הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Summary

מאמר זה מציג שיטות הכנה לדוגמה עבור שיטה אנליטית ייחודית בזמן אמת המבוססת על ספקטרומטר מסה סביבתי. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע ניתוח בזמן אמת של המולקולות הביולוגית בvivo ללא כל טיפול מיוחד.

Abstract

ספקטרומטר מסה (MS) הוא כלי רב עוצמה בכימיה אנליטית משום שהוא מספק מידע מדויק מאוד על מולקולות, כגון יחס מסה-לתשלום (m/z), אשר שימושיים להסיק משקולות ומבנים מולקולריים. בעוד שזוהי ביסודו שיטה אנליטית הרסנית, הפיתוחים האחרונים בטכניקת הסביבה הסביבתית אפשרו לנו לרכוש נתונים תוך השארת רקמות במצב שאינו שלם יחסית במונחים של יושרה. (PESI) הוא שיטה ישירה שנקראת כביכול, משום שהיא אינה דורשת טיפול מורכב וארוך-זמן של דגימות. מחט עדינה משמשת כבוחר לדוגמא, כמו גם פולט אינון. בהתבסס על המאפיין החריף והעדין של המכשיר, השמדת הדגימות היא מינימלית, המאפשרת לנו לרכוש מידע מולקולרי בזמן אמת מיצורים חיים באתרו. בזאת, אנו מציגים שלושה יישומים של טכניקת PESI-MS שיהיה שימושי עבור מחקר ופיתוח ביו-רפואי. אדם כרוך ביישום לרקמה מוצקה, שהיא היישום הבסיסי של טכניקה זו לאבחנה הרפואית. כמו טכניקה זו דורשת רק 10 מ"ג של המדגם, זה עשוי להיות מאוד שימושי הגדרות קליניות שגרתית. היישום השני הוא לאבחון רפואי מתורבת שבו סרום דם אנושי נמדד. היכולת למדוד דגימות נוזלים הוא גם בעל ערך בניסויים ביולוגיים שונים בהם נפח מספיק של מדגם עבור טכניקות אנליטיות קונבנציונאלי לא ניתן לספק. האפליקציה השלישית נשענת לעבר היישום הישיר של מחטי המחקר בבעלי חיים חיים, שם נוכל להשיג דינמיקה בזמן אמת של מטבוליטים או סמים באיברים ספציפיים. בכל יישום, אנו יכולים להסיק את המולקולות שזוהו על ידי MS או להשתמש באינטליגנציה מלאכותית כדי לקבל אבחנה רפואית.

Introduction

ספקטרומטר מסה (MS) הוא מימוש טכנולוגי של הרדונות; היא מקטינה את מטרת הניתוח ליחידה שניתן לפרש על בסיס מינים מולקולריים או מפלים. לכן, זוהי שיטה ייצוגית לכימיה אנליטית. הוא מורכב מארבעה תהליכים: אינון, ניתוח, גילוי ורכישה ספקטרלית. מכיוון שיינון של המולקולה הוא התהליך הראשון בספקטרומטר מסה, הוא בדרך כלל מגביל את צורת האנליטים שיעובדו. רוב ההליכים האינון דורשים השמדת מבנה, מורפולוגיה ותהליכים ביולוגיים בזמן אמת של דגימות אורגניות. לדוגמה, בתרסיס אלקטרונון (ESI) MS דורש כי הדגימות יהיו במצב נוזלי עבור אינון יעיל¹. לפיכך, יש לעבור דוגמאות להכנה ביוכימית מורכבת, המשנה את הרכב המולקולות. לחילופין, בעוד באמצעות מטריקס באמצעות לייזר באמצעות desorption (maldi) MS יכול לשחזר מפות מולקולריות דקה רקמות מנות^2,3, יעילות יינון שלה הוא נמוך מדי כדי לזהות את כל המולקולות בדגימות, והוא עני במיוחד בניתוח חומצות שומן. בהתחשב מגבלות אלה, בדיקת אלקטרונון בדיקה (PESI)⁴ ניתן להשתמש כדי להתבונן בזמן אמת שינויים במערכות ביולוגיות באתרו מבלי להרוס את השלמות המבנית⁵, בעוד האורגניזם הביולוגי להיות נצפתה הוא מבחינה טכנית במצב חי. מחט נאה מאוד משמשת במקרה זה, המשמש בו זמנית כבוחר לדוגמה ופולט יונים. משמעות הדבר היא כי המדגם מורכבים רצפים טרום טיפול ניתן עקף כדי לקבל ספקטרום מסה המשקפים את הרכיבים המולקולריים של מערכת החיים באתרו.

