Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Özet

Bu makalede, ortam kütle spektrometresi dayalı benzersiz bir gerçek zamanlı analitik yöntem için örnek hazırlama yöntemleri tanıtılmaktadır. Bu yöntem, herhangi bir özel ön işlem olmadan in vivo biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı analizini yapmamızı sağlar.

Özet

Kütle spektrometresi (MS), molekül ağırlıklarını ve yapılarını anlamaya yararlı olan kütle-yük oranları(m/z)gibi moleküller hakkında çok doğru bilgiler sağladığından analitik kimyada güçlü bir araçtır. Esasen yıkıcı bir analitik yöntem olmakla birlikte, ortam iyonizasyon tekniğindeki son gelişmeler, dokuları bütünlük açısından nispeten sağlam bir durumda bırakırken veri elde etmemizi sağlamıştır. Probu elektrosprey iyonizasyonu (PESI), numunelerin karmaşık ve zaman alıcı ön işlemesini gerektirmediği için doğrudan bir yöntemdir. İnce bir iğne örnek toplayıcı nın yanı sıra iyonizasyon yayıcısı olarak da hizmet vermektedir. Sonda ucunun çok keskin ve ince özelliğine dayanarak, numunelerin imhası çok azdır, bu da canlılardan gerçek zamanlı moleküler bilgiyi yerinde elde etmemizi sağlar. Burada, biyomedikal araştırma ve geliştirme için yararlı olacak PESI-MS tekniğinin üç uygulama tanıtmak. Bunlardan biri, tıbbi tanı için bu tekniğin temel uygulaması olan katı dokuya uygulama içerir. Bu teknik numunenin sadece 10 mg'ını gerektirdiğinden, rutin klinik ortamlarda çok yararlı olabilir. İkinci uygulama, insan kan serumu ölçülür in vitro tıbbi tanı içindir. Sıvı numunelerini ölçme yeteneği, geleneksel analitik teknikler için yeterli numune hacminin sağlanamadığı çeşitli biyolojik deneylerde de değerlidir. Üçüncü uygulama, belirli organlardaki metabolitlerin veya ilaçların gerçek zamanlı dinamiklerini elde edebileceğimiz canlı hayvanlarda prob iğnelerinin doğrudan uygulanmasına doğru eğilir. Her uygulamada, MS tarafından tespit edilen molekülleri çıkartabilir veya tıbbi tanı almak için yapay zeka kullanabiliriz.

Giriş

Kütle spektrometresi (MS) indirgemecılığın teknolojik bir gerçekliğidir; analiz nesnesini moleküler türler veya basamaklar temelinde yorumlanabilecek bir birime indirir. Bu nedenle, analitik kimya temsili bir yöntemdir. Dört işlemden oluşur: iyonizasyon, analiz, algılama ve spektral edinim. Molekülün iyonizasyonu kütle spektrometresindeki ilk işlem olduğundan, genellikle işlenecek analitlerin şeklini kısıtlar. Çoğu iyonizasyon işlemi organik örneklerin yapısının, morfolojisinin ve gerçek zamanlı biyolojik süreçlerinin yok edilmesini gerektirir. Örneğin, elektrosprey iyonizasyon (ESI) MS, numunelerin verimli iyonizasyon¹için sıvı halde olmasını gerektirir. Bu nedenle numuneler, moleküllerin bileşimini değiştiren karmaşık bir biyokimyasal preparattan geçmelidir. Alternatif olarak, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) MS ince kesitli doku moleküler haritaları yeniden inşa ederken^2,3, iyonlaşma verimliliği örneklerdeki tüm molekülleri tespit etmek için çok düşük, ve yağ asitlerini analiz özellikle zayıftır. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, prob elektrosprey iyonizasyon (PESI)⁴ yapısal bütünlüğü yok etmeden yerinde biyolojik sistemlerde gerçek zamanlı değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir⁵, biyolojik organizma gözlemlenen bir canlı durumda iken. Çok ince bir iğne aynı anda bir örnek toplayıcı ve bir iyon yayıcısı olarak hizmet vermektedir bu durumda kullanılır. Bu karmaşık örnek ön işlem dizileri yerinde yaşayan sistemin moleküler bileşenleri yansıtan kütle spektrumları elde etmek için atlanabilir anlamına gelir.

