プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析のためのサンプル調製

要約

この記事では、周囲質量分析に基づく独自のリアルタイム分析方法のサンプル調製方法を紹介します。この方法により、特別な前処理を行うことなく生体内の生体分子のリアルタイム分析を行うことができます。

要約

質量分析(MS)は、分子量や構造を推測するのに役立つ質量電荷比(m/z)など分子に関する非常に正確な情報を提供するため、分析化学において強力なツールです。それは本質的に破壊的な分析方法ですが、最近の周囲イオン化技術の進歩により、組織は完全性の面で比較的無傷の状態に置かれながらデータを取得することができました。プローブ電気スプレーイオン化(PESI)は、サンプルの複雑で時間のかかる前処理を必要としないため、いわゆる直接法です。細かい針は、サンプルピッカーだけでなく、イオン化エミッタとして機能します。プローブ先端の非常に鋭く微細な性質に基づいて、サンプルの破壊は最小限であり、その場で生き物からリアルタイムの分子情報を取得することができます。ここでは、生物医学の研究開発に役立つPESI-MS技術の3つの用途を紹介します。一つは、医学診断のためのこの技術の基本的なアプリケーションである固体組織への適用を含みます。この技術は、サンプルの10mgのみを必要とするので、ルーチン臨床設定において非常に有用であり得る。第二のアプリケーションは、人間の血清が測定される体外医療診断用です。また、従来の分析技術に十分な量のサンプルが提供できない様々な生物学的実験においても、流体試料を測定する能力は重要である。第3のアプリケーションは、特定の器官における代謝産物または薬物のリアルタイムダイナミクスを得ることができる生きている動物におけるプローブ針の直接適用に傾いている。各アプリケーションでは、MSによって検出された分子を推測したり、人工知能を使用して医学的診断を得ることができます。

概要

質量分析法(MS)は、還元主義の技術的実現である。これは、分子種やカスケードに基づいて解釈することができる単位に分析の対象を減少させます。従って、分析化学の代表的な方法である。イオン化、解析、検出、スペクトル集録の4つのプロセスで構成されています。分子のイオン化は質量分析の最初のプロセスであるため、一般的に処理される検体の形態を制限する。ほとんどのイオン化手順では、有機サンプルの構造、形態、およびリアルタイムの生物学的プロセスの破壊が必要です。例えば、エレクトロスプレーイオン化(ESI)MSは、サンプルが効率的なイオン化のために液体状態にあることを必要とする^1。したがって、サンプルは、分子の組成を変化させる複雑な生化学的調製物を通過する必要があります。あるいは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)MSは薄い切片組織^2,3の分子マップを再構築できるが、そのイオン化効率が低すぎてサンプル中のすべての分子を検出できない、特に脂肪酸の分析が不十分である。これらの制限を考慮すると、プローブエレクトロスプレーイオン化(PESI)4は、構造完全性⁵を破壊することなく、その生体系のリアルタイム変化を観察するために使用することができるが、観察されている生物は技術的に生きている状態にある。この場合、非常に細かい針が使用され、サンプルピッカーとイオンエミッタとして同時に機能します。これは、複雑なサンプル前処理配列をバイパスして、リビングシステムの分子成分をその場で反射する質量スペクトルを得ることができることを意味します。

PESI-MSに匹敵する他のいくつかの電イオン化方法があります。1つは急速な蒸発イオン化質量分析(REIMS)6です^。この技術は、電気ナイフで組み立てられ、切開中に発生するイオンプルームを収集するため、手術中にうまく機能します。REIMSは手術に非常に有用であるが、それは本質的に組織の電気的なアブレーションを必要とする破壊的な方法である。したがって、分離サンプルまたは実験室での分析において、細胞および組織の詳細な分析には有用ではありません。さらに、組織の破片を含むプルームを大量に収集するため、使用後の装置のメンテナンスが長く必要となり、この機械の使用を特別な手術に限定します。同様の方法は、レーザー脱離イオン質量分析(LDI-MS)7と呼ばれ、非侵襲的で表面分析に有用なもう1つの技術である。この技術は試料の表面をスキャンするのが得意なので、MALDIイメージング質量分析^8、9のような包括的な2次元解析を実現します。しかし、LDI-MSは表面分析にのみ適用可能であるため、PESI-MSは、例えば、組織内のサンプルを分析する上で有利である。もう一つの技術であるMasSpec Pen¹⁰は、甲状腺癌の診断において高い特異性および感受性を達成すると報告されたが、プローブの直径はmmのオーダーであり、表面分析に特異的であり、癌の小さな結節または深く局在化した病変を検出できないことを意味する。さらに、この方法はプローブペンに埋め込まれたマイクロキャピラリー流路を使用するので、LDI-MSと同様にクロスコンタミネーションを考慮する必要があります。他にも、フロープローブやイオン化形態スワブ¹¹などの臨床現場に適用された技術が存在するが、それらは広く普及していない。