ישנן מספר שיטות אינון אחרות היריבות PESI-MS. האחד הוא מהיר הסלע אינון ספקטרומטר המסה (ריימס)⁶. טכניקה זו פועלת היטב במהלך הניתוח משום שהוא מורכב עם סכין חשמלי אוספת את הפלומה יון שנוצר במהלך החיתוך. בעוד ריימס הוא מאוד שימושי עבור הניתוח, זה ביסודו שיטה הרסנית הדורשת אבלציה חשמלי של הרקמה. לפיכך, היא אינה שימושית לניתוח מפורט של תאים ורקמות במדגם מוכן או בניתוחי מעבדה. יתר על כן, משום שהיא אוספת כמות גדולה של פלומה המכילה פסולת רקמות, זה דורש תחזוקה ממושכת של המכשירים לאחר כל שימוש, ובכך להגביל את השימוש במכונה זו הליכים כירורגיים מיוחדים. שיטה דומה, הנקראת לייזר הספקטרומטר המסה (LDI-MS)⁷, היא טכניקה נוספת שאינה פולשנית ושימושית עבור ניתוח פני השטח. מכיוון שטכניקה זו טובה בסריקת פני השטח של הדגימה, היא משיגה ניתוח דו מימדי כולל כגון הדמיה מלדית מיסה מאסיבית^8,9. עם זאת, מכיוון LDI-MS חל רק על ניתוח פני השטח, PESI-MS הוא יתרון עבור ניתוח דגימות למשל, בתוך הרקמה. טכניקה נוספת, מספרט עט¹⁰, דווחה כדי להשיג ספציפיות ורגישות באבחון סרטן בלוטת התריס, אבל קוטרו של החללית הוא בסדר mm והוא ספציפי עבור ניתוח פני השטח, כלומר זה לא יכול לזהות גושים קטנים של סרטן או נגעים מקומי עמוק. כמו-כן, מאחר ששיטה זו משתמשת בתעלת זרימה מיקרוקפילר המוטבעת בעט המקדח, הזיהום הצולב חייב להילקח בחשבון, בדומה ל-LDI-MS. טכניקות אחרות קיימות שהוחלו על הגדרות קליניות, כגון בדיקת זרימה וטופס יינון בספוגית¹¹, אבל הם לא נפוצים.

PESI הוא המזעור הקיצוני של ESI, שבו הנימים של הננו-electrospray ממיר על מחט מוצק עם עקמומיות טיפ רדיוס של כמה מאות ננומטר. אינון מתרחש באזור המוגבל ביותר של קצה המחט על ידי יצירת חרוט טיילור, על אילו דגימות להישאר עד אינון של כל הנוזלים על הקצה הוא השלים¹². אם האנליטה נשאר על קצה המחט מתכת, עודף מטען הוא שנוצר ברציפות בממשק בין מחט מתכת לבין האנליטים. לכן, אינון סדרתי של מולקולות מתרחשת בהתאם לפעילות המשטח שלהם. מאפיין זה הופך את המחט טיפ סוג של chromatogram, הפרדת האנליטים בהתאם לפעילות המשטח שלהם. יותר מבחינה טכנית, מולקולות עם פעילות המשטח חזקה לבוא אל פני השטח של החרוט טיילור והם מוהים מוקדם יותר מאשר אלה עם פעילות משטח חלש, אשר לדבוק פני השטח של המחט עד סוף תהליך יונן. כך, אינון מלאה של כל המולקולות שנאספו על ידי המחט מושגת¹³. יתר על כן, כי טכניקה זו אינה כרוכה בתוספת של הממס המיותר למדגם, כמה מאות של ליטרים של נשים מספיקות כדי לקבל ספקטרום מסה חזק מספיק לניתוח נוסף¹⁴. מאפיינים אלה הם יתרון לניתוח של דגימות ביולוגיות שלמות. עם זאת, החיסרון העיקרי של PESI-MS טמון הרציפות באינון בגלל התנועה המעברת של המחט לאורך הציר האנכי, דומה מכונת ניסור. היינון מתרחש רק כאשר קצה הגשוש מגיע לנקודה הגבוהה ביותר כאשר גובה פתח היונים מיושר על הציר האופקי. אינון מפסיק בזמן שהמחט מרימה דגימות, ולכן היציבות של אינון אינה שווה לזו ב-ESI המקובלת. לכן, PESI-MS אינה שיטה אידיאלית עבור פרוטאומניקס.

