Préparation d’échantillons pour la spectrométrie de masse d’ionisation de l’électrospray de sonde

Résumé

Cet article introduit des méthodes de préparation d’échantillons pour une méthode d’analyse unique en temps réel basée sur la spectrométrie de masse ambiante. Cette méthode nous permet d’effectuer une analyse en temps réel des molécules biologiques in vivo sans aucun prétraitement spécial.

Résumé

La spectrométrie de masse (MS) est un outil puissant en chimie analytique parce qu’elle fournit des informations très précises sur les molécules, telles que les rapports masse-charge (m/z), qui sont utiles pour déduire les poids moléculaires et les structures. Bien qu’il s’agit essentiellement d’une méthode d’analyse destructrice, les progrès récents dans la technique d’ionisation ambiante nous ont permis d’acquérir des données tout en laissant le tissu dans un état relativement intact en termes d’intégrité. L’ionisation par électrospray (PESI) est une méthode dite directe parce qu’elle ne nécessite pas de prétraitement complexe et long des échantillons. Une aiguille fine sert de cueilleur d’échantillons, ainsi qu’un émetteur d’ionisation. Basé sur la propriété très forte et fine de l’extrémité de la sonde, la destruction des échantillons est minime, ce qui nous permet d’acquérir l’information moléculaire en temps réel des êtres vivants in situ. Ici, nous introduisons trois applications de la technique PESI-MS qui seront utiles pour la recherche et le développement biomédicaux. L’une concerne l’application aux tissus solides, qui est l’application de base de cette technique pour le diagnostic médical. Comme cette technique ne nécessite que 10 mg de l’échantillon, elle peut être très utile dans les milieux cliniques de routine. La deuxième application est pour le diagnostic médical in vitro où le sérum de sang humain est mesuré. La capacité de mesurer des échantillons de fluides est également utile dans diverses expériences biologiques où un volume suffisant d’échantillons pour les techniques analytiques conventionnelles ne peut pas être fourni. La troisième application penche vers l’application directe d’aiguilles de sonde chez les animaux vivants, où nous pouvons obtenir une dynamique en temps réel de métabolites ou de médicaments dans des organes spécifiques. Dans chaque application, nous pouvons déduire les molécules qui ont été détectées par la SP ou utiliser l’intelligence artificielle pour obtenir un diagnostic médical.

Introduction

La spectrométrie de masse (MS) est une réalisation technologique du réductionnisme; il réduit l’objet de l’analyse à une unité qui peut être interprétée sur la base d’espèces moléculaires ou de cascades. Il s’agit donc d’une méthode représentative de chimie analytique. Il est composé de quatre processus : l’ionisation, l’analyse, la détection et l’acquisition spectrale. Parce que l’ionisation de la molécule est le premier processus de spectrométrie de masse, elle limite généralement la forme des analytes à traiter. La plupart des procédures d’ionisation exigent la destruction de la structure, de la morphologie et des processus biologiques en temps réel des échantillons organiques. Par exemple, l’ionisation par électrospray (ESI) MS exige que les échantillons soient dans un état liquide pour une ionisation efficace¹. Les échantillons doivent donc passer par une préparation biochimique complexe, qui modifie la composition des molécules. Alternativement, tandis que l’ionisation de desorption laser matricielle-assistée (MALDI) MS peut reconstruire des cartes moléculaires du tissu sectionné mince^2,3, son efficacité d’ionisation est trop basse pour détecter toutes les molécules dans les échantillons, et il est particulièrement pauvre en analysant des acides gras. Compte tenu de ces limitations, l’ionisation de l’électrospray de sonde (PESI)⁴ peut être employée pour observer les changements en temps réel dans les systèmes biologiques in situ sans détruire l’intégrité structurale^5,alors que l’organisme biologique observé est techniquement dans un état vivant. Une aiguille très fine est utilisée dans ce cas qui sert simultanément de cueilleur d’échantillons et d’émetteur d’ions. Cela signifie que les séquences complexes de prétraitement de l’échantillon peuvent être contournées pour obtenir des spectres de masse qui reflètent les composants moléculaires du système vivant in situ.

