在 Vivo 表面心电图中成人斑马鱼

摘要

在这里,我们提出了一种可靠、微创且经济高效的方法来记录和解释活麻醉成年斑马鱼的心电图。

摘要

成年斑马鱼的心电图波形与人类的电心图波形非常相似。这些心电图相似性不仅提高了斑马鱼作为人类心脏电生理学和肌病研究模型的价值,而且作为高通量药物筛查中的潜在心肌毒性的代理模型。人,如QT延长。因此,成年斑马鱼体内心电图是一种电表型工具,对于横截面或纵向的体内电生理表征是必要的,如果不是不可或缺的的话。然而,由于缺乏可靠、实用和具有成本效益的记录方法,往往仍然是防止这种体内诊断工具更容易获得的主要挑战。在这里,我们描述了一种实用、直接的成人斑马鱼体内心电图方法,使用低维护、经济高效和全面的系统,可生成一致、可靠的记录。我们用12-18个月大的健康成年雄性斑马鱼来说明我们的方案。我们还引入了快速的实时解释策略,用于质量验证,以确保数据的准确性和鲁棒性,在心电图记录过程的早期。

引言

斑马鱼 (达尼奥雷里奥) 心脏位于胸腔和胸围腰围之间的胸腔。心脏被封闭得相当松散,在一个银色的心包囊。从解剖学上讲,斑马鱼的心脏不同于四室的人类和其他哺乳动物的心脏,因为它的体积很小(比人类心脏小100倍),并且其双室结构仅由一个中庭和一个心室组成。尽管如此,心电图(ECG)波形和两个物种的QT间隔持续时间非常相似(图1)。因此,斑马鱼已成为研究人类遗传性心律失常1、2、3和高通量药物筛选潜在人类心毒性的常用模型4,5,如 QT 延长。

在人类心脏疾病的常规评估中,人体表面心电图自1903年埃因霍温发明以来,已成为使用最广泛的一线非侵入性诊断工具。相比之下,自2006年首次对成年斑马鱼进行体面心电图记录方法的改造,以及此后^的7次修改以来,尽管该领域的许多研究人员基本上无法进入这项技术。这种动物模型的流行。对于对成年斑马鱼进行体内心电图询问的其他研究人员,操作者之间的巨大差异导致不同研究的ECG结果不一致。常见的原因包括繁琐和昂贵的专用设备和软件、低信噪比以及电极放置方面的混淆,所有这些都因对成年斑马鱼心电图功能的不完全了解而进一步恶化。基础组织机制。鉴于体内心电图是电表型活斑马鱼的唯一诊断工具,显然需要一种标准化方法,以提高灵敏度和特异性、可重复性和可访问性。

在这里,我们提出了一个实用,可靠和验证的方法,记录和解释斑马鱼在体内心电图(图2)。利用前平面的单双极铅,我们研究了活体麻醉健康野生型AB成年斑马鱼的ECG波形和间隔持续时间的变化。

研究方案

这项研究的所有实验都是根据美国国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》进行的。本研究中的所有动物协议均获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 实验设置的准备

1. 在 28°C ~ 0.5 °C 下,在 14 小时光、10 小时暗光周期下,在流经水族馆系统中保持斑马鱼。每日用薄片食物喂食,每天两次食用活盐水虾(Artemia nauplii)。在这项研究中,斑马鱼由加州大学洛杉矶分校斑马鱼核心维护和喂养。
2. 在实验当天,将斑马鱼从水族馆运送到实验室。
3. 通过连接设备的基本部件并将三个颜色编码的不锈钢电极插入放大器的三个颜色匹配的检修门中,设置体内心电图记录系统(图3)。在心电图记录和/或分析会话开始时启动系统。
4. 采购必要的工具,如计时器/秒表、带狭缝的湿海绵,用于盛住鱼、钳子、剪刀、巴斯德移液器和培养皿(100 mm x 20 mm)。

