JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен оптимизированный протокол для изоляции, культивирования, трансфектирования и дифференциации первичных моноцитов человека от ВИЧ-инфицированных лиц и здорового контроля.

Аннотация

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) остается серьезной проблемой для здоровья, несмотря на внедрение комбинированной антиретровирусной терапии (САРТ) в середине 1990-х годов. В то время как антиретровирусная терапия эффективно снижает системную вирусную нагрузку и восстанавливает нормальные количество CD4и Т-клеток, она не восстанавливает полностью функциональную иммунную систему. Дисфункциональная иммунная система у ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих КРТ, может характеризоваться иммунной активацией, ранним старением иммунных клеток или постоянным воспалением. Эти условия, наряду с сопутствующими факторами, связанными с ВИЧ-инфекцией, усугубляют сложность болезни, которая не может быть легко воспроизведена в клеточных и животных моделях. Для исследования молекулярных событий, лежащих в основе иммунной дисфункции у этих пациентов, система культуры и манипулировать человеческими первичными моноцитами in vitro представлена здесь. В частности, протокол допускает культуру и трансфекцию первичных монцитов CD14и, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих ЦАРТ, а также вич-отрицательных мер контроля. Метод включает в себя изоляцию, культуру и трансфекцию моноцитов и моноцитов, полученных макрофагами. В то время как коммерчески доступные комплекты и реагенты используются, протокол обеспечивает важные советы и оптимизированные условия для успешного присоединения и трансфекции моноцитов с миРНК мимикрирующими и ингибиторами, а также с siRNAs.

Введение

Инфекция вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) вызывает тяжелую иммунную дисфункцию, которая может привести к оппортунистическим инфекциям и приобретенному синдрому иммунодефицита (СПИД). Хотя ВИЧ-инфицированных пациентов, проходящих CART характеризуются низкими вирусными нагрузками и нормальной CD4И Т-клеток рассчитывает, функционирование иммунной системы может быть поставлена под угрозу в этих людей, что приводит к дисфункциональной иммунной реакции, которая была связана с повышенным риском развития рака1. Механизмы иммунной дисфункции у ВИЧ-инфицированных пациентов на КАРТ остаются в значительной степени неизвестными. Поэтому характеристика иммунных клеток, полученных пациентом, и изучение их биологии и функции является важнейшим компонентом текущих исследований в области ВИЧ.

Моноциты и макрофаги являются ключевыми регуляторами иммунных реакций и играют основополагающую роль в ВИЧ-инфекции2,3,4,5. Неоднородные и пластиковые в природе, макрофаги могут быть широко классифицированы в классическо активированных (M1) или альтернативно активированных (M2). Хотя эта общая классификация необходима при создании экспериментальных условий, статус поляризации макрофагов может быть обращен вспять различными цитокинов6,7,8,9. Хотя несколько исследований исследовали влияние ВИЧ-инфекции на моноциты и дендритные клетки, молекулярные детали моноцитных реакций в значительной степени неизвестны6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Среди факторов, участвующих в регуляции и функции иммунных клеток, микроРНК (миРНК), короткие некодировочные РНК, которые после транскрипционно регулируют экспрессию генов, были показаны, чтобы играть важную роль в контексте основных клеточных путей (т.е. рост, дифференциация, развитие, и апоптоз)20. Эти молекулы были описаны как важные регуляторы транскрипционных факторов, необходимых для диктовки функциональной поляризации макрофагов21. Исследована потенциальная роль миРНК в моноцитах ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих ЦАРТ, но прогресс в этой области требует гораздо больше работы22,23,24,25,26. В настоящем документе обсуждается оптимизированный метод перевода миРНК и сирны в первичные моноциты человека от ВИЧ-инфицированных пациентов и контроля.

Этот протокол опирается на коммерчески доступные реагенты и комплекты, так как непрерывность технической процедуры помогает устранить ненужные экспериментальные переменные при работе с клиническими образцами. Тем не менее, метод предоставляет важные советы (т.е. количество клеток, покрытых или краткое инкубации с сыворотки свободной среды для содействия присоединению клеток к пластине). Кроме того, условия поляризации, используемые в этом протоколе, вытекают из опубликованной работы27,28,29.