PESI-MS'e rakip olan birkaç iyonlaşma yöntemi vardır. Bunlardan biri hızlı buharlaşma iyonlaşma kütle spektrometresi (REIMS)^6. Bu teknik ameliyat sırasında iyi çalışır, çünkü elektrik bıçağı ile monte edilir ve kesi sırasında oluşan iyon tüylerini toplar. REIMS ameliyat için çok yararlı olsa da, aslında dokunun elektrikablasyon gerektiren yıkıcı bir yöntemdir. Bu nedenle, önleyici bir numunede veya laboratuvar analizlerinde hücre ve dokuların detaylı analizi nde yararlı değildir. Ayrıca, doku enkazı içeren tüy büyük miktarda toplar çünkü, böylece özel cerrahi prosedürler için bu makinenin kullanımını sınırlayan, her kullanımdan sonra cihazların uzun bakım gerektirir. Benzer bir yöntem, lazer desorpsiyon iyonizasyon kütle spektrometresi denir (LDI-MS)^7,noninvaziv ve yüzey analizi için yararlı başka bir tekniktir. Bu teknik bir numunenin yüzeyini taramakta iyi olduğundan, MALDI görüntüleme kütle spektrometresi^8,9gibi kapsamlı iki boyutlu analizler elde eder. Ancak, LDI-MS sadece yüzey analizi için geçerli olduğundan, PESI-MS örneğin doku içinde örnekleri analiz etmek için avantajlıdır. Başka bir teknik, MasSpec Pen¹⁰, tiroid kanseri tanısında yüksek özgüllük ve duyarlılık elde etmek için bildirilmiştir, ancak sonda çapı mm sırasına göre ve yüzey analizi için özel, bu kanser veya derin lokalize lezyonların küçük nodülleri tespit edemez anlamına gelir. Ayrıca, bu yöntem prob kalemine gömülü bir mikrokapiller akış kanalı kullandığından, ldi-MS'e benzer şekilde çapraz kontaminasyon göz önünde bulundurulmalıdır. Akış probu ve iyonizasyon formu¹¹gibi klinik ortamlara uygulanan diğer teknikler vardır, ancak yaygın değildir.

PESI ESI aşırı minyatürleştirme, nano-elektrosprey kılcal birkaç yüz nm bir uç eğrilik yarıçapı ile katı bir iğne üzerinde yakınsama nerede. İyonizasyon bir Taylor koni oluşturarak iğne ucu nun son derece kısıtlı alanda gerçekleşir, hangi örnekler ucunda ki tüm sıvı iyonizasyon tamamlanana kadar kalır¹². Analit metal iğnenin ucunda kalırsa, metal iğne ile analit arasındaki arabirimde sürekli olarak aşırı yük üretilir. Bu nedenle, moleküllerin ardışık iyonizasyonu yüzey aktivitelerine bağlı olarak gerçekleşir. Bu özellik, iğne ucunu bir tür kromatogram yapar ve analitleri yüzey aktivitelerine bağlı olarak ayırır. Daha teknik olarak, daha güçlü yüzey aktivitesine sahip moleküller Taylor koninin yüzeyine gelir ve iyonlaşma işleminin sonuna kadar iğnenin yüzeyine yapışan daha zayıf yüzey aktivitesine sahip moleküllerden daha erken iyonize edilirler. Böylece iğne ile alınan tüm moleküllerin tam iyonizasyonu^{elde edilir 13.} Ayrıca, bu teknik numuneye gereksiz çözücü eklenmesini içermediğinden, yüzlerce femtolitre daha fazla analiz için kütle spektrumları almak için yeterlidir¹⁴. Bu özellikler bozulmamış biyolojik numunelerin analizi için avantajlıdır. Ancak PESI-MS'in en büyük dezavantajı, iğnenin dikey eksen boyunca karşılıklı hareketi nedeniyle iyonizasyonda süreksizlikte yatar, testere makinesine benzer. İyonlaştırma, yalnızca iyon deliğin yüksekliği yatay eksenüzerinde hizalandığında sondanın ucu en yüksek noktaya ulaştığında gerçekleşir. İğne numuneleri alırken iyonizasyon durur ve böylece iyonlaşma nın stabilitesi geleneksel ESI'dekine eşit değildir. Bu nedenle PESI-MS proteomik ler için ideal bir yöntem değildir.