2. 麻醉诱导

1. 准备浸入麻醉疼痛控制和鱼类固定,以避免在心电图数据采集过程中运动伪影。大多数实验室使用浸入式三氯苯甲酸酯(乙基3-氨基苯甲酸酯,MS-222)。
   1. 要制作三叶草 0.4% 库存溶液,请将以下物品组合在螺旋封的深色玻璃瓶中:400 毫克三聚苯甲酸粉、98 mL 双蒸馏水和 2 mL 1M Tris(pH 9)。根据需要使用 1 N NaOH 或 1 N HCl 调节到 pH 7.0⁸。
   2. 要制作三叶草最终浸泡溶液,确定适合斑马^鱼9岁、大小、代谢状态、菌株、疾病模型、科学目标和程序持续时间的最小浓度。
   3. 执行三重酶浓度反应研究,从建议的浓度 168 mg/L(或 0.0168%) 9(如有必要)向上或向下滴度,以在 3 分钟内达到麻醉 4 级,并尽可能减少心肺毒性。例如,在这项研究中,将12-18个月大的野生AB斑马鱼浸入0.02-0.04%三硝溶液中,在3分钟内诱导4级麻醉。
      注:在麻醉的4级,平衡和肌肉张力完全丧失,操作性运动速率降低8。
   4. 如有必要,请咨询机构动物护理和使用委员会(IACUC)的兽医,以寻求关于选择麻醉剂和治疗路线的适当性的其他指导。
2. 将成年斑马鱼浸入含有最低预定浓度和IACUC批准浓度的三聚体溶液的盘中(例如,本研究中的0.02-0.04%),在3分钟内诱导4级麻醉(图2)。
   1. 对于生存心电图协议,保持心电图记录会话尽可能简短(10 分钟以下)。对于持续少于 15 分钟的短暂心电图记录会话,无需进行麻醉维护。
   2. 对于持续数小时的长时间心电图记录会话,使用长效的肌肉麻痹和口服灌注系统,提供充足的水化和氧^合6。

3. ECG引线放置

1. 一旦斑马鱼保持麻醉4级3s,使用一对钝钳将鱼立即转移到潮湿的海绵狭缝上,其腹腔表面最上面放置ECG铅电极(图4)。
2. 轻轻地将三个 ECG 铅电极插入鱼肌肉,深度约为 1 mm,从而在正面平面上建立双极引线,与心脏主轴的左直角颅方向平行。
3. 将正(红色)电极放置在球状动脉水平的腹腔中线,即位于连接锥形下边缘的两条虚线上方1-2毫米处(图4A)。
4. 将负极(黑色)高毛放置,将0.5-1.0 mm左至正极,距离大于成年斑马鱼心室最大腹角长度(图4A)。
5. 将参考(绿色)电极定位在靠近肛门区域的位置。
   注:由于心脏主轴因鱼而异,为了最大化R波和T波振幅,只需通过试验和误差进行小而系统的变化,调整引线位置。例如,一次更换一个电极(正极或负极),同时对一个指定方向进行逐渐更改,然后再更改为另一个方向,而不是在随机方向上进行不稳定的更改。

4. 心电图记录

1. 打开心电图数据采集程序。从下拉菜单中选择所需的设置,用于范围、低通和高通。例如,本实验中使用的体内心电图记录系统中的以下设置为正常成年斑马鱼提供一致、令人满意的信噪比:范围为"2 mV"、低通"120 Hz"和高通"0.03 s"。
2. 按"开始"以 1 kHz 的采样速率开始连续无间隙 ECG 记录。
3. 为了优化引线定位,实现最大信噪比,请按"停止"停止心电图记录,并在每个心脏的第一次记录尝试后不久查看 ECG 跟踪。 要诊断成年斑马鱼心电图正常,请确认满足以下四个验证标准(图1):
   1. 标准 1:确保所有 ECG 波形(P、QRS 和 T)都清晰且易于看到。
   2. 标准 2:确保 P 波为正。
   3. 标准 3:确保净 QRS 复数为正(即 R 波幅大于 Q 和 S 波振幅之和)。
   4. 标准 4:确保 T 波为正。
4. 如果需要正常心电图,请重新定位电极(如有必要,先尝试负极),直到满足所有四个验证标准。
5. 如果预期有正常的 T 波,但 T 波太小,则重新定位电极以最大化 T 波振幅。
6. 优化引线定位后恢复心电图录制。保存心电图扫描以供后续分析。