протокол

Все методы, описанные ниже, были одобрены Университетом штата Луизиана Центр медицинских наук Нью-Орлеан Институциональный обзор совета. Вся кровь была собрана после получения информированного согласия.

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура выполняется в стерильных условиях в объекте уровня биобезопасности 2 (BSL2), так что осторожность используется для обработки биологических материалов. В частности, каждый шаг выполняется с использованием стерильных методов под шкафом биобезопасности. После каждого шага с участием крови, продуктов крови, клеток или клеточного продукта пипетки, важно, чтобы промыть все пластиковые материалы (нат., серологические пипетки, пипетки советы, и трубки) с 10% отбеливателя из контейнера отходов внутри капота до надлежащего удаления.

1. Изоляция первичных человеческих моноцитов путем иммуномагнитного отрицательного отбора

  1. Соберите 40 мл свежей, человеческой цельной крови (отВИЧ-инфицированных или здорового контроля) в четырех 10 мл этилэндениаминететраацетической кислоты (ЭДТА) вакуумных трубок (10 мл крови на трубку). Используя стерильные методы под шкафом биобезопасности, перенесите все 40 мл крови в одну коническую пропилена нуючку 50 мл.
  2. Следуя протоколу производителя для выбранного человеческого комплекта изоляции моноцитов(Таблица материалов),добавьте 2 мл моноцитного изоляционного коктейля, предусмотренного в комплекте, в трубку крови. Вихрь магнитные бусы, также предусмотренные в комплекте, для 30 с, и добавить 2 мл в трубку крови.
    1. Если имеется менее 40 мл крови, снизируйте реагенты. Чтобы смешать раствор, пипетка вверх и вниз с пластиковой 25 мл серологического пипетки и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
  3. Разделите смесь крови поровну на четыре трубки 50 мл и добавьте 30 мл стерильного фосфатно-буферного солей (PBS), содержащего 1 мМ EDTA к каждой трубке. Смешайте трубачат вверх и вниз с пластиковой 25 мл серологического пипетки.
  4. Поместите трубки в держатели магнита в течение 10 минут, чтобы удалить антитела конъюгированные магнитные бусы. Используйте четыре держателя магнита одновременно, по одному для каждой трубки, чтобы обеспечить последовательное время инкубации и изоляции для каждого образца крови.
  5. Сорисуйте содержимое из центра каждой трубки, используя пипетку, в то время как они все еще находятся в держателях магнита. Будьте осторожны, чтобы не оформить красные кровяные тельца (не более 10% от 10 мл стартового объема), и поместить содержимое в один из четырех новых 50 мл труб.
  6. Добавьте 500 л вихревых магнитных бусин к каждой трубке 50 мл. Пипетка вверх и вниз с 25 мл пипетки и инкубировать на RT в течение 5 минут. Затем поместите трубки в держатели магнита в течение 5 минут.
  7. Тщательно перенесите содержимое из центра каждой трубки, находясь в держателях магнитов, в одну из четырех новых труб 50 мл. Непосредственно поместите каждую новую трубку 50 мл в держатели магнита в течение 5 минут.
  8. Тщательно перенесите содержимое из центра каждой трубки в одну из четырех новых 50 мл труб. Спин все новые трубы 50 мл на 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и resuspend все четыре клеточные гранулы в общей сложности 10 мл стерильных PBS.
  9. Подсчитайте клетки, происключая синий исключение с помощью гемоситометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 8-20 х 106 клеток, как правило, получены из 40 мл цельной крови.