PESIはESIの極端な微細化であり、ナノエレクトロスプレーの毛細管は数百nmの先端湾曲半径を有する固体針上に収束する。イオン化は、テーラーコーンを形成することにより針先の極めて制限された領域で起こり、その上で試料は先端上のすべての流体のイオン化が完了するまで¹²に留まる。検体が金属針の先端にとどまっている場合、金属針と検体の間の界面で過剰な電荷が連続的に発生する。そのため、分子の逐次イオン化は、その表面活性に応じて生じる。このプロパティは、針先をクロマトグラムの一種にし、表面の活性に応じて検体を分離します。より技術的には、より強い表面活性を有する分子は、テイラーコーンの表面に来て、イオン化プロセスの終わりまで針の表面に付着する弱い表面活性を有するものよりも早くイオン化される。これにより、針によって拾われたすべての分子の完全なイオン化が達成される^13。また、この技術は、試料に余分な溶媒を添加することを伴わないので、数百個のフェムトリットルは、さらに分析¹⁴のために十分な強さの質量スペクトルを得るのに十分である。これらの特性は、無傷の生物学的試料の分析に有利である。しかし、PESI-MSの大きな欠点は、ソーイングマシンと同様に、垂直軸に沿った針の往復運動のためにイオン化の不連続性にある。イオン化は、イオンオリフィスの高さが横軸上に揃っているときにプローブの先端が最も高い点に達した場合にのみ起こる。針がサンプルを拾っている間イオン化は止まるので、イオン化の安定性は従来のESIと等しくない。したがって、PESI-MSはプロテオミクスにとって理想的な方法ではありません。

これまで、PESI-MSは主に生体システムの分析に応用されており、基礎研究から臨床現場まで幅広い分野をカバーしています。例えば、手術中に調製されたヒト組織の直接分析により、腎細胞癌¹⁵および咽頭扁平上皮癌¹⁶の両方におけるトリアシルグリセロールの蓄積を明らかにすることができた。この方法はまた、血液などの液体試料を測定し、脂質プロファイルに焦点を当てることができる。例えば、いくつかの分子は、ウサギの食事の変化の間に線引きされています。これらの分子の一部は実験の非常に初期段階で減少し、臨床診断のためのこのシステムの高感度および有用性を示す^17.さらに、生きている動物への直接適用は、断食⁵のちょうど一晩後に肝臓の生化学的変化の検出を可能にした。Zaitsu et al.¹⁸は、この実験⁵を再検討し、ほぼ同じ方法で肝臓の代謝プロファイルを分析し、その結果、当社の元の方法の安定性と再現性を強化した。さらに、この技術¹⁹を用いてマウスの非癌性肝を取り囲む癌組織を判別することができた。従って、これは、生体内とインビトロの両方の様々な設定で有用である汎用性の高い質量分析技術である。別の観点から、PESIモジュールは、取り付けアタッチメントを調整することによって、様々な質量分析計に適合させることができます。この短い記事では、生きている動物を使ったアプリケーションを含むアプリケーションの基礎と例 (図 1)を紹介します^。

各国の規制や法律に従って、このプロトコルの一部は、各機関の基準を満たす必要があります。生物への応用は、生きている動物の組織や器官の生化学的または代謝的変化をその場所で提供することができるため、最も興味深く、困難です。この申請は山梨大学の動物ケア機関委員会によって承認されましたが、2013^年5月には、動物実験の規制の最近の変更により、もう一度承認が必要になります。実験計画の幾つかの修正が推奨される。実験で得られた質量スペクトルに関しては、各測定間の質量スペクトルの変動を考慮して、ヌクレオチドシーケンシングコミュニティに共通するスペクトル情報共有システムはありません。特に針ホルダーから針を取り外す場合は、針の事故を避けるために、オペレータが針を取り扱う際には注意が必要です。針を取り外す特別な装置は、この目的のために非常に有用である。PESIモジュールのコンパートメントは気密、閉室、質量分析計が指示に従って作動した場合にイオンプルームの漏れは発生しない。

プロトコル

山梨大学の動物ケア機関委員会は、ここに記載されているすべてのプロトコルと実験動物の使用を承認しました。人間のサンプル使用法は、山梨大学の倫理委員会によって承認されました。

