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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo optimizado para aislar, cultivar, transfectar y diferenciar a los monocitos primarios humanos de individuos infectados por el VIH y controles saludables.

Resumen

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) sigue siendo un importante problema de salud a pesar de la introducción de la terapia antirretroviral combinada (CART) a mediados de la década de 1990. Si bien la terapia antirretroviral reduce eficientemente la carga viral sistémica y restaura el recuento normal de células CD4+ T, no reconstituye un sistema inmunitario completamente funcional. Un sistema inmunitario disfuncional en individuos infectados por el VIH sometidos a cART puede caracterizarse por activación inmune, envejecimiento temprano de las células inmunitarias o inflamación persistente. Estas condiciones, junto con factores comorbilidadasociadoes con la infección por vih, añaden complejidad a la enfermedad, que no se puede reproducir fácilmente en modelos celulares y animales. Para investigar los eventos moleculares subyacentes a la disfunción inmune en estos pacientes, aquí se presenta un sistema para cultivar y manipular monocitos primarios humanos in vitro. Específicamente, el protocolo permite el cultivo y la transfección de CD14primarios + monocitos obtenidos de individuos infectados por el VIH sometidos a cART, así como de controles VIH-negativos. El método implica aislamiento, cultivo y transfección de monocitos y macrófagos derivados de monocitos. Mientras que se emplean kits y reactivos disponibles en el término comercial, el protocolo proporciona consejos importantes y condiciones optimizadas para la adherencia exitosa y la transfección de monocitos con imitaciones e inhibidores de miRNA, así como con siRNAs.

Introducción

La infección por el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) causa disfunción inmune grave, que puede conducir a infecciones oportunistas y síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Aunque los pacientes infectados por el VIH sometidos a cART se caracterizan por bajas cargas virales y recuentos normales de células CD4+ T, el funcionamiento del sistema inmunitario puede verse comprometido en estos individuos, lo que conduce a una respuesta inmune disfuncional que se ha relacionado con un mayor riesgo de desarrollar cáncer1. Los mecanismos de disfunción inmunitaria en pacientes con VIH en el cART siguen siendo en gran medida desconocidos. Por lo tanto, caracterizar las células inmunitarias derivadas del paciente e investigar su biología y función es un componente crítico de la investigación actual sobre el VIH.

Los monocitos y macrófagos son reguladores clave de las respuestas inmunitarias y desempeñan un papel fundamental en la infección por VIH2,3,4,5. De naturaleza heterogénea y plástica, los macrófagos pueden clasificarse ampliamente en activados clásicamente (M1) o activados alternativamente (M2). Si bien esta clasificación general es necesaria al establecer condiciones experimentales, el estado de polarización de los macrófagos puede ser invertido por una variedad de citoquinas6,7,8,9. Aunque varios estudios han investigado los efectos de la infección por VIH en monocitos y células dendríticas, los detalles moleculares de las respuestas mediadas por monocitos son en gran medida desconocidos6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Entre los factores involucrados en la regulación y función de las células inmunitarias, se ha demostrado que los microARN (miRNAs), los ARN cortos no codificantes que regulan la expresión génica posttranscripción, desempeñan un papel importante en el contexto de las principales vías celulares (es decir, crecimiento, diferenciación, desarrollo y apoptosis)20. Estas moléculas han sido descritas como reguladores importantes de los factores de transcripción esenciales para dictar la polarización funcional de los macrófagos21. Se ha investigado el papel potencial de los miRNAs en los monocitos de personas infectadas por el VIH que se someten a cART, pero el progreso en el campo requiere mucho más trabajo22,23,24,25,26. Este artículo analiza un método optimizado para transfectar miRNAs y siRNAs en monocitos humanos primarios de pacientes y controles infectados por el VIH.

Este protocolo se basa en reactivos y kits disponibles comercialmente, ya que la continuidad en el procedimiento técnico ayuda a eliminar variables experimentales innecesarias cuando se trabaja con muestras clínicas. Sin embargo, el método proporciona consejos importantes (es decir, el número de células chapadas o una incubación breve con medios libres de suero para promover la adherencia de las células a la placa). Además, las condiciones de polarización utilizadas en este protocolo se derivan de la obra publicada27,28,29.