2. Культирование первичных человеческих моноцитов

  1. Используя водяную ванну 37 градусов Цельсия, теплая безмятежная сыворотка RPMI 1640 медиа дополнила 1% пенициллина-стрептомицина (перо/стрептоцит), и (продолжая использовать стерильные методы под шкафом биобезопасности) повторно приостанавливает изолированные моноциты в этом носителе при концентрации 1 х 106 клеток/мл.
  2. Добавьте 1 мл перепонковых клеток к каждой скважине из 6 скважинной пластины или в 35-мм тарелку (окончательное количество клеток должно быть 1 х 106 ячеек/пластины), и поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию с 5% CO2. Подождите 0,5-1,0 ч, чтобы клетки придерживались.
  3. Используя водяную ванну 37 градусов, тепла активированная (HI) сыворотка крупного рогатого скота (FBS). Добавьте к каждой пластине 100 кЛ (10% конечной концентрации) FBS. Добавьте факторы роста в клетки для содействия дифференциации макрофагов.
    1. Премьер макрофагов для M1-как фенотип, добавив 25 нг / мл гранулоцитов-макрофаг колонии стимулирующий фактор (GM-CSF) в средствах массовой информации. Премьер макрофаги для M2-как фенотип, добавив 50 нг / мл макрофагов колонии стимулирующего фактора (M-CSF) в средствах массовой информации28.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба GM-CSF и M-CSF позволяют моноцитной дифференциации общего фенотипа макрофага (M0) в то время как грунтовки для M1 или M2, соответственно7,28,30.

3. Трансфектирование первичных человеческих моноцитов в культуре

  1. Трансфект моноциты с миРНК имитируют или ингибиторы или siRNA с использованием комплекта, содержащего полимерной основе трансфекционного реагента(Таблица материалов).
    1. Следуя протоколу производителя для трансфекционного комплекта (и продолжая использование стерильных методов под шкафом биобезопасности), сначала разбавляют выбранные мимилики/ингибиторы миРНК или сиРНК в буфере до конечной концентрации 1,83 мкм. Приготовьте 10 л разбавленного мимилика/ингибитора в трансфекции 1 х 106 клеток.
  2. Подготовьте трансфекционный реагент, добавив 1 кЛ предоставленного полимера в свежую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл, после чего сразу же пополнив 90 л предоставленного буфера (в общей сложности 91 л реагента за трансфикцией). Вихрь для 3-5 с.
  3. Пипетка 90 л трансфекционного раствора в трубку, содержащую 10 злиц разбавленного митрк-миРНК мимилик/ингибитор или siRNA. Смешайте нежным пипеткой и инкубируйте в течение 15 минут на RT.
  4. Добавьте 100 л трансфективного комплекса в один колодец (или блюдо) из 1 х 106 покрывало моноцитов. Инкубировать клетки для 4 ч при температуре 37 градусов по Цельсию, затем заменить среду с 3 мл полного носителя (RPMI 1640 дополнен 1% пенициллина-стрептомицина и 10% тепло-инактивированных FBS), содержащих либо ГМ-CSF или M-CSF.

4. Дифференциация и активация M1/M2

  1. Моноциты сразу же начинают дифференциировать сятвик к широким макрофагам M0 на покрытии в культуре. На третий день после покрытия, продолжать использование стерильных методов под биобезопасности кабинета и заменить средства массовой информации с 3 мл свежих RMPI 1640 средств массовой информации (дополнены 1% пенициллина-стрептомицина, 10% тепло-инактивированных FBS, и либо 25 нг / мл GM-CSF для содействия M1-как поляризация или 50 нг/mL M-CSF содействовать поляризации. Культура клеток в этих условиях в общей сложности 6 дней с момента первоначального покрытия в инкубаторе на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
  2. Для продвижения поляризации загрунтованный клетки в Фенотип M1-макрофага, активировать клетки на 6-й день инкубации путем замены клеток с новыми средствами, содержащими 5% теплоинактивированных FBS, 1% пера / стрептококка, 100 нг /мл E. coli-производные липополисахарида (LPS), и 20 нг /мL интерферон гамма (IFN.
  3. Для продвижения поляризации загрунтовавшихся клеток к фенотипу M2-макрофага активируйте клетки на 6-й день инкубации, заменив клеточные носители новыми носителями, содержащими 5% теплоинактивированных FBS, 1% пера/стрептококка, 10 нг/мл M-CSF и 20 нг/мл интерлейкина 4 (IL-4).
  4. После 24 ч, урожай клетки для РНК, белка, или потока цитометрии анализов.
    1. Когда клетки готовы к сбору, мыть клетки в тарелке 2x с PBS (на RT для экстракции РНК или охлажденный на льду для извлечения белка). Потому что дифференцированные макрофаги теперь твердо прикреплены к плитам, lyse клетки в плитах сразу для того чтобы получить материал для анализа RNA и протеина.
    2. Для сбора материала для цитометрии потока, добавить PBS, содержащий 2 мМ EDTA к блюду, инкубировать клетки в течение 10 минут при 37 градусов по Цельсию, аккуратно соскребать клетки из тарелки, и собрать содержимое в 1,5 мл микроцентрифуг трубки, прежде чем приступить к стандартным протоколам.