עד היום, PESI-MS הוחל בעיקר על ניתוח של מערכות ביולוגיות, כיסוי מגוון רחב של שדות ממחקר בסיסי הגדרות קליניות. לדוגמה, הניתוח הישיר של רקמת האדם שהוכנו במהלך הניתוח היה מסוגל לחשוף את הצטברות של triacylglycerol הן קרצינומה של תאי הכליה¹⁵ ו קרצינומה של הלוע הלבן¹⁶. שיטה זו יכולה גם למדוד דגימות נוזל, כגון דם, כדי להתמקד בפרופיל השומנים. לדוגמה, מולקולות מסוימות כללו במהלך שינויים תזונתיים בארנבים; זה דווח כי כמה מולקולות אלה ירדו בשלבים מוקדמים מאוד של הניסויים, המציין את רגישות גבוהה והתועלת של מערכת זו עבור אבחון קליני¹⁷. יתרה מזאת, בקשה ישירה לבעלי חיים חיה אפשרה גילוי של שינויים ביוכימיים של הכבד לאחר לילה אחד של צום⁵. Zaitsu et al.¹⁸ בקרה זה ניסוי⁵ וניתח את פרופילי חילוף החומרים של הכבד כמעט באותו האופן, עם תוצאות שחיזקו את היציבות והתוכעות של השיטה המקורית שלנו. יתר על כן, הצלחנו להפלות את רקמת סרטן מתוך הכבד שמסביב סרטניים בעכברים באמצעות טכניקה זו¹⁹. לכן, זוהי טכניקה מגוונת של ספקטרומטר המסה השימושית בקביעות שונות, הן בvivo והן במבחנה. מנקודת מבט אחרת, ניתן להכניס את מודול PESI להתאמת מספר גדול של ספקטרומטר מסה על-ידי התאמת הקובץ המצורף הגובר. במאמר קצר זה, אנו מציגים את היסודות ודוגמאות של יישומים (איור 1), כולל יישומים עם חיות חיים⁵.

על פי התקנות והחוקים בכל מדינה, יש לסדר חלקים מפרוטוקול זה כדי לעמוד בקריטריונים של כל מוסד. היישום לאורגניזם החי הוא המעניין והמאתגר ביותר משום שהוא יכול לספק שינויים ביוכימיים או מטבוליים ברקמות או באיברים בבעלי חיים באתרו. בעוד שיישום זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמאנאשי, בשנת 2013⁵, סיבוב נוסף של אישור יהיה כעת הכרחי בגלל השינויים האחרונים בתקנות עבור ניסויים בבעלי חיים. לכן, מספר שינויים במזימה הניסיונית, מומלץ. לגבי הספקטרום ההמוני שהושג בניסויים, לקיחת תנודות של ספקטרום מסה בין כל מדידה לחשבון, אין מערכת שיתוף מידע ספקטרלי כי הוא משותף הקהילה הרצף נוקלאוטיד. הטיפול חייב להילקח כאשר המפעיל מטפל במחט כדי למנוע תאונות מקל המחט, במיוחד בעת הסרת המחט ממחזיק המחט. מכשיר מיוחד לניתוק המחט הוא מאוד שימושי למטרה זו. מאחר שהתא של מודול PESI הוא תא אטום, סגור, דליפה של הפלומה יון לא מתרחש אם ספקטרומטר המסה מופעל על פי ההוראות.