5. 麻醉恢复

1. 在 ECG 记录会话结束时,小心地取出电极,而不会伤害鱼。将鱼转移到新鲜、含氧的鱼水中,没有三叶草。
2. 为了便于从麻醉中恢复,用巴斯德移液器大力喷水在刺上,直到鱼恢复常规的刺运动或游泳。
3. 监测鱼从麻醉中完全恢复(通常为1-2分钟),如鱼直立游泳至少5秒的能力所示。

6. 心电图口译

1. 定义分析设置。
   1. 阅读ECG数据分析软件的操作手册,了解软件界面(材料表)。
      注:虽然以下说明特定于我们实验室中使用的商业软件,但任何用于 ECG 分析的软件包中,要完成的基本任务基本上都是一样的。
   2. 打开心电图数据分析程序。在"文件"菜单中,选择"打开"以打开感兴趣的心电图文件并显示完整的 ECG 跟踪。使用鼠标拖出 ECG 跟踪中要分析的部分。
   3. 从ECG 分析菜单中,选择ECG 设置以打开一个对话框,预先定义软件自动分析的各种参数设置 (图 5A)。
2. 分析心律和速率。
   注:心率取决于几个因素,包括斑马鱼的年龄和菌株,麻醉剂(如三叶草,肌酸等)和浓度,麻醉使用(单剂5,7与联合剂5)和曝光时间⁵.例如,在这项研究中,12-18个月大的野生型AB斑马鱼在3-5分钟浸泡在0.02-0.04%三角溶液中的心率为每分钟116 ±17次(n = 9),与该年龄组的心率文献报告一致,麻醉^5,7。
   1. 确定心律是否是正心律,正常还是不规则。
      注:正声律律的存在(或缺失)基于每个QRS之前(正常PR间隔)的直立P波的存在(或不存在)(例如,刘等人的10-12个月大的7只和12-18个月大的野生型AB斑马鱼的60-65毫秒)。心房和心室节律规律(或不规则)分别基于连续PP或RR间隔的规律性(或不规则性)。
   2. 要确定心率,请确保软件正确识别所有 P 波和 R 波。基于P波和R波的自动识别(或手动修正),软件自动测量心电图选择中的所有PP和RR间隔,计算间隔平均值以生成心房和心室速率。
      注: 心房速率是平均 PP 间隔,而心室速率是平均 RR 间隔。要确定心率,正确识别 P 波和 R 波至关重要。
   3. 通过将错放的光标移动到适当的 P 和 R 波波(图 5B ),纠正任何自动识别错误。
      注:如果心脏处于正心节,心房速率和心室速率相同,因为正心 P 波和 QRS 复合体之间的一对一对应关系。然而,在眼间分离(例如,心室心动过速或三度心动过速块)的情况下,P波和QRS复合体之间的这种一对一对应关系丢失;因此,有两个心率,因为心房速率与心室速率不同。
   4. 如果心律正常,则根据至少连续五个完整心脏周期确定心率;如果心律不规律,则至少六秒。
3. 计算间隔和波形持续时间。
   1. 转到ECG 分析>平均视图将n(例如 5) 连续心脏周期串联到单个平均信号中(图 5C)。
      注:如果单个心脏周期的ECG波形与平均信号有较大差异,则单独研究心脏周期,而不串联。
   2. 确保软件正确识别 P 波、QRS 复合体和 T 波的开始和结束,这些波波显示在平均视图窗口中(图 5C)。基于这些波波和间隔的自动识别(或手动校正),软件会自动测量常规定义的持续时间。