5. Цитометрия потока

  1. Промыть клетки в PBS, чтобы удалить культивирование среды. Спин вниз 100000 клеток (на каждый поток цитометрии условие) и повторной блокировки гранулы в 100 Л Л ПБС, содержащий 2 Зл ингибитора Связывания HuFcR. Инкубировать на RT в течение 15 мин.
  2. Добавьте 50 кл окрашивания буфера и желаемые антитела (здесь, CD80, CD83, CD163, и CD209 были использованы) в рекомендуемых количествах.
  3. Смешайте осторожно и инкубировать при 4 градусах в темноте в течение 30 минут.
  4. Вымойте 2x с PBS и resuspend окрашенных клеток в 150 Л ПБС перед запуском образца на цитофлуориметр.

Результаты

Используя описанную процедуру, были выделены первичные моноциты человека от ВИЧ-инфицированных людей и здоровых доноров. Все данные, представленные здесь, были получены из ВИЧ-испытуемых, подвергаясь АРТ с низким (злт;20 коп/мл) или необнаруживаемыми вирусными на...

Обсуждение

Представленный протокол демонстрирует использование первичных клеток ВИЧ-инфицированных испытуемых в качестве модели для изучения моноцитов и макрофагов. ВИЧ-и пациенты, проходящие ЛЕЧЕНИЕ, живут с инфекцией в течение нескольких лет, а также могут иметь другие сопутствующие ин...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить ВИЧ клинической / опухолевой биопозитория core для предоставления пациентов образцов и клеточной иммунологии Метаболизм ядро для обеспечения потока цитометрии анализа. Этот проект был профинансирован NIH P20GM12288 и P30GM114732.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAInvitrogenAM9260G
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTABD Biosciences366643
Brilliant Stain BufferBD Horizon563794Flow cytometry
CD14 PerCPInvitrogen46-0149-42Flow cytometry- conjugated antibody
CD163 BV711BD Horizon563889Flow cytometry- conjugated antibody
CD209 BV421BD Horizon564127Flow cytometry- conjugated antibody
CD80 FITCBD Horizon557226Flow cytometry- conjugated antibody
CD83 APCBD Horizon551073Flow cytometry- conjugated antibody
Easy 50 EasySep MagnetStemCell Technologies18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19669
EIF4EBP1 mAbCell Signaling9644Monoclonal antibody for Western blot
EIF4EBP1 siRNASanta Cruzsc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat InactivatedHycloneSH30070.03HI
Gallios Flow CytometerBeckman CoulterB43618
GAPDH mAbSanta CruzSC-47724Monoclonal antibody for Western blot
HuFcR Binding InhibitoreBiosciences14-9161-73Flow cytometry- blocking buffer
Kaluza Analysis SoftwareBeckman CoulterB16406Software to analyze flow cytometry data
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5SigmaL4524
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5pQiagenYM00472124
MISSION miRNA Negative ControlSigmaHMC0002Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye
Nunc 35mm Cell Culture DishThermo Scientific150318
PBSGibco20012027
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Recombinant Human GM-CSFR&D Systems215-GM-050
Recombinant Human IFN-γR&D Systems285-IF-100
Recombinant Human IL-4R&D Systems204-IL-010
Recombinant Human M-CSFR&D Systems216-MC-025
RPMI 1640 with L-GlutamineCorning10040CVMP
Scrambled Control siRNASanta Cruzsc-37007
Viromer Blue Transfection Reagent KitLipocalyxVB-01LB-01
WST-1 Cell Proliferation ReagentRoche5015944001Colorimetric assay to assess cell viability

Ссылки

  1. Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
  2. Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
  3. Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
  4. Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
  5. Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
  6. Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
  7. Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
  8. Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
  9. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  10. Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
  11. Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
  12. Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
  13. Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
  14. Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
  15. Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
  16. Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
  17. Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
  18. Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
  19. Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
  20. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  21. Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
  22. Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  23. Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
  24. Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
  25. Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
  26. Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
  27. Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
  28. Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
  29. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
  30. Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

154

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены