（5-FdU）代谢概况的应用。使用无菌条件。

1. 将 100 mM 5-FdU 溶液注入 2 个月大小鼠的尾静脉（约 20 g 重量）。
   注:没有偏好性，年龄，或小鼠应变。虽然这个协议在我们^{进行实验5}时得到了批准，但是这个实验的可行性取决于进行实验的国家的道德限制。
2. 按照您批准的动物护理协议对小鼠进行麻醉。评估麻醉的深度，由于缺乏对尾部挤压的反应。
   注:如果伦理委员会不允许使用五巴比妥钠进行动物实验，则可采用其他方法，如盐酸氯胺酮。
3. 使用电动剃须刀剃腹腔，并在眼睛上涂抹兽医膏。
4. 将麻醉小鼠置于固定位置，并使用修补胶带将爪子固定在塑料板上。用70%酒精的磨砂三次擦洗手术部位。
5. 用剪刀切开腹腔。首先，从隔膜上方横向切割皮肤（10 毫米）。横向切开腹部体壁和腹膜的肌肉（约7毫米），并用不锈钢线将伤口保持打开，露出肝脏表面。
   注:无需注入肝脏表面。
6. 将探针尖涂抹在肝脏表面。将针的深度调整到大约 0.5 mm 深，以优化电离效率，同时检查 TIC 和光谱模式。在控制面板的屏幕上将高压设置为 2.3 kV，将频率设置为 3 Hz。
7. 将动物从塑料板上取下。
8. 使用手术肠道缝合伤口，并将鼠标送回笼子。不要让鼠标无人看管，直到它恢复意识，以保持胸腔。在老鼠完全恢复之前，不要将鼠标归还给其他动物的陪伴。
9. 执行 EIC 中 iIC 中电子强度的时间过程和 EIC 描述过程，如 1.11.1 到 1.11.4。

结果

如图3所示，PESI-MS技术获得的数据是质谱，其m/z在此系统中的m/z范围为10至1，200。虽然可以检测到高达m/z 2，000 的分子，但使用这种技术在m/z 1，200 的质量范围内获得的峰值很少。因此，我们分析了从m/z 10 到 1，200 的峰值。m/z 800 和 900 周围有明显的山峰群;前者代表细胞膜成分，如磷脂酰胆碱（PC）种类，后者代表三...

讨论

虽然PESI是ESI的质谱⁴的衍生物，但它最有利于监测实时代谢组学，以及分析生化反应，而无需执行任何复杂或耗时的预处理5，14，15，17。它是一种简单和瞬时的质谱技术，可应用于生物体的集成状态。由于它不需要复杂的样品预处理级联，因此评估整个标本的分子组成的可能性要大?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020