Protocol

הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמאנאשי אישרה את כל הפרוטוקולים והשימוש בבעלי חיים ניסיוניים המובאים להלן. השימוש במדגם האנושי אושר על ידי מועצת האתיקה המוסדית באוניברסיטת יאמאנאשי.

1. הכנת רקמה מוצקה

הערה: יש לשמור את הדגימות על הקרח לאחר הסרתו מהחיה או מהגוף האנושי כדי לשמר את רעננות הרקמה. אם המדידות אינן מפנות מיד לאחר הניתוח, מומלץ לאחסן את הרקמה ב-80 ° c. זה לא מומלץ להניח את הרקמה בכל סוג של מאגר או תמיסת מלח, כי הם עשויים לחלץ תוכן מסוים מן הרקמה. רקמה שתוקנה עם אלהידס או מוטבע פרפין/שעווה או קריוג'ל אינו מתאים למדידות MS.

1. חותכים את דוגמית הרקמה כ 2 x 2 x 2 מ"מ באמצעות אזמל או סכין. לחילופין, להכות את המדגם עם trepan (אגרוף ביופסיה חד פעמיות, נשא בגודל 3 מ"מ) משמש לבדיקת העור. במקרה זה, קצץ את אורך העמודה ל-2 מ"מ.
   הערה: ניתן לנתח כל רקמה באמצעות שיטה זו. בניסוי זה, כבד¹⁵ וכליה¹⁹, נותחו בהצלחה כדי להשיג ספקטרום המוני. באופן כללי, איברים מסוימים מעניקים ספקטרום מסה טוב, בעוד אלה שיש להם רכיבים סיבי לא.
2. אם הרקמה מזוהמת בדם, יש לשטוף את העור בקצרה עם תמיסת מלח באגירה קרה.
   הערה: כדי למזער את הנזק לרקמות שלאחר המוות, השלימו שלב זה, בהקדם האפשרי, בטמפרטורת החדר. אם לא נעשים מדידות מיידית, הקפא את הרקמה בחנקן נוזלי והחנות ב-80 ° c.
3. מניחים את חתך או מנוקב החוצה מדגם (כ 10 מ"ג) לתוך מיקרוצינורית פלסטיק ולהוסיף 100 μL של 50% אתנול.
   הערה: המשקל המדויק של הדגימות אינו נקבע מכיוון שספקטרומטר המסה המשמש במערכת זו אינו מספק נתונים כמותיים. כ 10 מ"ג הוא אופטימלי עבור רקמת הכמצ'ראל.
4. הומוגון המדגם באמצעות מיקרופסל.
5. מקום 10 μL של המגון המאכלת לתוך הבאר של המחסנית (איור 2).
6. הניחו את המחסנית בחדר היינון של ספקטרומטר המסה והתקינו את המחט מפלדת אל-חלד שישמשו לדגימה (איור 2).
   הערה: מחטים בדיקה מסופקים על ידי היצרן. הם עשויים פלדה אל חלד יש עקמומיות רדיוס של כ 400 ננומטר.
7. סגור את מכסה החדר בחוזקה כדי להפעיל באופן אוטומטי את מכשיר הבטיחות.
8. הפעל את מחשב הלוח על-ידי לחיצה על סמל ההתחלה כדי לנתח. באמצעות הפאנלים על המסך, להחיל מתח של 2.3 kV אל המחט כדי לייצר את התרסיס אלקטרו ולהבטיח כי תדירות המחט היא 3 Hz.
9. המתן 30 עבור המדידה להסתיים.
   הערה: ההפעלה נפסקת באופן אוטומטי בעת השלמת רכישת הנתונים. איכות הניתוח מפוקחת על-ידי כרומטוגרם יונים כולל (TIC). זמן המדידה מוגדר להשגת ספקטרום המסה של הנציג וניתן לתקצר או להאריך אותו.
10. היפטר ממיכל הדיו והמחט בתוך הרגשנות לאחר מדידת כל מדגם.
    הערה: ניתן למדוד דגימה אחת בלבד בכל פעם. אין צורך לכייל את המכונה לפני כל מדידה; כיול תלוי בבדיקה הרגילה של הספק פעם בשישה חודשים.
11. לנתח את ספקטרום מסה ולייצא את נתוני הטקסט הספקטרלי ההמוני באמצעות התוכנה המשויכת ספקטרומטר המסה (ראה טבלת חומרים) כאמור בשלבים הבאים (איור 3).
    1. לחץ על קובץ ה- lcd בחלון דפדפן קובץ הנתונים של התוכנה.
    2. בחר ולחץ על הפסגה בודדת על החלון ספקטרום המסה לתאר באופן אוטומטי כרומטוגרם יון מחולץ (eic).
    3. בדוק את ה-TIC ו-EIC ולחץ על סמל הספקטרום הממוצע כדי לבחור בחלון טווח הזמן ליצירת הספקטרום ההמוני.
       הערה: בניתוח זה, מולקולות היעד מופיעות ביחס מסה-לתשלום (m/z) (איור 3). יתר על כן, כי משך הזמן של יינון לשבץ בודד של תנועת המחט הוא קצר מאוד, כל ספקטרום המסה המתקבל הם בעצם ספקטרום הממוצע מעל 10 s (300 סריקות).
    4. צור קובץ טקסט המכיל את עוצמת ה- m/z ואת העוצמה על-ידי לחיצה על לשונית הייצוא לניתוח נוסף. ניתן לאחסן קובץ טקסט זה בכל תיקיה.
       הערה: כל חומרים משמרים של RNA ישפיעו על תבנית ספקטרלית טבעית של דגימות. בנוסף, מומלץ לטפל ולאחסן רקמות ללא כל נוזל (כגון מלוחים באגירה מפוספז) כדי למנוע מהרקמת הרקמה המולקולרית לתוך הנוזל במהלך האחסון. באופן אידיאלי, טריים או טריים מוקפאים ללא כל טיפול משמשים.

