Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Резюме

В этой статье представлены методы подготовки образцов для уникального аналитического метода в реальном времени, основанного на спектрометрии окружающей среды. Этот метод позволяет нам выполнять в режиме реального времени анализ биологических молекул in vivo без каких-либо специальных предварительных процедур.

Аннотация

Масс-спектрометрия (МС) является мощным инструментом в аналитической химии, поскольку она предоставляет очень точную информацию о молекулах, таких как соотношение массы к заряду(м/з),которые полезны для вывода молекулярных весов и структур. Хотя это по существу разрушительный аналитический метод, последние достижения в технологии ионизации окружающей среды позволили нам получить данные, оставляя ткани в относительно нетронутом состоянии с точки зрения целостности. Ионизация электроспрея зонда (PESI) является так называемым прямым методом, поскольку он не требует сложной и трудоемкой предварительной обработки образцов. Тонкая игла служит сборщиком образцов, а также ионизующим излучателем. Основываясь на очень резком и тонком свойстве наконечника зонда, уничтожение образцов является минимальным, что позволяет нам приобретать молекулярную информацию в реальном времени из живых существ на месте. В этом виде мы представляем три применения метода PESI-MS, которые будут полезны для биомедицинских исследований и разработок. Один включает в себя применение к твердой ткани, которая является основным применением этой техники для медицинской диагностики. Поскольку этот метод требует только 10 мг образца, он может быть очень полезным в обычных клинических условиях. Второе применение для медицинской диагностики in vitro, где измеряется сыворотка крови человека. Способность измерять образцы жидкости также имеет значение в различных биологических экспериментах, где не может быть обеспечендостаточный объем выборки для обычных аналитических методов. Третье применение склоняется к прямому применению зондовых игл у живых животных, где мы можем получить динамику метаболитов или наркотиков в конкретных органах в режиме реального времени. В каждом приложении, мы можем сделать вывод молекул, которые были обнаружены MS или использовать искусственный интеллект для получения медицинского диагноза.

Введение

Масс-спектрометрия (МС) - это технологическая реализация редукционизма; он сводит объект анализа к единице, которая может быть интерпретирована на основе молекулярных видов или каскадов. Поэтому это представительный метод аналитической химии. Он состоит из четырех процессов: ионизация, анализ, обнаружение и спектральное приобретение. Поскольку ионизация молекулы является первым процессом в масс-спектрометрии, она обычно ограничивает форму анализа, которые должны быть обработаны. Большинство процедур ионизации требуют разрушения структуры, морфологии и биологических процессов органических образцов в режиме реального времени. Например, ионизация электроспрея (ESI) MS требует, чтобы образцы были в жидком состоянии для эффективной ионизации^1. Образцы, следовательно, должны пройти через сложный биохимический препарат, который изменяет состав молекул. Кроме того, в то время как матричная лазерная ионизация лазера (MALDI) MS может реконструировать молекулярные карты тонкой секционной ткани^2,3,ее эффективность ионизации слишком низка, чтобы обнаружить все молекулы в образцах, и это особенно плохо при анализе жирных кислот. Учитывая эти ограничения, зонд электроспреп ионизации (PESI)⁴ может быть использован для наблюдения в режиме реального времени изменения в биологических системах на месте, не разрушая структурную целостность⁵, в то время как биологический организм наблюдается технически в живом состоянии. В этом случае используется очень тонкая игла, которая одновременно служит сборщиком образцов и ионного излучателя. Это означает, что сложные последовательности предварительной обработки образцов могут быть обойдёны для получения масс-спектров, отражающих молекулярные компоненты живой системы на месте.

Есть несколько других методов ионизации, которые соперничают PESI-MS. Одним из них является быстрая испаряемый ионизации масс-спектрометрии (REIMS)⁶. Этот метод хорошо работает во время операции, потому что он собран с электрическим ножом и собирает ионный шлейф, генерируемый во время разреза. Хотя REIMS очень полезен для операции, это по существу разрушительный метод, который требует электрической абляции тканей. Поэтому он не полезен для детального анализа клеток и тканей в подготовительном образце или в лабораторных анализах. Кроме того, поскольку он собирает большое количество шлейфа, содержащего тканевый мусор, он требует длительного обслуживания устройств после каждого использования, тем самым ограничивая использование этой машины специальными хирургическими процедурами. Аналогичный метод, называемый лазерной ионизации ионизации масс-спектрометрии (LDI-MS)⁷, является еще одним методом, который является неинвазивным и полезным для анализа поверхности. Поскольку этот метод хорош в сканировании поверхности образца, он достигает всеобъемлющего двумерного анализа, как MALDI изображений масс-спектрометрии^8,9. Однако, поскольку LDI-MS применим только к анализу поверхности, PESI-MS является выгодным для анализа образцов, например, в ткани. Другой метод, MasSpec Pen¹⁰, было сообщено для достижения высокой специфичности и чувствительности в диагностике рака щитовидной железы, но диаметр зонда находится в порядке мм и он специфичен для анализа поверхности, а это означает, что он не может обнаружить небольшие узелки рака или глубоко локализованных поражений. Кроме того, поскольку этот метод использует микрокапиллярный канал потока, встроенный в перо зонда, необходимо принимать во внимание перекрестное загрязнение, аналогичное LDI-MS. Существуют и другие методы, которые были применены в клинических условиях, таких как поток зонда и ионизации форме тампон¹¹, но они не являются широко распространенными.