      注: PR 间隔从 P 波开始延伸到 QRS 复合体(或者如果 Q 波不可见,则为 RS 复数)。QRS 持续时间从 Q 波的开始(或 Q 波不可见时 R 波)延伸到 S 波的末端(即 J 点;图 1.QT 间隔从 Q 波的开始(或 R 波,如果 Q 波不可见)延伸到 T 波的末尾。因此,要计算间隔和持续时间,正确识别 P 波、QRS 复数和 R 波的开始和结束至关重要。
   3. 通过将错放的光标移动到适当的位置来更正任何自动识别错误。
   4. 选择 S 波的负峰值作为 QRS 复合⁷的末尾,因为发出 S 波末端信号的斑马鱼 J 点尤其难以准确识别。这将导致对真实 QRS 持续时间的轻微低估。
      注: ECG 分析软件使用用户在步骤 6.1.3 中预先选择的方法(例如 Bazett(图 5A) 自动校正心室速率(或 RR 间隔)以生成校正的 QT 间隔 QTc。Bazett 的公式 (1920) QTc = QT / _RR是最受欢迎的,也是为纠正心率的人类 QT 间隔而提出的几种方法中的第一种。由于Bazett公式的准确性受到质疑,参考为人类10、11和斑马鱼6(图5D)提出的其他方法。
4. 通过识别步骤 4.3 中的四个验证标准的异常来解释 ECG 异常。
   1. 识别条件 1 的异常。在没有任何P波(表示没有主休节)的情况下,依靠RR间隔和QRS持续时间来诊断心律。例如,如果 RR 间隔不规则,则诊断心房颤动;如果 RR 间隔是定期的,并且 QRS 通常很窄,则诊断结点逃生节奏;另一方面,如果RR间隔是定期的,并且QRS异常延长,则诊断心室逃生节律。
   2. 识别标准 2 的异常。当 P 波为负(或倒置)时,从异位起搏器(如窦节点、心周三位结节或心室下游的心房位)诊断逆行心房活化。
   3. 识别标准 3 的异常。当高和窄 Q 波出现负 P 波和负 T 波时,诊断由于正极和负极位置的错误开关而导致的引线反转,因为这些高和窄 Q 波是真正的 R 波错误地反转(图 6D).相反,当宽Q波在心脏严重受伤后出现正P波时,诊断心肌梗死,因为这些宽Q波是真正的病理Q波。
   4. 识别标准 4 的例外情况。当 T 波反转时,检查心室激活,以确定心室重极异常是主要还是次要。依靠临床方案缩小正确诊断范围,从主要心室复极异常的差分列表中缩小正确诊断范围(来自药物效应或心肌缺血);图 6C)与二次心室复极异常(由于预激发、心室外泄或心室起搏引起的异常心室激活)。
5. 导出心电图调查结果。
   1. 选择表视图以查看所有心电图测量值。选择要复制并粘贴到所需文档中的感兴趣度量(例如,Excel 电子表格)。
   2. 要导出 ECG 跟踪,请使用放大镜图标突出显示 ECG 扫描中感兴趣的部分。复制并粘贴到所需的文档中(例如 Word 或 PowerPoint)。

结果

图 1说明了此处介绍的方法的临床相关性。成年斑马鱼在体内表面心电图是一种必不可少的电表位工具,因为斑马鱼和人类心电图之间尽管存在巨大的解剖差异,但具有显著相似性。斑马鱼心脏只有一个心房和一个心室,而人类心脏则有两个心房和两个心室(上排;右、左分别)。然而,尽管斑马鱼心脏在解剖学上具有明显的简单性,但它与人的心脏(下排;右、左)共享多种心电图特征,因此,斑马鱼心脏已成为人类心脏的代用品模型。电生理学^5,12,13.图1显示了一个小但独特的Q波,从活的,健康的14个月大的斑马鱼。然而,在斑马鱼心电图中,铅定位通常不经过优化以显示Q波。因此,Q波通常是不可见的,并且RS复合物比斑马鱼心电图中的完整QRS复合体更常见。