Pesi-MS bugüne kadar temel araştırmalardan klinik ortamlara kadar geniş bir alanı kapsayan biyolojik sistemlerin analizine uygulanmıştır. Örneğin, ameliyat sırasında hazırlanan insan dokusunun doğrudan analizi hem renal hücreli karsinom¹⁵ hem de faringeal skuamöz karsinom¹⁶triasilgliserin birikimini ortaya çıkarmak başardı. Bu yöntem aynı zamanda lipid profiliodaklanmak için kan gibi sıvı örnekleri, ölçebilirsiniz. Örneğin, bazı moleküller tavşan diyet değişiklikleri sırasında hatlarını olmuştur; bu moleküllerin bazılarının deneylerin çok erken aşamalarında azaldığı bildirilmiştir, bu da bu sistemin klinik tanı için yüksek hassasiyetini ve kullanışlılığını göstermektedir¹⁷. Ayrıca, canlı bir hayvan doğrudan uygulama oruç sadece bir gece sonra karaciğer biyokimyasal değişikliklerin tespiti ne izin⁵. Zaitsu ve ark.¹⁸ bu deney^itekrar 5 ve hemen hemen aynı şekilde karaciğer metabolik profilleri analiz, istikrar ve orijinal yöntemin tekrarlanabilirlik güçlendirdi sonuçları ile. Ayrıca, bu tekniği kullanarak farelerde kanser olmayan karaciğer çevreleyen kanser dokusu ayırt başardık¹⁹. Bu nedenle, bu in vivo ve in vitro hem de çeşitli ortamlarda yararlı olan çok yönlü bir kütle spektrometresi tekniğidir. Başka bir açıdan, PESI modülü montaj eki ayarlayarak çeşitli kütle spektrometresığacak şekilde yapılabilir. Bu kısa makalede, temel leri ve uygulamaları örnekler tanıtmak (Şekil 1), canlı hayvanlar la uygulamalar da dahil olmak üzere⁵.

Her ülkedeki mevzuat ve yasalara göre, her kurumun kriterlerini karşılamak için bu protokolün bazı bölümlerinin gözden geçirilmesi gerekecek. Canlı organizmaya uygulama en ilginç ve zorlu dur, çünkü canlı hayvanlarda doku veya organlarda biyokimyasal veya metabolik değişiklikler sağlayabilir. Bu başvuru Yamanashi Üniversitesi hayvan bakımı için kurumsal komite tarafından onaylanırken, 2013⁵yılında, hayvan deneyleri için düzenlemelerde yapılan son değişiklikler nedeniyle yeni bir onay turu daha gerekli olacaktır. Deneysel şemada çeşitli değişiklikler, bu nedenle, tavsiye edilir. Deneylerde elde edilen kütle spektrumları ile ilgili olarak, her ölçüm arasındaki kütle spektrumlarının dalgalanmaları dikkate alınarak, nükleotit dizilimi topluluğu için ortak olan spektral bilgi paylaşım sistemi yoktur. Operatör iğne sapı kazalarını önlemek için iğneyi kollarınca, özellikle iğneyi iğne tutucudan çıkarırken dikkatli olunmalıdır. İğneyi ayırmak için özel bir cihaz bu amaç için çok yararlıdır. PESI modülünün bölmesi hava geçirmez, kapalı bir hazne olduğundan, kütle spektrometresi talimatlara göre çalıştırılırsa iyon tüyü sızıntısı oluşmaz.