Il existe plusieurs autres méthodes d’ionisation qui rivalisent avec PESI-MS. L’un est la spectrométrie de masse d’ionisation par évaporation rapide (REIMS)⁶. Cette technique fonctionne bien pendant la chirurgie car elle est assemblée avec un couteau électrique et recueille le panache d’ion généré pendant l’incision. Bien que REIMS soit très utile pour la chirurgie, il s’agit essentiellement d’une méthode destructrice qui nécessite l’ablation électrique du tissu. Par conséquent, il n’est pas utile pour l’analyse détaillée des cellules et des tissus dans un échantillon de préparatif ou dans des analyses de laboratoire. En outre, parce qu’il recueille une grande quantité de panache contenant des débris de tissu, il nécessite un entretien prolongé des dispositifs après chaque utilisation, limitant ainsi l’utilisation de cette machine à des procédures chirurgicales spéciales. Une méthode similaire, appelée spectrométrie de masse d’ionisation de desorption au laser (LDI-MS)⁷, est une autre technique qui est non invasive et utile pour l’analyse de surface. Parce que cette technique est bonne à la numérisation de la surface d’un spécimen, il réalise une analyse bidimensionnelle complète comme la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI^8,9. Cependant, comme le LDI-MS ne s’applique qu’à l’analyse de surface, PESI-MS est avantageux pour analyser les échantillons, par exemple, dans le tissu. Une autre technique, le MasSpec Pen¹⁰, a été rapporté pour atteindre une grande spécificité et sensibilité dans le diagnostic du cancer de la thyroïde, mais le diamètre de la sonde est de l’ordre de mm et il est spécifique pour l’analyse de surface, ce qui signifie qu’il ne peut pas détecter de petites nodules de cancer ou des lésions profondément localisées. De plus, comme cette méthode utilise un canal d’écoulement microcapillaire encastré dans le stylo de la sonde, la contamination croisée doit être prise en considération, semblable à l’IDL-MS. D’autres techniques existent qui ont été appliquées aux milieux cliniques, tels que la sonde de flux et l’écouvillon de forme d’ionisation^11,mais elles ne sont pas répandues.

PESI est une miniaturisation extrême de l’ESI, dans laquelle le capillaire du nano-électrospray converge vers une aiguille solide avec un rayon de courbure de pointe de plusieurs centaines de nm. L’ionisation a lieu dans la zone extrêmement restreinte de la pointe de l’aiguille en formant un cône Taylor, sur lequel les échantillons restent jusqu’à ce que l’ionisation de tout le liquide sur la pointe est terminée¹². Si l’analyte reste sur la pointe de l’aiguille métallique, la charge excédentaire est générée en permanence à l’interface entre l’aiguille métallique et les analytes. Par conséquent, l’ionisation séquentielle des molécules se produit en fonction de leur activité de surface. Cette propriété fait de la pointe de l’aiguille une sorte de chromatogramme, séparant les analytes en fonction de leur activité de surface. Plus techniquement, les molécules avec l’activité de surface plus forte viennent à la surface du cône de Taylor et sont ionisées plus tôt que ceux avec l’activité de surface plus faible, qui adhèrent à la surface de l’aiguille jusqu’à la fin du processus d’ionisation. Ainsi, l’ionisation complète de toutes les molécules captées par l’aiguille est atteint¹³. En outre, parce que cette technique n’implique pas l’ajout de solvant superflu à l’échantillon, plusieurs centaines de femtolitres sont suffisants pour obtenir des spectres de masse assez forts pour une analyse plus approfondie¹⁴. Ces propriétés sont avantageuses pour l’analyse d’échantillons biologiques intacts. Cependant, un inconvénient majeur de PESI-MS réside dans la discontinuité dans l’ionisation en raison du mouvement de réciprocité de l’aiguille le long de l’axe vertical, semblable à une machine à scier. L’ionisation n’a lieu que lorsque la pointe de la sonde atteint le point le plus élevé lorsque la hauteur de l’ion orifice est alignée sur l’axe horizontal. L’ionisation cesse pendant que l’aiguille ramasse des échantillons, de sorte que la stabilité de l’ionisation n’est pas égale à celle de l’ESI classique. Par conséquent, PESI-MS n’est pas une méthode idéale pour la protéomique.