Protocolo

Todos los métodos descritos a continuación han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Louisiana State University En New Orleans. Toda la sangre fue recolectada después de obtener el consentimiento informado.

NOTA: Todo el procedimiento se realiza en condiciones estériles en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) para que se tenga precaución para manipular materiales biológicos. En particular, cada paso se realiza utilizando técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad. Después de cada paso que involucre sangre, hemicidas, células o pipeteo de productos celulares, es importante enjuagar todo el material plástico (es decir, pipetas serológicas, puntas de pipeta y tubos) con 10% de lejía de un contenedor de residuos dentro de la campana antes de la eliminación adecuada.

1. Aislamiento de monocitos humanos primarios por selección negativa inmunomagnética

  1. Recoger 40 ml de sangre entera humana fresca (ya sea de un VIH+ paciente o un control saludable) en cuatro tubos de vacío de ácido etilendiaminetetraacético de 10 ml (EDTA) (10 ml de sangre por tubo). Utilizando técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad, transfiera los 40 ml de sangre a un tubo cónico de propileno de 50 ml.
  2. Siguiendo el protocolo del fabricante para el kit de aislamiento de monocitos humanos seleccionado(Tabla de Materiales),añadir 2 ml de cóctel de aislamiento de monocitos, proporcionado en el kit, al tubo de sangre. Cuentas magnéticas vórtice, también proporcionadas en el kit, para 30 s, y añadir 2 ml al tubo de sangre.
    1. Si hay menos de 40 ml de sangre disponible, reduzca la escala de los reactivos añadidos. Para mezclar la solución, pipetee hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de plástico de 25 ml e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
  3. Separe la mezcla de sangre por igual en cuatro tubos de 50 ml y agregue 30 ml de solución salina estéril con fosfato (PBS) que contenga 1 mM de EDTA a cada tubo. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de plástico de 25 ml.
  4. Coloque los tubos en soportes de imanes durante 10 minutos para eliminar las perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos. Utilice cuatro soportes de imán simultáneamente, uno para cada tubo, para permitir tiempos de incubación y aislamiento constantes para cada muestra de sangre.
  5. Dibuje el contenido desde el centro de cada tubo, utilizando una pipeta, mientras todavía están en los soportes del imán. Tenga cuidado de no extraer glóbulos rojos (no más del 10% del volumen inicial de 10 ml) y coloque el contenido en uno de los cuatro nuevos tubos de 50 ml.
  6. Añadir 500 l de perlas magnéticas vórtices a cada tubo de 50 ml. Pipetear arriba y abajo con una pipeta de 25 ml e incubar a RT durante 5 min. A continuación, coloque los tubos en soportes de imanes durante 5 minutos.
  7. Transfiera cuidadosamente el contenido desde el centro de cada tubo mientras todavía está en soportes de imanes en uno de los cuatro nuevos tubos de 50 ml. Coloque directamente cada tubo nuevo de 50 ml en los soportes del imán durante 5 minutos.
  8. Transfiera cuidadosamente el contenido desde el centro de cada tubo a uno de los cuatro nuevos tubos de 50 ml. Gire los nuevos tubos de 50 ml a 300 x g durante 5 min. Apiratee el sobrenadante y resuspenda los cuatro pellets celulares en un total de 10 ml de PBS estéril.
  9. Cuente las células mediante la exclusión azul de trypan usando un hemocitómetro.
    NOTA: 8-20 x 106 células se obtienen generalmente a partir de 40 ml de sangre entera.