PESI является крайней миниатюризации ESI, в котором капилляр нано-электроспреп сходится на твердой игле с наконечником кривизны радиусом в несколько сотен нм. Ионизация происходит в крайне ограниченной области кончика иглы путем формирования конуса Тейлор, на котором образцы остаются до ионизации всей жидкости на кончике^{завершена 12}. Если аналитик остается на кончике металлической иглы, избыточный заряд непрерывно генерируется на интерфейсе между металлической иглой и аналитиками. Поэтому последовательная ионизация молекул происходит в зависимости от их поверхностной активности. Это свойство делает кончик иглы своего рода хроматограммой, разделяющей аналиты в зависимости от их поверхностной активности. Более технически, молекулы с более сильной поверхностной активностью приходят к поверхности конуса Taylor и ионизируется более раньше чем те с более слабой деятельностью поверхности, которые придерживаются к поверхности иглы до конца процесса ионизации. Таким образом, полная ионизация всех молекул, подобранных иглой, достигается^13. Более того, поскольку эта методика не предполагает добавления в образец лишнего растворителя, нескольких сотен фемтолитров достаточно, чтобы получить массу спектра достаточно прочной для дальнейшего анализа^14. Эти свойства выгодны для анализа нетронутых биологических образцов. Однако основным недостатком PESI-MS является разрыв в ионизации из-за взаимного движения иглы по вертикальной оси, похожей на распиловочная машина. Ионизация происходит только тогда, когда кончик зонда достигает высшей точки, когда высота ионного илиа выравнивается по горизонтальной оси. Ионизация прекращается, в то время как игла берет образцы, и поэтому стабильность ионизации не равна той, что в обычных ESI. Таким образом, PESI-MS не является идеальным методом для протеомики.

На сегодняшний день PESI-MS применяется главным образом к анализу биологических систем, охватывающих широкий спектр областей от фундаментальных исследований до клинических условий. Например, прямой анализ тканей человека, подготовленный во время операции, смог выявить накопление триацилглицерола как в почечно-клеточной карциномы^15, так и в фарингеальной плоской карциномы^16. Этот метод может также измерить жидкие образцы, такие как кровь, чтобы сосредоточиться на липидном профиле. Например, некоторые молекулы были очертаны во время диетических изменений у кроликов; было сообщено, что некоторые из этих молекул уменьшилась на очень ранних стадиях экспериментов, что свидетельствует о высокой чувствительности и полезности этой системы для клинической диагностики¹⁷. Кроме того, прямое применение к живому животному позволило обнаружить биохимические изменения печени после всего лишь одной ночи поста^5. Зайцу и др.¹⁸ вновь этот эксперимент⁵ и проанализировали метаболические профили печени почти таким же образом, с результатами, которые укрепили стабильность и воспроизводимость нашего первоначального метода. Кроме того, мы смогли различать ткани рака от окружающих нераковых печени у мышей с помощью этой^{техники 19}. Таким образом, это универсальный метод масс-спектрометрии, который полезен в различных условиях, как in vivo, так и in vitro. С другой стороны, модуль PESI может быть выполнен в соответствии с различными масс-спектрометрами, регулируя крепление. В этой короткой статье мы представляем основы и примеры приложений(рисунок 1), включая приложения с живыми животными⁵.

В соответствии с положениями и законами каждой страны некоторые части этого протокола должны быть пересмотрены в соответствии с критериями каждого учреждения. Применение к живому организму является наиболее интересным и сложным, поскольку оно может обеспечить биохимические или метаболические изменения в тканях или органах у живых животных на месте. Хотя эта заявка была одобрена институциональным комитетом по уходу за животными в Университете Яманаси, в 2013 году⁵, еще один раунд утверждения теперь будет необходимо из-за недавних изменений в правилах для экспериментов на животных. Поэтому целесообразно внести несколько изменений в экспериментальную схему. Что касается масс-спектров, полученных в ходе экспериментов, учитывая колебания масс-спектров между каждым измерением, то не существует системы спектрального обмена информацией, которая характерна для сообщества секвенирования нуклеотидов. Необходимо проявлять осторожность, когда оператор обрабатывает иглу, чтобы избежать несчастных случаев иглы, особенно при удалении иглы из держателя иглы. Специальное устройство для отсоединения иглы очень полезно для этой цели. Поскольку отсек модуля PESI представляет собой герметичную, закрытую камеру, утечка ионного шлейфа не происходит, если масс-спектрометр работает в соответствии с инструкциями.

протокол

Институциональный комитет по уходу за животными при Университете Яманаси утвердил все протоколы и использование экспериментальных животных, изложенных в настоящем. Использование образцов человека было одобрено институциональным советом по этике при Университете Яманаси.

1. Подготовка твердой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны храниться на льду после их удаления из животного или человеческого тела, чтобы сохранить свежесть тканей. Если измерения не сразу следуют за вскрытием, рекомендуется хранить ткани при -80 градусов по Цельсию. Не рекомендуется размещать ткани в какой-либо буфер или солин, потому что они могут извлечь определенное содержимое из ткани. Ткань, которая была исправлена с альдегидами или встроенных в парафина / воска или криогеля не подходит для измерений MS.

1. Вырежьте образец ткани примерно до 2 х 2 х 2 мм с помощью скальпеля или ножа. Кроме того, выбить образец с трепан (одноразовый удар биопсии, отверстие размер 3 мм), используемых для исследования кожи. В этом случае уравновесите длину колонны до 2 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любая ткань может быть проанализирована с помощью этого метода. В этом эксперименте, печень¹⁵ и почки¹⁹, были успешно проанализированы для получения масс-спектров. Как правило, паренхимальные органы дают хорошие масс-спектры, в то время как те, которые имеют волокнистые компоненты нет.
2. Если ткань загрязнена кровью, кратко промойте ледяной фосфат-буферный солевой раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму посмертное повреждение тканей, завершить этот шаг, как можно скорее, при комнатной температуре. Если измерения проводятся не сразу, заморозьте ткань в жидком азоте и храните при температуре -80 градусов по Цельсию.
3. Поместите вырезанный или выбитый образец (примерно 10 мг) в пластиковую микротрубку и добавьте 100 кл. 50% этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точный вес образцов не определяется, поскольку масс-спектрометрия, используемая в этой системе, не дает количественных данных. Приблизительно 10 мг оптимально для паренхимальной ткани.
4. Гомогенизировать образец с помощью микропести.
5. Поместите 10 злител к скважине картриджа(рисунок 2).
6. Поместите картридж в ионизацию камеры масс-спектрометра и установите зонд из нержавеющей стали, который будет использоваться для ионизации образца(рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы зонда поставляются производителем. Они изготовлены из нержавеющей стали и имеют радиус кривизны около 400 нм.
7. Закройте крышку камеры твердо, чтобы автоматически активировать устройство безопасности.
8. Запустите бортовой компьютер, нажав значок Start для анализа. Используя экранные панели, нанесите напряжение 2,3 кВ на иглу для генерации электроспрея и убедитесь, что частота иглы составляет 3 Гц.
9. Подождите 30 с для измерения будет завершена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сеанс автоматически прекращается после завершения сбора данных. Качество анализа контролируется общей ионной хроматограммой (ТИК). Время измерения определяется для получения репрезентативной масс-спектра и может быть сокращено или продлено.
10. Утилизировать картридж и иглу в биоопасных утилизатор после измерения каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только один образец может быть измерен одновременно. Нет необходимости калибровки машины перед каждым измерением; калибровка зависит от регулярного осмотра поставщиком один раз в шесть месяцев.
11. Проанализируйте масс-спектры и экспортируйте данные масс-спектрального текста с помощью программного обеспечения, связанного с масс-спектрометром (см. Таблица Материалов), как указано в шагах ниже(рисунок 3).
    1. Нажмите на файл lcd в окне файла данных программного обеспечения.
    2. Выберите и нажмите на один пик на окне массового спектра и автоматически изобразить извлеченную ионную хроматограмму (EIC).
    3. Проверьте TIC и EIC и нажмите на значок среднего спектра, чтобы выбрать окно диапазона времени для генерации массового спектра.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе молекулы-мишени появляются в соотношении массы к заряду(м/з)окна(рисунок 3). Кроме того, поскольку продолжительность ионизации на один ход движения иглы очень коротка, все полученные масс-спектры по существу усредненные спектры свыше 10 с (300 сканирований).
    4. Создайте текстовый файл, содержащий интенсивность м/з и ион, нажав на вкладку Экспорт для дальнейшего анализа. Этот текстовый файл может храниться в любой папке.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Любые РНК консерванты будут влиять на родной спектральной модели образцов. Кроме того, рекомендуется обрабатывать и хранить ткани без какой-либо жидкости (например, фосфат-буферный солен), чтобы предотвратить выщелачивание молекулярных компонентов из ткани в жидкость во время хранения. В идеале используются свежие или свежие замороженные образцы без какой-либо обработки.