图2总结了为成年斑马鱼进行微创性心电图的四个基本动作步骤。麻醉诱导(步骤1)和电极放置(步骤2)后,我们记录了来自健康野生型AB斑马鱼的基线心电图信号(步骤3),其年龄为12至18个月(n = 9)。我们的电极插入技术只是微创,因为我们不需要剥鱼鳞片或进行心内切除术。在数据采集后,我们手动检查并验证了每个 ECG 记录(步骤 4),以避免软件自动分析的潜在误解。

图 3显示了典型 ECG 数据采集和处理系统的三个不可或缺的组件:高性能数据采集硬件、高增益差分放大器以及使用 ECG 数据软件上传的计算机采集和分析。在我们的实验室中,我们改造了现有的商用体内心电图记录系统,该系统最初是为小型哺乳动物模型(如小鼠、大鼠和兔子)设计的,以适应成年斑马鱼模型。

图 4表明,正确的引线放置要求将引线与假定的心脏主轴对齐。在斑马鱼体内心电图记录中,由于只使用一条引线,因此正确的引线定位能够同时最大化R和T波振幅至关重要。为了最大化R波和T波振幅,我们将正极和负极与心脏主轴对齐,大概在左锥形到右颅方向。继胸腔切除术和围心周切除术打开心包并暴露心脏后,心脏主轴变得明显(图4B白色虚线)。事实上,心电图外显性暴露心脏是一种常用的策略,以增加信噪比7,代价是将心电图记录从微创转化为高侵入性程序。

图 5说明了心电图分析中的关键步骤。首先,我们使用ECG设置对话框(图5A)预定义软件自动分析的各种参数设置。由于我们重新使用为哺乳动物模型设计的现有心电图记录设备,以适应成年斑马鱼,因此无法为斑马鱼提供检测和分析设置。我们选择了人类预设,而不是,鉴于斑马鱼心电图与人类心电图的显著相似性(图5A)。其次,我们手动验证了软件自动心电图识别(黑色)的R波峰,并纠正(红色)任何R波自动识别错误之前,命令软件重新计算平均心室速率。例如,在图5B中,与R波相关的大P波使软件误认R波,导致随后自动误判RR间隔或心室速率。因此,在心电图分析中,必要的人工验证和适当的修正至关重要。第三,我们快速评估节奏规律,并使用平均视图(图 5C)计算波和间隔的平均持续时间,将多个连续的心脏周期(绿色)串联到单个平均信号(黑色)。在图5C中,九个心脏周期和平均信号之间可以忽略不计的偏差,这就为这种斑马鱼心脏出色的节奏规律性提供了理由。最后,我们使软件能够使用 Bazett 自动校正心率的 QT 间隔,这是可用的七种不同方法之一(图 5D)。

图 6A-C演示电极放置深度如何影响 ECG 信号的振幅。当我们错误地将电极过于浅入真皮(图6A)时,引线是"间接"状的(心脏有两个以上心脏直径,类似于间接标准人类心电图肢体导致I、II和III)和电压信号很小。当我们适当地将电极插入1毫米深的胸腔肌肉(图6B),铅成为"半直接"(近距离,但不直接接触心脏),电压信号增加。ECG波形变得清晰可见。然而,当我们错误地将电极插入心室(图6C)时,铅变得"直接"(与心脏直接接触),电压信号进一步增加。与图6A相比,图6C中的R波振幅增加了8倍,与图6B相比增加了4倍。然而,图6C中的心电图轨迹揭示了心室心肌损伤的新迹象,如新的ST抑郁症和新T波反转。

图 6D演示了所有 ECG 波形(P、Q、R、S 和 T)的异常反转如何发出引线反转错误的信号,其中正极和负极切换位置。请注意,根据定义 Q 和 S,R 始终为负数,而 R 始终为正数。