2. Cultivo de monocitos humanos primarios

  1. Utilizando un baño de agua de 37 oC, los medios cálidos DE RPMI 1640 sin suero suplementados con 1% de penicilina-estreptomicina (lápiz/estreptococo) y (mientras continúan utilizando técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad) resuspenden los monocitos aislados en este medio a una concentración de 1 x 106 células/ml.
  2. Añadir 1 ml de células resuspendidas a cada pozo de una placa de 6 pocillos o a un plato de 35 mm (el número final de células debe ser 1 x 106 células/placa), y colocar en una incubadora de 37 oC con 5% de CO2. Espere 0.5-1.0 h para que las células se adhieran.
  3. Usando un baño de agua de 37 oC, suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor caliente (HI). Añadir 100 l (10% de concentración final) de FBS a cada placa. Añadir factores de crecimiento a las células para promover la diferenciación de macrófagos.
    1. Macrófagos de primera calidad para un fenotipo similar al M1 añadiendo 25 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) a los medios. Macrófagos primos para un fenotipo similar a M2 añadiendo 50 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) a los medios28.
      NOTA: Tanto GM-CSF como M-CSF permiten la diferenciación de monocitos a un fenotipo de macrófago general (M0) mientras ceba las células para M1 o M2, respectivamente7,28,30.

3. Transfectar monocitos humanos primarios en cultivo

  1. Monocitos transfectos con miRNA imita o inhibitorios o siRNA utilizando un kit que contiene un reactivo de transfección a base de polímeros (Tabla de materiales).
    1. Siguiendo el protocolo del fabricante para el kit de transfección (y continuando el uso de técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad), primero diluir los miRNA seleccionados imita/inhibidores o siRNAs en el tampón a una concentración final de 1,83 m. Preparar 10 ml de imitación/inhibidor diluido por transfección de 1 x 106 células.
  2. Preparar el reactivo de transfección añadiendo 1 l del polímero suministrado a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml, seguido inmediatamente añadiendo 90 ml de tampón proporcionado (para un total de 91 ml de reactivo por transfección). Vórtice para 3-5 s.
  3. Pipetear 90 l de solución de transfección en el tubo que contiene 10 ml de miRNA diluido imitando/inhibidor o siRNA. Mezclar con pipeteo suave e incubar durante 15 min a RT.
  4. Añadir 100 l de complejo de transfección a un pozo (o plato) de 1 x 106 monocitos chapados. Incubar células durante 4 h a 37 oC, luego reemplazar el medio con 3 ml de medios completos (RPMI 1640 complementado con 1% de penicilina-estreptomicina y 10% FBS inactivado por calor) que contiene GM-CSF o M-CSF.

4. Diferenciación y activación M1/M2

  1. Los monocitos comienzan inmediatamente a diferenciarse a los amplios macrófagos M0 al enchapar en cultivo. En el tercer día después del chapado, continúe utilizando técnicas estériles bajo un gabinete de bioseguridad y reemplace los medios por 3 ml de medios rmpi 1640 frescos (complementados con 1% de penicilina-estreptomicina, 10% FBS inactivado por calor y 25 ng/ml GM-CSF para promover la polarización similar a M1 o 50 ng/ml M-CSF para promover la polarización M2-like). Cultivo de las células en estas condiciones durante un total de 6 días desde el chapado inicial en una incubadora a 37oC, 5% CO2.
  2. Para avanzar en la polarización de las células cebadas al fenotipo M1-macrophage, active las células en el día 6 de la incubación reemplazando los medios celulares por nuevos medios que contengan un 5% de FBS inactivado por calor, un 1% de pluma/estreptococo, 100 ng/mL E. coli-lipopolisacárido derivado (LPS) y 20 ng/ml de interferón (IFN).
  3. Para avanzar en la polarización de las células cebadas al fenotipo M2-macrophage, active las células en el día 6 de la incubación reemplazando los medios celulares por nuevos medios que contengan un 5% de FBS inactivado por calor, un 1% de pluma/estreptococo, 10 ng/ml de M-CSF y una interleucina de 20 ng/ml 4 (IL-4).
  4. Después de 24 h, cosechar las células para análisis de ARN, proteína o citometría de flujo.
    1. Cuando las células estén listas para la recolección, lave las células en el plato 2x con PBS (en RT para la extracción de ARN o enfriada en hielo para la extracción de proteínas). Debido a que los macrófagos diferenciados ahora están firmemente unidos a las placas, atrevar las células en las placas directamente para obtener material para análisis de ARN y proteínas.
    2. Para la recolección de material para la citometría de flujo, añadir PBS que contenga 2 mM EDTA al plato, incubar las células durante 10 min a 37 oC, raspar suavemente las células del plato y recoger el contenido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml antes de proceder con los protocolos estándar.