1. 固形組織製剤

注:サンプルは、組織の鮮度を維持するために、動物や人体から取り出した後、氷の上に保管する必要があります。測定が解剖にすぐに続かない場合は、-80°Cで組織を保存することをお勧めします。彼らは組織から特定の内容物を抽出する可能性があるため、任意の種類のバッファーまたは生理液に組織を配置することはお勧めできません。アルデヒドで固定された組織、またはパラフィン/ワックスまたはクライオゲルに埋め込まれた組織は、MS測定には適していません。

1. メスまたはナイフを使用して、組織標本を約2 x 2 x 2mmに切ります。あるいは、皮膚検査に使用するトレパン(使い捨ての生検パンチ、ボアサイズ3mm)でサンプルをパンチアウトします。この場合、柱の長さを 2 mm にトリムします。
   注:この方法を使用して、任意の組織を分析することができます。この実験では、肝臓¹⁵及び腎臓¹⁹が、質量スペクトルを得るために解析に成功した。一般的に、パレンキマル器官は良好な質量スペクトルを与えるが、繊維状成分を有するものはそうではない。
2. 組織が血液で汚染されている場合は、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で短時間洗浄してください。
   注:死後の組織損傷を最小限に抑えるには、できるだけ早く室温でこのステップを完了してください。測定が直ちに行われなかった場合は、液体窒素で組織を凍結し、-80°Cで保存します。
3. 切り取ったサンプル(約10mg)をプラスチック製のマイクロチューブに入れ、50%エタノールの100μLを加えます。
   注: このシステムで使用される質量分析では定量的なデータが提供されないため、サンプルの正確な重量は決定されません。約10mgは、パレンキマル組織に最適です。
4. マイクロペストルを使用してサンプルを均質化します。
5. ホモジネートを10 μL入れ、カートリッジのウェルに入れる(図2)。
6. カートリッジを質量分析計のイオン化チャンバに入れ、サンプルイオン化に使用するステンレス製のニードルプローブを取り付けます(図2)。
   メモ:プローブ針は製造元から供給されています。それらはステンレス鋼から成り、およそ400 nmの曲率半径を有する。
7. チャンバーのふたをしっかりと閉じて、安全装置を自動的にアクティブにします。
8. [開始]アイコンをクリックしてオンボードコンピュータを起動し、分析します。画面上のパネルを使用して、2.3 kVの電圧を針に印加してエレクトロスプレーを発生させ、針の周波数が3Hzであることを確認します。
9. 測定が完了するまで 30 s 待ちます。
   注: データ取得が完了すると、セッションは自動的に停止します。分析の質は総イオンクロマトグラム(TIC)によって監視される。測定時間は代表的な質量スペクトルを得るために定義され、短縮または延長することができる。
10. 各サンプルを測定した後、バイオハザードの処分器にカートリッジと針を処分します。
    注: 一度に測定できるサンプルは 1 つだけです。すべての測定の前に機械を校正する必要はありません。校正は、6ヶ月に1回、サプライヤーによる定期的な検診に依存します。
11. 質量スペクトルを分析し、以下の手順に示すように質量分析計に関連付けられたソフトウェアを使用してマススペクトルテキストデータをエクスポートします(図3)。
    1. ソフトウェアのデータファイルブラウザウィンドウでLCDファイルをクリックします。
    2. マススペクトルウィンドウ上の単一のピークを選択してクリックすると、抽出されたイオンクロマトグラム(EIC)が自動的に表示されます。
    3. TIC と EIC を確認し、平均スペクトル アイコンをクリックして、マススペクトルを生成するための時間範囲ウィンドウを選択します。
       注: この解析では、ターゲット分子が質量電荷比 (m/z) ウィンドウに表示されます (図 3)。さらに、針の動きの1ストローク当たりのイオン化の持続時間は非常に短いため、得られるすべての質量スペクトルは、本質的に10s(300スキャン)にわたってスペクトルを平均化する。
    4. さらに詳しい分析を行う場合は、[エクスポート]タブをクリックして、m/zおよびイオン強度を含むテキスト ファイルを生成します。このテキスト ファイルは、任意のフォルダーに格納できます。
       注: RNA 防腐剤は、サンプルのネイティブスペクトルパターンに影響を与えます。さらに、液体(リン酸緩衝生理食塩)を使用せずに組織を取り扱い、保存することで、貯蔵中に組織から液体に分子成分が溶出するのを防ぐことをお勧めします。理想的には、何の処置もせずに新鮮または新鮮な凍結したサンプルが使用される。

