原人类单核细胞的隔离、转染和文化

摘要

这里介绍的是一个优化的协议，用于分离、培养、转染和区分人类原发性单核细胞与艾滋病毒感染者和健康对照。

摘要

尽管1990年代中期采用了联合抗逆转录病毒疗法（cART），但人体免疫机能丧失病毒（艾滋病毒）仍然是一个重大的健康问题。虽然抗逆转录病毒疗法能有效地降低全身病毒载量并恢复正常的^CD4+ T细胞计数，但它并不能重建一个完全功能的免疫系统。接受CART的HIV感染者免疫系统功能失调，其特征可能是免疫激活、免疫细胞早衰或持续炎症。这些情况，以及与艾滋病毒感染有关的合并因子，增加了疾病的复杂性，在细胞和动物模型中不容易重现。为了研究这些患者免疫功能障碍背后的分子事件，这里提出了一个在体外培养和操纵人类原发性单核细胞的系统。具体来说，该议定书允许从接受CART的艾滋病毒感染者以及艾滋病毒阴性对照中获得的原发性CD14^和单核细胞的培养和转染。该方法涉及单核细胞和单核衍生巨噬细胞的分离、培养和转染。虽然使用了市售试剂盒和试剂，但该协议为使用miRNA模拟和抑制剂以及siRNA成功粘附和转染单核细胞提供了重要提示和优化条件。

引言

人体免疫缺陷病毒-1（HIV-1）感染导致严重的免疫功能障碍，可导致机会性感染和后天免疫机能丧失综合症（艾滋病）。虽然接受cART的HIV感染者的特点是病毒载量低和正常的^CD4+T细胞计数，免疫系统的功能可能在这些领域受损，导致免疫反应功能失调，这与患癌症的风险增加^有关。CART的HIV患者的免疫功能障碍机制在很大程度上仍不为人所知。因此，描述患者衍生的免疫细胞并研究其生物学和功能是当前艾滋病毒研究的重要组成部分。

单核细胞和巨噬细胞是免疫反应的主要调节者，在HIV感染^{2、3、4、5}中起着基础性作用。异构和塑料在自然界中，巨噬细胞可以大致分为经典激活（M1）或替代激活（M2）。虽然这种一般分类在设置实验条件时是必要的，但巨噬细胞的极化状态可能被各种细胞因子^{6、7、8、9}逆转。虽然有多项研究已研究爱滋病毒感染对单核细胞和树突细胞的影响，但单核细胞介导反应的分子细节基本上未知6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19。在免疫细胞调节和功能所涉及的因素中，微RNA（miRNA），即转录后调节基因表达的短非编码RNA，已被证明在主要细胞通路（即生长、分化、发育和凋亡^）20中发挥重要作用。这些分子被描述为转录因子的重要调节器，对控制巨噬细胞²¹的功能极化至关重要。miRNA在接受CART的HIV感染者的单核细胞中的潜在作用已经调查，但该领域的进展需要更多的工作22，23，24，25，26。本文讨论了一种从HIV感染者和对照组将miRNA和siRNA转染成原发人类单核细胞的优化方法。

该协议依赖于市售试剂和试剂盒，因为技术程序的连续性有助于消除临床样本工作时不必要的实验变量。尽管如此，该方法提供了重要的提示（即，用无血清培养基培养的细胞数量或短暂孵育，以促进细胞粘附在板中）。此外，该协议中使用的极化条件派生自已发表的作品27、28、29。

研究方案

下面描述的所有方法都已获得路易斯安那州立大学健康科学中心新奥尔良机构审查委员会的批准。所有血液都是在征得知情同意后采集的。

注:整个过程在生物安全2级（BSL2）设施中的无菌条件下进行，以便谨慎处理生物材料。特别是，每个步骤都是在生物安全柜下使用无菌技术执行的。在涉及血液、血液制品、细胞或细胞产品移液的每一步后，在正确处置之前，使用罩内废物容器中的 10% 漂白剂冲洗所有塑料材料（即血清移液器、移液器头和管）非常重要。

1. 免疫磁负选择分离原人类单核细胞

1. 在四个 10 mL 乙烯二甲二甲酸 （EDTA） 真空管（每管 10 mL 的血液）中收集 40 mL 的新鲜人类全血（来自 HIV⁺患者或健康控制）。使用生物安全柜下的无菌技术，将所有 40 mL 的血液转移到一个 50 mL 锥形丙烯管中。
2. 按照制造商为选定的人类单核细胞分离试剂盒（材料表）的协议，在血液管中添加2 mL的单核细胞分离鸡尾酒。涡旋磁珠，也提供在套件中，30s，并添加2 mL到血液管。
   1. 如果血液可用量少于 40 mL，则缩小添加的试剂。要混合溶液，将移液器与塑料 25 mL 血清移液器上下混合，并在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
3. 将血液混合物平均分离成四个 50 mL 管，并在每个管中加入含有 1 mM EDTA 的 30 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。通过上下移液与塑料 25 mL 血清移液器混合。
4. 将管子放在磁体支架中 10 分钟，以去除抗体结合的磁珠。同时使用四个磁体支架，每个管一个，使每个血液样本的孵育和分离时间一致。
5. 使用移液器从每个管的中心绘制内容物，而它们仍在磁体中。小心不要绘制红血球（不超过10mL起始体积的10%），并将内容物放入四个新的50 mL管之一。
6. 将 500 μL 的涡旋磁珠添加到每根 50 mL 管中。使用 25 mL 移液器上下移液器，并在 RT 孵育 5 分钟。然后，将管子放入磁铁支架中 5 分钟。
7. 小心地将内容物从每个管的中心转移到磁体支架中，并放入四个新的 50 mL 管中的一个。直接将每个新的 50 mL 管放入磁体支架中 5 分钟。
8. 小心地将内容物从每个管的中心转移到四个新的 50 mL 管之一。在300 x g下旋转所有新的50 mL管5分钟。吸出上清液，并在总共10 mL无菌PBS中重新悬浮所有四个细胞颗粒。
9. 使用血细胞计通过锥体蓝色排除来计数细胞。
   注:8-20 x 10⁶细胞一般从40 mL全血中获得。

2. 培养原发性人类单核细胞

1. 使用37°C水浴，无热的RPMI 1640培养基辅以1%青霉素-链霉素（笔/链球菌），（在继续使用生物安全柜下的无菌技术）重新悬浮该介质中分离的单核细胞，浓度为1 x 10⁶细胞/mL。
2. 将1 mL的再悬浮细胞添加到6孔盘的每个孔中或放入35毫米的培养皿中（细胞的最终数量应为1 x 10⁶细胞/板），并放置在含有5%CO₂的37°C培养箱中。等待 0.5-1.0 小时，让单元格粘附。
3. 使用37°C水浴，热热灭活（HI）胎儿牛血清（FBS）。在每个板中加入 100 μL（10% 最终浓度）的 FBS。向细胞添加生长因子，促进巨噬细胞分化。
   1. 通过在介质中添加25纳克/mL的粒细胞-巨噬细胞菌群刺激因子（GM-CSF），为M1样表型的主要巨噬细胞。通过在介质²⁸中添加50纳克/mL的巨噬细胞群落刺激因子（M-CSF），M2类表型的主要巨噬细胞。
      注:GM-CSF和M-CSF都允许单细胞分化到一般巨噬细胞表型（M0），同时为M1或M2的细胞注注，分别为^{7、28、30。}

3. 在文化中转染原始人类单核细胞

1. 使用含有聚合物转染试剂（材料表）的试剂盒，用miRNA模拟或抑制剂或siRNA转染单核细胞。
   1. 按照制造商的转染试剂盒协议（并继续在生物安全柜下使用无菌技术），首先将缓冲液中选定的miRNA模拟/抑制剂或siRNA稀释至1.83 μM的最终浓度。
2. 通过在新鲜的1.5 mL微离心管中加入1μL的聚合物，然后立即加入90μL提供的缓冲液（每次转染共91μL试剂），制备转染试剂。涡旋3-5s。
3. 移液器 90 μL 转染溶液进入含有 10 μL 稀释 miRNA 模拟/抑制剂或 siRNA 的管中。通过温和的移液混合，在RT孵育15分钟。
4. 将100 μL转染复合物添加到1个1 x 10⁶镀单核细胞的孔（或盘）。在37°C下孵育细胞4小时，然后用3mL的完整介质（RPMI 1640补充1%青霉素-链霉素和10%热灭活FBS）代替该介质，含有GM-CSF或M-CSF。