2. הכנת נוזלי גוף (סרום)

הערה: כל הליך זה כמעט זהה לזה המשמש רקמה מוצקה. המחסנית עבור דגימת הנוזל זמינה מהיצרן. בגלל הזיהום על ידי כדוריות הדם האדומות (RBCs) יכול במידה ניכרת לצמצם את היעילות של רכישת ספקטרלי של המרכיב המיועד (פלזמה או סרום), הקפד לחסל את כל RBCs על ידי תפרידו לפני המידות.

1. לקחת 10 μL של דגימת הסרום ולשים אותו לתוך מיקרושפופרת 1.5 mL.
   הערה: ניתן להשתמש גם בסרום טרי ומאוחסן.
2. הוסף 190 μL של 50% אתנול לתוך שפופרת ה1.5 mL, ואז מערבולת עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
3. צנטריפוגה את הנוזל ב 15,000 x g עבור 1-5 דקות ב 4 ° c.
4. העבר 10 μL של סופרנטאנט לתוך הבאר של המחסנית.
5. מניחים את המחסנית בחדר יינון של המכונה ולהתקין את המחט מפלדת אל-חלד שישמשו עבור אינון לדוגמה (איור 2).
6. סגור את מכסה החדר בחוזקה כדי להפעיל באופן אוטומטי את מכשיר הבטיחות.
7. הפעל את מחשב הלוח על-ידי לחיצה על סמל ההתחלה כדי לחשב את המחשב.
8. מחק את המחסנית לדוגמה ואת המחט כפי שמתואר ב 1.10 פעם מדידות נלקחו.
9. לנתח את הסדרות המתקבלות של EIC כאמור להלן (איור 3).
   1. פתח את קובץ ה-lcd בדפדפן הנתונים.
   2. לחץ על שיא בודד כדי להציג את TIC ו-eic.
   3. בחר בחלון טווח הזמן ליצירת ספקטרום מסה באמצעות סמל הספקטרום הממוצע .
   4. יצא את הקובץ שנוצר המכיל הן את עוצמת ה- m/z והן את אינטנסיביות היונים של שיא מקביל על-ידי לחיצה על הכרטיסייה ' ייצוא ' שעל הצג.
      הערה: ניתן להחיל הליך זה על רוק, שתן ונוזלי גוף אחרים גם כן.