图 6E-F显示不适当的麻醉深度会损害体内心电图记录的质量。在图6E中,麻醉不足(0.017%三替)导致斑马鱼完全固定。由此产生的运动伪影通过污染信号(星号)和增加噪声(箭头)来降低信噪比。相反,在图6F中,过量麻醉(0.08%三丁酸)诱发严重的鼻痛心律失常以及ST段和T波的变化。

图1:人与斑马鱼心脏的对比解剖和心电图。与拥有两个心房和两个心室的人类心脏相比,斑马鱼心脏只有一个心房和一个心室(顶行)。缩写:RA,右中庭;洛杉矶,左中庭;RV,右心室;LV:左心室。斑马鱼心脏与人的心脏(下排)共享几个共同的心电图特征。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:微创体内心电图记录方案。原理图流程图说明了进行体内心电图询问的四个关键动作步骤:诱导麻醉、放置心电图铅电极、记录心电图和分析心电图记录。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:ECG数据采集和处理系统。集成体内心电图记录系统的三个关键组件包括用于采集数据的硬件、用于数据采集和分析的放大器和计算机软件。放大器配有三个现成的 29 规格不锈钢微电极。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:ECG 引线放置。三个 29 度彩色编码不锈钢电极牢固地插入鱼群中,深度约为 1 mm。负(黑色)电极和正(红色)电极的放置在前平面上建立双极引线,沿左锥形到右颅方向。缩写:参考,参考电极请点击这里查看此图的较大版本。

图 5:C心电图分析中的动画步骤。(A) 预先定义软件自动分析的各种参数设置.(B) 由 P 波和 R 波的软件(黑色)手动更正(红色)两个自动错误识别,以纠正软件对心房和心室速率的误判。(C) 将连续九个心脏周期(绿色)串联到单个平均信号(黑色)中,以快速评估节奏规律/不规则性,并计算波和间隔的平均持续时间。(D) 使用各种方法之一(如 Bazett)校正心率的 QT 间隔。请点击此处查看此图的较大版本。

图6:铅放置和麻醉深度对心电图信号的影响。决定体内心电图记录成功的两个最关键的步骤是铅放置(A-D) 和麻醉深度 (E-F)。请点击此处查看此图的较大版本。

讨论

如本研究所示,当通过单一铅记录成年斑马鱼体内心电图时,对ECG记录结果的质量和有效性有许多警告。首先,在选择适当的麻醉剂和确定所需的最小麻醉浓度、深度和持续时间时,平衡麻醉心毒性与抑制运动伪影的迫切需要和先前确定的麻醉量。生存与终端实验设计。利用不同药物类别5、14和麻痹剂1、6的多种麻醉剂组合的协同增效作用,降低单个制剂5的剂量或施用高诱导剂量后维持剂量低是典型的策略。然而,尽管它是众所周知的潜在的心肺毒性,包括死亡8,三联苯仍然是使用最广泛,最好的可用,和唯一的麻醉剂批准美国食品和药物管理局(FDA)为斑马鱼麻醉。三氯苯甲酸已普遍用于成人斑马鱼的ECG记录,无论是作为单一剂,还是与其他麻醉剂或麻痹剂结合使用。

其次,使用我们对于正常成年斑马鱼心电图的四个验证标准,至少可以确保正常斑马鱼的铅放置精度。在我们在这里提出的四个验证标准中,最后两个标准共同证实了R波的极性与正常心电图5、7、15中T波的极性之间的基本一致性。这种R和T波协调是斑马鱼和人类16、17正常心电图之间的偶然但关键的相似性,有助于斑马鱼心脏模型作为人类心脏的代用品的临床相关性电 生理。但是,几种良性或恶性条件可能使四个验证标准中的任何一个失效。例如,R和T波协调在心肌缺血7,15中丢失。心肌缺血中R波和T波协调的丧失是斑马鱼与人类心电图之间的又一显著相似性,有助于斑马鱼心肌梗死模型的临床相关性。