4. M1/M2 差异化和激活

1. 单核细胞在培养电镀后立即开始区分到广义M0巨噬细胞。在电镀后的第三天，在生物安全柜下继续使用无菌技术，并用 3 mL 的新鲜 RMPI 1640 介质（辅以 1% 青霉素-链霉素、10% 热灭活 FBS 和 25 纳克/mL GM-CSF，以促进 M1 型极化或 50 纳克/mL M-CSF 以促进 M2 样极化）。在这些条件下培养细胞，从在37°C、5%CO₂的培养箱中初始电镀起共6天。
2. 为了推进预基细胞的极化到M1-大噬细胞表型，在孵育的第6天激活细胞，用含有5%热灭活FBS、1%笔/链球菌、100纳克/mL大肠杆菌衍生脂多糖（LPS）和20纳克/mL干扰素伽马（IFN-+）的新媒体取代细胞培养基。
3. 为了推进预感细胞的极化到M2-巨噬细胞表型，在孵育的第6天激活细胞，用含有5%热灭活FBS、1%笔/链球菌、10纳克/mL M-CSF和20纳克/mL白细胞介素4（IL-4）的新媒体替换细胞培养基。
4. 24小时后，收获细胞进行RNA、蛋白质或流式细胞测定分析。
   1. 当细胞准备好收集时，用PBS洗涤盘中的细胞2x（RT用于RNA提取或在冰上冷冻以提取蛋白质）。由于分化的巨噬细胞现在牢固地附着在板上，因此直接在板中对细胞进行分辨，以获得用于RNA和蛋白质分析的材料。
   2. 对于流动细胞学的材料收集，在培养皿中加入含有2 mM EDTA的PBS，在37°C下孵育细胞10分钟，轻轻刮取培养皿中的细胞，并将内容物收集到1.5 mL微离心管中，然后再按照标准方案进行。

5. 流动细胞仪

1. 冲洗PBS中的细胞，去除培养培养基。剥离100，000个细胞（每个流细胞测定条件），在含有2μLHuFcR结合抑制剂的PBS中重新悬浮颗粒。在 RT 孵育 15 分钟。
2. 在推荐量中加入50μL的染色缓冲液和所需的抗体（此处为CD80、CD83、CD163和CD209）。
3. 轻轻混合，在黑暗中4°C孵育30分钟。
4. 在细胞荧光计上运行样品之前，用PBS清洗2倍，在150μL的PBS中重新悬浮染色细胞。

结果

使用所述程序，从艾滋病毒感染者和健康捐赠者中分离出主要的人类单核细胞。这里提供的所有数据均来自艾滋病毒^和接受低（<20份/mL）或检测不到的病毒载量和正常^CD4+T细胞计数的CART的受试者。分离后，细胞立即被染色，并进行流动细胞测量，以确认细胞群的纯度。结果显示，超过97%的细胞对CD14的染色呈阳性（数据未显示）。对于巨噬细胞的极化，使?...

讨论

提出的方案演示了使用HIV感染者的初级细胞作为研究单核细胞和巨噬细胞的模型。HIV^–接受 CART 的患者感染了多年，并且可能还有其他与免疫系统受损相关的共同感染。为了研究在HIV慢性感染的情况下的免疫调节，细胞直接从患者身上采集。由于miRNA已被证明在细胞发育和分化中起着重要作用，该协议侧重于在这些主细胞中操作miRNA表达的能力（图2，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	AM9260G
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA	BD Biosciences	366643
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794	Flow cytometry
CD14 PerCP	Invitrogen	46-0149-42	Flow cytometry- conjugated antibody
CD163 BV711	BD Horizon	563889	Flow cytometry- conjugated antibody
CD209 BV421	BD Horizon	564127	Flow cytometry- conjugated antibody
CD80 FITC	BD Horizon	557226	Flow cytometry- conjugated antibody
CD83 APC	BD Horizon	551073	Flow cytometry- conjugated antibody
Easy 50 EasySep Magnet	StemCell Technologies	18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit	StemCell Technologies	19669
EIF4EBP1 mAb	Cell Signaling	9644	Monoclonal antibody for Western blot
EIF4EBP1 siRNA	Santa Cruz	sc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated	Hyclone	SH30070.03HI
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	B43618
GAPDH mAb	Santa Cruz	SC-47724	Monoclonal antibody for Western blot
HuFcR Binding Inhibitor	eBiosciences	14-9161-73	Flow cytometry- blocking buffer
Kaluza Analysis Software	Beckman Coulter	B16406	Software to analyze flow cytometry data
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5	Sigma	L4524
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p	Qiagen	YM00472124
MISSION miRNA Negative Control	Sigma	HMC0002	Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye
Nunc 35mm Cell Culture Dish	Thermo Scientific	150318
PBS	Gibco	20012027
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant Human GM-CSF	R&D Systems	215-GM-050
Recombinant Human IFN-γ	R&D Systems	285-IF-100
Recombinant Human IL-4	R&D Systems	204-IL-010
Recombinant Human M-CSF	R&D Systems	216-MC-025
RPMI 1640 with L-Glutamine	Corning	10040CVMP
Scrambled Control siRNA	Santa Cruz	sc-37007
Viromer Blue Transfection Reagent Kit	Lipocalyx	VB-01LB-01
WST-1 Cell Proliferation Reagent	Roche	5015944001	Colorimetric assay to assess cell viability