3. הכנה לvivo PESI-MS באורגניזם חי

הערה: בסעיף זה, יישום לניטור פרופיל מטבולית של 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) במודל עכבר חי הוא הציג. השתמש בתנאים אספטי ברחבי.

1. להחדיר 100 μL של 100 מ"מ 5-FdU פתרון לתוך וריד הזנב של עכבר בן 2 חודשים (כ 20 גרם משקל).
   הערה: אין העדפה למין, לגיל או למתח העכבר. למרות שפרוטוקול זה אושר בזמן שאנו ביצעו את הניסוי⁵, הכדאיות של ניסוי זה תלויה בהגבלות המוסריות של המדינה שבה היא תתבצע.
2. השלך את העכבר בעקבות הפרוטוקול המאושר שלך לטיפול בחיות. להעריך את עומק ההרדמה על ידי חוסר התגובה צובט הזנב.
   הערה: אם השימוש בנתרן פנטוברביטל אינו מותר על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים, ניתן להשתמש בשיטות חלופיות, כגון קטמין הידרוכלוריד.
3. לגלח את חלל הבטן באמצעות תער חשמלי ולהחיל משחה וטרינר לעיניים.
4. לשים את העכבר מורדם במצב פרקדן ולתקן את הכפות על צלחת הפלסטיק באמצעות קלטת תיקון. לקרצף את האתר כירורגי עם מדים של 70% אלכוהול שלוש פעמים.
5. לחתוך לפתוח את חלל הבטן באמצעות מספריים. ראשית, חותכים את העור מעבר לפני (10 מ"מ) מדיוק מעל הסרעפת. לחתוך את השריר של הקיר גוף הבטן ואת צפק (ca. 7 מ"מ) ולהחזיק את הפצע פתוח באמצעות חוט נירוסטה כדי לחשוף את משטח הכבד.
   הערה: אין צורך לשים את פני השטח של הכבד.
6. להחיל את קצה המחט בדיקה על פני השטח של הכבד. להתאים את עומק המחט כ 0.5 מ"מ עמוק כדי לייעל את היעילות יינון, בדיקת הדפוס TIC ו ספקטרלי בו זמנית. הגדר את המתח הגבוה ל-2.3 kV ולתדר של 3 Hz על המסך של לוח הבקרה.
7. . תסיר את החיה מלוחית הפלסטיק
8. תפר את הפצע באמצעות תפר כירורגי ולהחזיר את העכבר לכלוב. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה כדי לשמור על שכיבה משנית. אל תחזיר את העכבר לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש באופן מלא.
9. לבצע את קורס הזמן של עוצמת יון ב EIC ואת ההליך של תיאור EIC כמו 1.11.1 to 1.11.4.

תוצאות

כפי שתואר באיור 3, הנתונים המתקבלים מטכניקת PESI-MS הם הספקטרום ההמוני, שטווח ה- m/z שלו נע בין 10 ל-1,200 במערכת זו. בעוד אחד יכול לזהות מולקולות עד m/z 2,000, היו כמה פסגות שהתקבלו באמצעות טכניקה זו על הטווח ההמוני של m/z 1,200. לכן ניתחנו את הפסגות מ- m/z 10...

Discussion

למרות pesi הוא נגזרת של ESI עבור ספקטרומטר המסה⁴, זה היתרון ביותר עבור ניטור טבולומיקס בזמן אמת, כמו גם לניתוח התגובות הביוכימי מבלי לבצע כל הטיפולים מורכבים או הזמן לצרוך מראש^5,14,15,17. זוהי טכניקה פשוטה ומיידית ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020