5. Citometría de flujo

  1. Enjuague las células en PBS para eliminar el medio de cultivo. Esgire 100.000 células (por cada condición de citometría de flujo) y resuspenda el pellet en 100 ml de PBS que contenga 2 ml de inhibidor de unión HuFcR. Incubar a RT durante 15 min.
  2. Añadir 50 l de tampón de tinción y los anticuerpos deseados (aquí, CD80, CD83, CD163 y CD209 se utilizaron en las cantidades recomendadas.
  3. Mezclar suavemente e incubar a 4 oC en la oscuridad durante 30 min.
  4. Lavar 2 veces con PBS y resuspender las células manchadas en 150 oL de PBS antes de ejecutar la muestra en un citofluorímetro.

Resultados

Mediante el procedimiento descrito, se aislaron los monocitos humanos primarios de individuos infectados por el VIH y donantes sanos. Todos los datos presentados aquí se obtuvieron de VIH+ sujetos sometidos a cART con cargas virales bajas (<20 copias/ml) o indetectables y recuentonormal de células CD4+ T. Inmediatamente después del aislamiento, las células se teñían y se realizaba citometría de flujo para confirmar la pureza de las poblaciones celulares. Los r...

Discusión

El protocolo presentado demuestra el uso de células primarias de sujetos infectados por el VIH como modelo para estudiar monocitos y macrófagos. VIH+ pacientes sometidos a cART viven con infección durante varios años y también pueden tener otras coinfecciones relacionadas con un sistema inmunitario comprometido. Para estudiar la inmunomodulación en presencia de infección crónica por VIH, las células se extraían directamente de los pacientes. Como se ha demostrado que los miRNAs desempeñan un papel i...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al núcleo de biorepositorio clínico/tumor de VIH por proporcionar muestras de pacientes y el núcleo de metabolismo de inmunología celular por proporcionar análisis de citometría de flujo. Este proyecto fue financiado por NIH P20GM121288 y P30GM114732.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAInvitrogenAM9260G
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTABD Biosciences366643
Brilliant Stain BufferBD Horizon563794Flow cytometry
CD14 PerCPInvitrogen46-0149-42Flow cytometry- conjugated antibody
CD163 BV711BD Horizon563889Flow cytometry- conjugated antibody
CD209 BV421BD Horizon564127Flow cytometry- conjugated antibody
CD80 FITCBD Horizon557226Flow cytometry- conjugated antibody
CD83 APCBD Horizon551073Flow cytometry- conjugated antibody
Easy 50 EasySep MagnetStemCell Technologies18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19669
EIF4EBP1 mAbCell Signaling9644Monoclonal antibody for Western blot
EIF4EBP1 siRNASanta Cruzsc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat InactivatedHycloneSH30070.03HI
Gallios Flow CytometerBeckman CoulterB43618
GAPDH mAbSanta CruzSC-47724Monoclonal antibody for Western blot
HuFcR Binding InhibitoreBiosciences14-9161-73Flow cytometry- blocking buffer
Kaluza Analysis SoftwareBeckman CoulterB16406Software to analyze flow cytometry data
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5SigmaL4524
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5pQiagenYM00472124
MISSION miRNA Negative ControlSigmaHMC0002Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye
Nunc 35mm Cell Culture DishThermo Scientific150318
PBSGibco20012027
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Recombinant Human GM-CSFR&D Systems215-GM-050
Recombinant Human IFN-γR&D Systems285-IF-100
Recombinant Human IL-4R&D Systems204-IL-010
Recombinant Human M-CSFR&D Systems216-MC-025
RPMI 1640 with L-GlutamineCorning10040CVMP
Scrambled Control siRNASanta Cruzsc-37007
Viromer Blue Transfection Reagent KitLipocalyxVB-01LB-01
WST-1 Cell Proliferation ReagentRoche5015944001Colorimetric assay to assess cell viability

Referencias

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