À ce jour, PESI-MS a été appliqué principalement à l’analyse des systèmes biologiques, couvrant un large éventail de domaines allant de la recherche fondamentale aux milieux cliniques. Par exemple, l’analyse directe des tissus humains préparés pendant la chirurgie a pu révéler l’accumulation de triacylglycérol dans le carcinome rénal¹⁵ et le carcinome squamous pharyngé¹⁶. Cette méthode peut également mesurer des échantillons liquides, tels que le sang, pour se concentrer sur le profil lipidique. Par exemple, certaines molécules ont été délimitées lors de changements alimentaires chez les lapins; il a été rapporté que certaines de ces molécules ont diminué aux stades très tôt des expériences, indiquant la sensibilité élevée et l’utilité de ce système pour le diagnostic clinique¹⁷. En outre, l’application directe à un animal vivant a permis la détection des changements biochimiques du foie après seulement une nuit de jeûne⁵. Zaitsu et coll.¹⁸ ont revisité cette expérience⁵ et analysé les profils métaboliques du foie de la même manière, avec des résultats qui ont renforcé la stabilité et la reproductibilité de notre méthode originale. En outre, nous avons pu discriminer le tissu cancéreux du foie non cancéreux environnant chez les souris utilisant cette technique¹⁹. Il s’agit donc d’une technique polyvalente de spectrométrie de masse qui est utile dans divers milieux, in vivo et in vitro. D’un autre point de vue, le module PESI peut être fait pour s’adapter à divers spectromètres de masse en ajustant l’attachement de montage. Dans ce court article, nous introduisons les bases et les exemples d’applications (Figure 1), y compris les applications avec des animaux vivants⁵.

Selon les règlements et les lois de chaque pays, certaines parties de ce protocole devront être révisées pour répondre aux critères de chaque institution. L’application à l’organisme vivant est la plus intéressante et la plus difficile, car elle peut fournir des changements biochimiques ou métaboliques dans les tissus ou les organes chez les animaux vivants in situ. Bien que cette demande ait été approuvée par le comité institutionnel des soins aux animaux de l’Université de Yamanashi, en 2013⁵, une autre ronde d’approbation sera maintenant nécessaire en raison des changements récents dans la réglementation pour les expériences animales. Plusieurs modifications du régime expérimental sont donc recommandées. En ce qui concerne les spectres de masse obtenus dans les expériences, en tenant compte des fluctuations des spectres de masse entre chaque mesure, il n’existe aucun système de partage d’informations spectrales commun à la communauté de séquençage des nucléotides. Il faut faire attention lorsque l’opérateur manipule l’aiguille pour éviter les accidents de bâton d’aiguille, en particulier lorsqu’il retire l’aiguille du porte-aiguille. Un dispositif spécial pour détacher l’aiguille est très utile à cet effet. Étant donné que le compartiment du module PESI est une chambre fermée hermétique, la fuite du panache d’ion ne se produit pas si le spectromètre de masse est actionné selon les instructions.

Protocole

Le comité institutionnel pour les soins aux animaux de l’Université de Yamanashi a approuvé tous les protocoles et l’utilisation d’animaux expérimentaux énoncés dans les présentes. L’utilisation d’échantillons humains a été approuvée par le comité d’éthique institutionnelle de l’Université de Yamanashi.

1. Préparation des tissus solides

REMARQUE : Les échantillons doivent être conservés sur la glace après leur retrait du corps animal ou humain afin de préserver la fraîcheur des tissus. Si les mesures ne suivent pas immédiatement la dissection, il est recommandé de stocker les tissus à -80 oC. Il n’est pas conseillé de placer le tissu dans n’importe quel type de tampon ou salin, car ils peuvent extraire certains contenus du tissu. Les tissus qui ont été fixés avec des aldéhydes ou incorporés dans la paraffine/cire ou le cryogel ne conviennent pas aux mesures de la SP.

1. Couper le spécimen de tissu à environ 2 x 2 x 2 mm à l’aide d’un scalpel ou d’un couteau. Alternativement, percer l’échantillon avec un trepan (un poinçon de biopsie jetable, taille de forage 3 mm) utilisé pour l’examen de la peau. Dans ce cas, réduire la longueur de la colonne à 2 mm.
   REMARQUE : N’importe quel tissu peut être analysé à l’aide de cette méthode. Dans cette expérience, le foie¹⁵ et le rein^19,ont été analysés avec succès pour obtenir des spectres de masse. En général, les organes parenchymes donnent de bons spectres de masse, tandis que ceux qui ont des composants fibreux ne le font pas.
2. Si le tissu est contaminé par le sang, lavez-le brièvement avec de la saline tamponnée de phosphate glacée.
   REMARQUE : Pour minimiser les lésions tissulaires post mortem, terminez cette étape, dès que possible, à température ambiante. Si les mesures ne sont pas effectuées immédiatement, congelez le tissu dans de l’azote liquide et entreposez-les à -80 oC.
3. Placer l’échantillon coupé ou perforé (environ 10 mg) dans un microtube en plastique et ajouter 100 l d’éthanol à 50 %.
   REMARQUE : Le poids exact des échantillons n’est pas déterminé parce que la spectrométrie de masse utilisée dans ce système ne fournit pas de données quantitatives. Environ 10 mg est optimal pour le tissu parenchymal.
4. Homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un micropestle.
5. Placer 10 l de l’homogénéisme dans le puits de la cartouche (Figure 2).
6. Placez la cartouche dans la chambre d’ionisation du spectromètre de masse et installez la sonde à aiguille s’inox qui sera utilisée pour l’ionisation de l’échantillon (figure 2).
   REMARQUE : Les aiguilles de sonde sont fournies par le fabricant. Ils sont en acier inoxydable et ont un rayon de courbure d’environ 400 nm.
7. Fermez fermement le couvercle de la chambre pour activer automatiquement le dispositif de sécurité.
8. Démarrez l’ordinateur de bord en cliquant sur l’icône Démarrer pour l’analyser. À l’aide des panneaux à l’écran, appliquer une tension de 2,3 kV sur l’aiguille pour générer l’électrospray et s’assurer que la fréquence de l’aiguille est de 3 Hz.
9. Attendez 30 s pour que la mesure soit terminée.
   REMARQUE : La session cesse automatiquement lorsque l’acquisition de données est terminée. La qualité de l’analyse est surveillée par un chromatogramme ionique total (TIC). Le temps de mesure est défini pour obtenir les spectres de masse représentatifs et peut être raccourci ou prolongé.
10. Disposer de la cartouche et de l’aiguille dans un système de biorisque après avoir mesuré chaque échantillon.
    REMARQUE : Un seul échantillon peut être mesuré à la fois. Il n’est pas nécessaire de calibrer la machine avant chaque mesure; l’étalonnage dépend de l’examen régulier par le fournisseur une fois tous les six mois.
11. Analyser les spectres de masse et exporter les données de texte spectral de masse à l’aide du logiciel associé au spectromètre de masse (voir tableau des matériaux) comme indiqué dans les étapes ci-dessous (Figure 3).
    1. Cliquez sur le fichier lcd dans la fenêtre du navigateur de fichiers de données du logiciel.
    2. Choisissez et cliquez sur un seul pic sur la fenêtre du spectre de masse et de représenter automatiquement un chromatogramme d’ion extrait (EIC).
    3. Vérifiez le TIC et l’EIC et cliquez sur l’icône du spectre moyen pour sélectionner la fenêtre de plage de temps pour générer le spectre de masse.
       REMARQUE : Dans cette analyse, les molécules cibles apparaissent dans la fenêtre de masse-charge (m/z) (Figure 3). En outre, parce que la durée de l’ionisation par seul coup de mouvement d’aiguille est très courte, tous les spectres de masse obtenus sont essentiellement des spectres moyens sur 10 s (300 scans).
    4. Générez un fichier texte contenant l’intensité m/z et ion en cliquant sur l’onglet Export pour une analyse plus approfondie. Ce fichier texte peut être stocké dans n’importe quel dossier.
       REMARQUE : Tout agent de conservation de l’ARN affectera le modèle spectral indigène des échantillons. En outre, il est conseillé de manipuler et de stocker des tissus sans liquide (comme la saline tamponnée de phosphate) pour empêcher l’élution des composants moléculaires du tissu dans le liquide pendant le stockage. Idéalement, des échantillons congelés frais ou frais sans aucun traitement sont utilisés.

2. Préparation des fluides corporels (sérum)

REMARQUE: Cette procédure entière est presque identique à celle utilisée pour les tissus solides. La cartouche pour l’échantillon de liquide est disponible auprès du fabricant. Étant donné que la contamination par les globules rouges (RBC) peut considérablement diminuer l’efficacité de l’acquisition spectrale du composant prévu (plasma ou sérum), assurez-vous d’éliminer tous les RBC en centrifuge avant les mesures.

1. Prenez 10 ll de l’échantillon de sérum et mettez-le dans un microtube de 1,5 ml.
   REMARQUE : Le sérum frais et stocké peut être utilisé.
2. Ajouter 190 l d’éthanol à 50 % dans le tube de 1,5 ml, puis vortexr pendant 2 min à température ambiante.
3. Centrifuger le liquide à 15 000 x g pendant 1 à 5 min à 4 oC.
4. Transférer 10 lde de supernatant dans le puits de la cartouche.
5. Placez la cartouche dans la chambre d’ionisation de la machine et installez la sonde à aiguilles en acier inoxydable qui sera utilisée pour l’ionisation de l’échantillon (figure 2).
6. Fermez fermement le couvercle de la chambre pour activer automatiquement le dispositif de sécurité.
7. Démarrez l’ordinateur de bord en cliquant sur l’icône Démarrer pour ioniser.
8. Jetez la cartouche et l’aiguille de l’échantillon décrites dans 1.10 une fois que les mesures ont été prises.
9. Analyser les ensembles obtenus d’EIC tels qu’indiqués ci-dessous (figure 3).
   1. Ouvrez le fichier lcd sur le navigateur de données.
   2. Cliquez sur un seul pic pour afficher le TIC et l’EIC.
   3. Sélectionnez la fenêtre de plage de temps pour générer des spectres de masse à l’aide de l’icône de spectre moyenne.
   4. Exporter le fichier généré contenant à la fois l’intensité m/z et ion d’un pic correspondant en cliquant sur l’onglet exportation sur le moniteur.
      REMARQUE: Cette procédure peut être appliquée à la salive, l’urine, et d’autres fluides corporels ainsi.

3. Préparation pour PESI-MS in vivo dans l’organisme vivant

REMARQUE: Dans cette section, une application pour surveiller le profil métabolique de 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) dans un modèle de souris vivante est introduite. Utilisez des conditions aseptiques partout.

1. Infuser 100 l de 100 mM 5-FdU dans la veine de la queue d’une souris de 2 mois (poids d’environ 20 g).
   REMARQUE : Il n’y a pas de préférence pour le sexe, l’âge ou la souche de souris. Bien que ce protocole ait été approuvé au moment où nous avons effectué l’expérience⁵, la faisabilité de cette expérience dépend des restrictions éthiques du pays dans lequel elle sera effectuée.
2. Anesthésiez la souris selon votre protocole de soins aux animaux approuvé. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement de la queue.
   REMARQUE : Si l’utilisation du pentobarbital de sodium n’est pas autorisée par le comité d’éthique pour les expériences animales, d’autres méthodes peuvent être utilisées, comme l’hydrochlorure de kétamine.
3. Raser la cavité abdominale à l’aide d’un rasoir électrique et appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux.
4. Placez la souris anesthésié en position de supine et fixez les pattes sur la plaque en plastique à l’aide d’un ruban adhésif de réparation. Frotter le site chirurgical avec des gommages de 70% d’alcool trois fois.
5. Couper la cavité abdominale à l’aide de ciseaux. Tout d’abord, couper la peau latéralement (10 mm) juste au-dessus du diaphragme. Coupez latéralement le muscle de la paroi abdominale et du péritoine (environ 7 mm) et maintenez la plaie ouverte à l’aide de fil inoxydable pour exposer la surface du foie.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de perfuser la surface du foie.
6. Appliquer la pointe de l’aiguille de la sonde à la surface du foie. Ajuster la profondeur de l’aiguille à environ 0,5 mm de profondeur pour optimiser l’efficacité de l’ionisation, en vérifiant simultanément les TIC et les motifs spectrals. Définir la haute tension à 2,3 kV et la fréquence à 3 Hz sur l’écran du panneau de commande.
7. Retirer l’animal de la plaque en plastique.
8. Suturer la plaie à l’aide d’une suture intestinale chirurgicale et retourner la souris à la cage. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris conscience pour maintenir la charge sévère. Ne retournez pas la souris à la compagnie d’autres animaux jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie.
9. Effectuer le cours du temps de l’intensité ionique dans EIC et la procédure de la représentation EIC comme dans 1.11.1 à 1.11.4.

Résultats

Comme le montre la figure 3, les données obtenues par la technique PESI-MS sont les spectres de masse, dont le m/z varie de 10 à 1 200 dans ce système. Alors que l’on peut détecter des molécules jusqu’à m/z 2000, il y avait peu de pics obtenus en utilisant cette technique sur la gamme de masse de m/z 1200. Par conséquent, nous avons analysé les pics de m/z 10 à 1200. Il y avait des groupes visibles de pics auto...

Discussion

Bien que PESI soit un dérivé de l’ESI pour la spectrométrie de masse⁴, il est plus avantageux pour la surveillance de la métabolomique en temps réel, ainsi que pour l’analyse des réactions biochimiques sans effectuer de prétraitements complexes ou longs^5,14,15,17. Il s’agit d’une technique de spectrométrie de masse facile et instantanée qui peut être ap...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020