Protokol

Yamanashi Üniversitesi hayvan bakımı için kurumsal komite tüm protokolleri ve deneysel hayvanların kullanımını burada belirtilen onayladı. İnsan örneği kullanımı Yamanashi Üniversitesi kurumsal etik kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Katı doku hazırlığı

NOT: Doku tazeliğini korumak için numuneler hayvandan veya insan vücudundan çıkarıldıktan sonra buz üzerinde tutulmalıdır. Ölçümler diseksiyonu hemen takip etmiyorsa, -80 °C'de doku ların depolanmaları önerilir. Onlar doku bazı içeriğini ayıklamak olabilir, çünkü tampon veya tuzlu herhangi bir tür doku yerleştirmek için tavsiye edilmez. Aldehitlerle sabitlenmiş veya parafin/balmumu veya kriyogel içine gömülü doku MS ölçümleri için uygun değildir.

1. Doku örneğini neşter veya bıçak kullanarak yaklaşık 2 x 2 x 2 mm'ye kesin. Alternatif olarak, deri muayenesi için kullanılan bir trepan (tek kullanımlık biyopsi yumruğu, delik boyutu 3 mm) ile numune dışarı yumruk. Bu durumda, sütunun uzunluğunu 2 mm'ye kadar kırpın.
   NOT: Herhangi bir doku bu yöntem kullanılarak analiz edilebilir. Bu deneyde, karaciğer¹⁵ ve böbrek¹⁹, başarıyla kütle spektrumları elde etmek için analiz edilmiştir. Genellikle, parankimal organlar iyi kütle spektrumları vermek, lifli bileşenleri olanlar yok iken.
2. Doku kan ile kontamine ise, buz gibi fosfat tamponlu tuzlu ile kısa bir süre yıkayın.
   NOT: Postmortem doku hasarını en aza indirmek için, bu adımı en kısa sürede, oda sıcaklığında tamamlayın. Ölçümler hemen yapılmazsa, sıvı nitrojendeki dokuyu tutturun ve -80 °C'de saklayın.
3. Kesilmiş veya delilmiş numuneyi (yaklaşık 10 mg) plastik bir mikrotüp içine yerleştirin ve %50 etanol 100 μL ekleyin.
   NOT: Bu sistemde kullanılan kütle spektrometresi nicel veri sağlamadığından örneklerin tam ağırlığı belirlenmemiştir. Yaklaşık 10 mg parankimal doku için en uygun.
4. Bir mikroenjeksle kullanarak numuneyi homojenize edin.
5. Homojenin 10 μL'sini kartuşun kuyuya yerleştirin(Şekil 2).
6. Kartuşun kütle spektrometresinin iyonizasyon odasına yerleştirin ve numune iyonizasyonu için kullanılacak paslanmaz çelik iğne probu yerleştirin(Şekil 2).
   NOT: Prob iğneleri üretici tarafından temin edilir. Paslanmaz çelikten imal edilmiştir ve yaklaşık 400 nm'lik bir eğrilik yarıçapına sahiptir.
7. Güvenlik cihazını otomatik olarak etkinleştirmek için oda kapağını sıkıca kapatın.
8. Analiz etmek için Başlat simgesine tıklayarak yerleşik bilgisayarı başlatın. Ekran panellerini kullanarak, elektrosprey oluşturmak ve iğne frekansının 3 Hz olduğundan emin olmak için iğneye 2,3 kV'luk bir voltaj uygulayın.
9. Ölçümün tamamlanması için 30 s bekleyin.
   NOT: Veri toplama tamamlandığında oturum otomatik olarak durdurulur. Analizin kalitesi toplam iyon kromatogramı (TIC) ile izlenir. Ölçüm süresi temsili kütle spektrumları elde etmek için tanımlanır ve kısaltılabilir veya uzatılabilir.
10. Her numuneyi ölçtükten sonra kartuş ve iğneyi biyolojik tehlike verici bir bertaraf layıcıya atın.
    NOT: Aynı anda yalnızca bir örnek ölçülebilir. Her ölçümden önce makineyi kalibre etmek gerekli değildir; kalibrasyon, tedarikçinin altı ayda bir düzenli olarak check-up'ına bağlıdır.
11. Kütle spektrumlarını analiz edin ve kütle spektrometresi ile ilişkili yazılımı kullanarak kütle spektral metin verilerini dışa aktarın (bkz. Malzeme Tablosu)aşağıdaki adımlarda belirtildiği gibi(Şekil 3).
    1. Yazılımın veri dosyası tarayıcı penceresindeki lcd dosyaya tıklayın.
    2. Kitle spektrum penceresinde tek bir tepeye tıklayın ve otomatik olarak çıkarılan bir iyon kromatogramını (EIC) gösterin.
    3. TIC ve EIC'yi kontrol edin ve kütle spektrumu oluşturmak için zaman aralığı penceresini seçmek için ortalama spektrum simgesine tıklayın.
       NOT: Bu analizde hedef moleküller kütle-yük oranı(m/z) penceresinde görünürler (Şekil 3). Ayrıca, iğne hareketinin tek inme başına iyonizasyon süresi çok kısa olduğundan, elde edilen tüm kütle spektrumları aslında 10 s (300 taramaları) üzerinde spektrum ortalaması vardır.
    4. Daha fazla analiz için Dışa Aktarma sekmesine tıklayarak m/z ve iyon yoğunluğu içeren bir metin dosyası oluşturun. Bu metin dosyası herhangi bir klasörde saklanabilir.
       NOT: Herhangi bir RNA koruyucu numunelerin yerli spektral modelini etkileyecektir. Buna ek olarak, depolama sırasında sıvı içine doku moleküler bileşenlerin elümesini önlemek için herhangi bir sıvı (fosfat-tamponlu tuzlu gibi) olmadan doku işlemek ve depolamak için tavsiye edilir. İdeal olarak, herhangi bir tedavi olmadan taze veya taze dondurulmuş numuneler kullanılır.

2. Vücut sıvıları (serum) hazırlanması

NOT: Tüm bu prosedür katı doku için kullanılan hemen hemen aynıdır. Sıvı numunesi için kartuş üreticiden temin edilebilir. Kırmızı kan hücreleri (RBC) tarafından kontaminasyon büyük ölçüde amaçlanan bileşenin spektral edinimi verimliliğini azaltabilir çünkü (plazma veya serum), ölçümlerden önce santrifüj ederek tüm RBC'leri ortadan kaldırmak için emin olun.

1. Serum örneğinin 10 μL'sini alın ve 1,5 mL'lik bir mikrotüp içine koyun.
   NOT: Hem taze hem de depolanmış serum kullanılabilir.
2. 1.5 mL tüpe %50 etanol 190 μL ekleyin, ardından oda sıcaklığında 2 dakika girdap.
3. Sıvıyı 15.000 x g'de 1-5 dk 4 °C'de santrifüj edin.
4. 10 μL'lik supernatant'ı kartuşun kuyusu içine aktarın.
5. Kartuşun iyonizasyon odasına yerleştirin ve numune iyonizasyonu için kullanılacak paslanmaz çelik iğne probu kurun(Şekil 2).
6. Güvenlik cihazını otomatik olarak etkinleştirmek için oda kapağını sıkıca kapatın.
7. Iyonize etmek için Başlat simgesine tıklayarak yerleşik bilgisayarı başlatın.
8. Ölçümler yapıldıktan sonra numune kartuşunu ve iğneyi 1.10'da açıklandığı gibi atın.
9. Elde edilen AYM kümelerini aşağıda belirtildiği gibi analiz edin (Şekil 3).
   1. Veri tarayıcısındaki lcd dosyasını açın.
   2. TIC ve EIC'yi görüntülemek için tek bir tepeye tıklayın.
   3. Ortalama spektrum simgesini kullanarak kütle spektrumları oluşturmak için zaman aralığı penceresini seçin.
   4. Monitördeki dışa aktarma sekmesini tıklatarak, ilgili tepenin hem m/z hem de iyon yoğunluğunu içeren oluşturulan dosyayı dışa aktarın.
      NOT: Bu işlem tükürük, idrar ve diğer vücut sıvılarına da uygulanabilir.

3. Canlı organizmada in vivo PESI-MS hazırlığı

NOT: Bu bölümde yaşayan bir fare modelinde 5-Fluoro-2'-deoksiürinin (5-FdU) metabolik profilini izlemek için bir uygulama sunulmuştur. Boyunca aseptik koşulları kullanın.

1. 100 μL 100 mM 5-FdU çözeltisini 2 aylık bir farenin kuyruk damarına (yaklaşık 20 g ağırlık) aşılayın.
   NOT: Cinsiyet, yaş veya fare türü tercihi yoktur. Bu protokol deney iybesini gerçekleştirdiğimiz sırada onaylanırken⁵, bu deneyin fizibilitesi, yapılacak olan ülkenin etik kısıtlamalarına bağlıdır.
2. Onaylanan hayvan bakım protokolüaşağıdaki fare anestezi. Kuyruk kıstırma yanıt eksikliği ile anestezi derinliğini değerlendirin.
   NOT: Hayvan deneyleri için etik komite tarafından sodyum pentobarbital kullanımına izin verilmiyorsa, ketamin hidroklorür gibi alternatif yöntemler kullanılabilir.
3. Elektrikli bir jilet kullanarak karın boşluğu tıraş ve gözlere veteriner merhem uygulayın.
4. Anestezili fareyi bir supine pozisyonuna getirin ve pençeleri tamir bandı kullanarak plastik plakaya sabitleyin. Cerrahi bölgeyi üç kez %70 alkollü önlüklerle temizleyin.
5. Makasla karın boşluğunu kesin. İlk olarak, diyaframın hemen üstünden deriyi (10 mm) yanal olarak kesin. Yanal karın vücut duvarı ve periton kas kesmek (yaklaşık 7 mm) ve karaciğer yüzeyini ortaya çıkarmak için paslanmaz tel kullanarak yara açık tutun.
   NOT: Karaciğer yüzeyine nüfuz etmeye gerek yoktur.
6. Sonda iğnesinin ucunu karaciğer yüzeyine uygulayın. İyonizasyon verimliliğini optimize etmek için iğnenin derinliğini yaklaşık 0,5 mm derinliğe ayarlayın ve TIC ve spektral deseni aynı anda kontrol edin. Kontrol panelinin ekranında yüksek gerilimi 2,3 kV'a, frekansı 3 Hz'e ayarlayın.
7. Hayvanı plastik plakadan çıkarın.
8. Cerrahi bir bağırsak sütür kullanarak yara dikiş ve kafese fare dönün. Fareyi, sert bir şekilde recumbency korumak için bilinç kazandı kadar gözetimsiz bırakmayın. Fareyi tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine geri verme.
9. AYM'de iyon yoğunluğunun zaman seyrini ve AYM tasvirinin 1.11.1 ile 1.11.4 arasında olduğunu gösterin.

Sonuçlar

Şekil 3'tede belirtildiği gibi PESI-MS tekniği ile elde edilen veriler bu sistemde m/z aralığı 10 ile 1.200 arasında değişen kütle spektrumlarıdır. M/z 2.000'e kadar olan molekülleri tespit etmekle birlikte, m/z 1.200'ün kütle aralığında bu teknik kullanılarak elde edilen az sayıda zirve vardı. Bu nedenle, m/z 10'dan 1.200'e kadar olan zirveleri analiz ettik. M/z 800 ve 900 civarında dikkat ç...

Tartışmalar

PESI kütle spektrometresi için ESI bir türevi olmasına rağmen⁴, gerçek zamanlı metabolomik izleme için en avantajlı, yanı sıra herhangi bir karmaşık veya zaman alıcı ön işlemler gerçekleştirmeden biyokimyasal reaksiyonları analiz etmek için^5,14,15,17. Canlıorganizmaların entegre durumuna uygulanabilen kolay ve anlık kütle spektrometresi tekniğid...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020