2. 体液(血清)製剤

注:この手順全体は、固形組織に使用される手順とほぼ同じです。流体サンプル用のカートリッジは、製造元から入手できます。赤血球(RBC)による汚染は、目的成分(血漿または血清)のスペクトル取得の効率を大幅に低下させることができるので、測定前に遠心分離してすべてのRBCを除去してください。

1. 血清サンプルを10μLとし、1.5mLマイクロチューブに入れます。
   注:新鮮な血清および貯蔵された血清の両方が使用することができる。
2. 1.5 mLのチューブに190μLの50%エタノールを加え、室温で2分間ボルテックスを加えます。
3. 4 °Cで1~5分間、15,000 x gで液体を遠心分離します。
4. 10 μLの上清をカートリッジのウェルに移します。
5. カートリッジを機械のイオン化チャンバに入れ、サンプルイオン化に使用するステンレス製の針プローブを取り付けます(図2)。
6. チャンバーのふたをしっかりと閉じて、安全装置を自動的にアクティブにします。
7. [開始]アイコンをクリックしてオンボードコンピュータを起動し、イオン化します。
8. 測定が完了したら、1.10に記載されているサンプルカートリッジと針を捨てます。
9. 下記に示すように、得られたEICのセットを分析します(図3)。
   1. データブラウザでLCDファイルを開きます。
   2. 単一のピークをクリックして TIC と EIC を表示します。
   3. 平均スペクトルアイコンを使用して、質量スペクトルを生成するための時間範囲を選択します。
   4. モニタのエクスポートタブをクリックして、対応するピークのm/zとイオンの強度の両方を含む生成されたファイルをエクスポートします。
      注:この手順は、唾液、尿、および他の体液にも適用することができます。

3. 生体内におけるペシ-MSの準備

注:このセクションでは、生きているマウスモデルで5-Fluoro-2'-デオキシウリジン(5-FdU)の代謝プロファイルを監視するアプリケーションが導入されています。全体を通して無菌状態を使用してください。

1. 100 mM 5-FdU溶液の100 μLを2ヶ月齢マウスの尾静脈(約20g重量)に注入します。
   注:性別、年齢、マウスの歪みのための好みはありません。このプロトコルは実験⁵を実施した時点で承認されましたが、この実験の実現可能性は、それが行われる国の倫理的制限に依存します。
2. 承認された動物ケアプロトコルに従ってマウスを麻酔します。尾のピンチに対する応答の欠如によって麻酔の深さを評価する。
   注:ペントバルビタールナトリウムの使用が動物実験のための倫理委員会によって許可されていない場合、ケタミン塩酸塩などの代替方法を使用することができます。
3. 電気カミソリを使用して腹腔を剃り、目に獣医軟膏を適用します。
4. 麻酔マウスを上向きの位置に置き、修理テープを使用して足をプラスチックプレートに固定します。70%アルコールのスクラブで手術部位を3回スクラブします。
5. はさみを使って腹腔を切り開きます。まず、横隔膜の上から横(10mm)の皮膚を切ります。腹膜と腹膜(ca. 7 mm)の筋肉を横に切断し、肝臓表面を露出させるためにステンレス線を使用して創傷を開いたままにします。
   注:肝臓の表面を浸透する必要はありません。
6. プローブ針の先端を肝臓の表面に塗布します。針の深さを約0.5mmに調整してイオン化効率を最適化し、TICとスペクトルパターンを同時にチェックします。コントロールパネルの画面で高電圧を2.3kV、周波数を3Hzに設定します。
7. プラスチック製のプレートから動物を取り出します。
8. 外科的な腸の縫合糸を使用して創傷を縫合し、マウスをケージに戻す。それは胸骨の回復を維持するために意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。マウスが完全に回復するまで、他の動物の会社にマウスを返さない。
9. EIC におけるイオン強度の時間経過と、EIC 描写の手順を1.11.1~1.11.4のように実行します。

結果

図3に示すように、PESI-MS法で得られるデータは質量スペクトルであり、このシステムではm/zの範囲は10から1,200です。m/z 2,000までの分子を検出できますが、m/z 1,200の質量範囲にわたってこの技術を使用して得られるピークはほとんどありませんでした。そこで、m/z 10~1,200のピークを分析しました。m/z 800 と 900 の周...

ディスカッション

PESIは質量分析⁴のESIの誘導体であるが、リアルタイムメタボロミクスをモニタリングする場合、ならびに複雑または時間のかかる前処理を行わずに生化学的反応を分析する場合に最も有利である^{5、14、15、17。}生物の統合状態に適用できる、簡単で瞬時の質量分析技術です。サン?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020