最后,我们推荐了心电图分析的标准实践。随着技术的出现,心电图分析软件可以生成自动心电图解算。然而,我们强烈建议,受过训练的人应始终重新解释和验证所有心电图基于相应的临床场景导致心电图记录。通常完全依赖ECG分析软件的自动解释是不可取的,特别是在存在常见的正常心电图变异、心脏病变或铅位次优的情况下。

本研究侧重于用于短暂心电图记录会话的微创方法。然而,如果需要终端长时间的心电图记录会话持续几个小时,修改是必要的,以提供足够的氧合,水化和麻醉通过连续灌注6。

此外,至少通过三种方式之一来提高信噪比。选择更强大的放大器通常是一个昂贵的,如果不是不切实际的选择。打开心包囊以减少体积导体是一种合理的,虽然具有侵入性,方法已被采用7。战略性引线放置以与主心轴平行的方向对齐引线轴(图 4B)将最大化心电图电压信号,但可能需要反复试验,尤其是在无心度切除术的情况下。

我们在这里介绍的成年斑马鱼体内心电图查询方法具有四个主要优点。首先,我们的微创方法只需要电极插入,但没有鱼鳞切除或胸腔外胸切除术。因此,通过尽量减少鱼的痛苦,我们的方法允许在纵向生存研究中重复心电图询问。其次,当麻醉剂充分抑制鱼的运动时,我们研究中的体内心电图记录系统始终能产生令人满意的信噪比和无噪声原始信号。第三,我们在这里提出的四标准质量验证可确保在 ECG 数据采集的早期数据准确性和鲁棒性,并最大限度地减少与操作员相关的变化。最后,特别是,我们最后的验证标准(正常T波是直立的)封装了R波和T波的和谐,这是斑马鱼正常心电图的一个重要的人类特征(图1)。

然而,目前我们小组和其他人对成年斑马鱼体内心电图方法仍存在四个主要限制。

首先,缺乏受试者合作需要麻醉,其限制心肺毒性后果。对于体内心电图询问,而人类患者从来不需要镇颤,斑马鱼总是需要麻醉剂或麻痹,所有这些都会导致多变的心肺毒性。

其次,需要保护附加的心电图导致稍微提高其他非侵入性程序的侵入性。虽然人类在人体表面心电图记录中的铅放置是完全非侵入性的,因为电极粘附在人类表皮上,而斑马鱼体内心电图记录的铅放置更具侵入性,因为至少,钢电极必须穿刺鱼皮,以便安全地插入鱼肌肉。

最后两个限制源于斑马鱼胸部和心脏的解剖约束。第三,成年斑马鱼心脏的极小尺寸要求大幅度减少心电图引线的数量。虽然人类在标准心电图记录中很容易容纳12条引线,但成年斑马鱼通常只能容纳单极或双极引线。单个 ECG 引线的冲压是同时优化所有三个 P、R 和 T 波振幅的挑战。因此,斑马鱼心电图询问中最佳和准确铅放置的重要性怎么强调也不为过。在斑马鱼中,T波是一个独特的检测挑战,因为它通常是这三个波中最小的。因此,斑马鱼T波振幅应优先于通常较大的P波和R波。

第四,确定斑马鱼主心轴以最大化R波振幅可能具有挑战性。原因是斑马鱼心脏在其松散的心包内比人的心脏在其形式适合手套状的心形内有更多的运动自由。

总体而言,这些限制将刺激未来的方法创新。随着3D打印和可变形^电子18的出现,有希望有一天,使用无线电极传感器的"心脏袜子",在清醒、警觉、游泳的斑马鱼中直接植入铅。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture dishes	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Dumont Forceps	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Iris Forceps	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12	6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Scissors	Fine Sciense Tools	15000-08	2.5 mm, 0.075 mm
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G	MS-222