2. Препарат жидкости для тела (сыворотка)

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся эта процедура почти идентична той, которая используется для твердой ткани. Картридж для образца жидкости доступен у производителя. Поскольку загрязнение красными кровяными тельцами (РБК) может значительно снизить эффективность спектрального приобретения предполагаемого компонента (плазмы или сыворотки), не забудьте устранить все РБК путем центрифугинга перед измерениями.

1. Возьмите 10 л образца сыворотки и положите его в микротрубку объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать как свежую, так и хранимсую сыворотку.
2. Добавьте 190 л 50% этанола в трубку 1,5 мл, затем вихрь в течение 2 минут при комнатной температуре.
3. Центрифуги жидкости при 15000 х г в течение 1-5 мин при 4 градусах Цельсия.
4. Передача 10 зликат супернатанта в колодец картриджа.
5. Поместите картридж в камеру ионизации машины и установите зонд иглы из нержавеющей стали, который будет использоваться для ионизации образца(рисунок 2).
6. Закройте крышку камеры твердо, чтобы автоматически активировать устройство безопасности.
7. Запустите бортовой компьютер, нажав значок Start, чтобы ионизировать.
8. Откажитесь от картриджа и иглы, как описано в 1.10 после проведения измерений.
9. Проанализируйте полученные наборы EIC, как указано ниже(рисунок 3).
   1. Откройте файл lcd в браузере данных.
   2. Нажмите на один пик для отображения TIC и EIC.
   3. Выберите окно диапазона времени для генерации масс-спектров с помощью значка среднего спектра.
   4. Экспортировать генерируемый файл, содержащий как м/з, так и интенсивность иона соответствующего пика, нажав на вкладку экспорта на мониторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может быть применена к слюне, моче и другим жидкостям организма, а также.

3. Подготовка к in vivo PESI-MS в живом организме

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе вводится приложение для мониторинга метаболического профиля 5-Флуоро-2'-деоксиюридин (5-FdU) в живой модели мыши. Используйте асептические условия во всем.

1. Влить 100 мМ раствор5-ФЗ в хвостовую вену 2-месячной мыши (примерно 20 г веса).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует не предпочтение для секса, возраста или мыши штамма. Хотя этот протокол был утвержден в то время, когда мы проводили эксперимент⁵, осуществимость этого эксперимента зависит от этических ограничений страны, в которой он будет выполняться.
2. Анестезия мыши после утвержденного протокола по уходу за животными. Оцените глубину анестезии по отсутствию реакции на щипать хвост.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если использование пентобарбитала натрия не допускается комитетом по этике для экспериментов на животных, могут быть использованы альтернативные методы, такие как гидрохлорид кетамина.
3. Бритье брюшной полости с помощью электрической бритвы и применять ветеринарную мазь к глазам.
4. Положите обезопаживающую мышь в положение на спине и закрепите лапы на пластиковую пластину с помощью ленты для починки. Скраб хирургического сайта с скрабы 70% алкоголя в три раза.
5. Разрежьте брюшную полость ножницами. Во-первых, вырезать кожу боковой (10 мм) от чуть выше диафрагмы. Боковой разрез мышцы брюшной стенки тела и брюшной полости (около 7 мм) и держать рану открытой с помощью нержавеющей проволоки подвергать поверхности печени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует нет необходимости perfuse поверхности печени.
6. Нанесите кончик зонда иглы на поверхность печени. Отрегулируйте глубину иглы примерно до 0,5 мм глубиной, чтобы оптимизировать эффективность ионизации, проверяя TIC и спектральный узор одновременно. Установите высокое напряжение до 2,3 кВ и частоту до 3 Гц на экране панели управления.
7. Удалите животное из пластиковой пластины.
8. Шов раны с помощью хирургического шова кишечника и вернуть мышь в клетку. Не оставляйте мышь без присмотра, пока она не пришла в сознание, чтобы поддерживать суровое recumbency. Не возвращайте мышь в компанию других животных, пока она полностью не восстановится.
9. Выполните временной курс интенсивности ионов в EIC и процедуру изображения EIC как в 1.11.1 до 1.11.4.

Результаты

Как показано на рисунке 3, данные, полученные методом PESI-MS, являются масс-спектрами, м/з которых в этой системе колеблется от 10 до 1200. В то время как можно обнаружить молекулы до м / z 2000, было несколько пиков, полученных с помощью этой техники в диа...

Обсуждение

Хотя PESI является производным ESI для масс-спектрометрии^4,это наиболее выгодно для мониторинга в режиме реального времени метаболомики, а также для анализа биохимических реакций без выполнения каких-либо сложных или трудоемких предварительных процедур^5,

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020