杏中自体和（内）相容关系的确定结合手授、显微镜和遗传分析

摘要

本文提出了一种方法，将荧光显微镜的自（in）相容性与通过PCR分析识别S-基因型相结合的方法，确定杏（Prunus亚美尼亚卡L.）的授粉要求。

摘要

罗萨塞的自不相容性是由一种主要由多环位点S控制的Game-phy-s不兼容系统（GSI）决定的。在杏中，确定自和（在）兼容性关系变得越来越重要，因为大量新的培养素的释放导致具有未知授粉要求的培养品种的增加。在这里，我们描述了一种方法，将通过手工授粉和显微镜确定自（in）相容性与通过PCR分析识别S-基因型的方法相结合。为了进行自我（in）相容性测定，从每个品种的气球阶段收集花在野外，在实验室手工授粉，固定，并沾上含艾琳蓝，以观察荧光显微镜下的花粉管行为。为了建立品种之间的不相容关系，从幼叶中提取了每个品种的DNA，通过PCR鉴定了S-等位物。这种方法允许建立不相容组，阐明品种之间的不相容关系，这为在设计新果园时选择合适的授粉器和在育种计划中选择合适的父母提供了有价值的信息。

引言

自我不相容是开花植物的一种策略，以防止自授，促进跨越^1。在罗萨塞，这种机制是由一个游戏学自不相容系统（GSI）决定的，该系统主要由多环位点S2²控制。在风格中，RNase基因编码S-stylar决定因素，RNase^3，而决定S-花粉决定因素的F盒蛋白由SFB基因⁴编纂。自我不相容相互作用通过抑制花粉管生长的方式，防止卵管^55，66的受精。

在过去二十年中，全世界都进行了品种更新^{， 7，,8}.从不同的公共和私人育种项目引进了大量新的品种，导致杏培养品种增加，对未知授粉要求^8。

使用不同的方法来确定杏的授粉要求。在现场，通过在笼子里的树木或被授精的花丛中进行对照授粉，然后记录水果集^{99、10、11、1210,11}的百分比^，12可以建立自（内）相容性。此外，在实验室中，通过半体内花卉培养和荧光显微镜下花粉管行为分析⁸8、13、14、15、16、17，进行了控制授粉。^{,13,14,15,16,17}最近，分子技术，如PCR分析和测序，允许在研究RNase和SFB基因^18，19,19的基础上，对不相容关系进行表征。在杏中，有33个S-allee被报告（S₁到S_20，S S₂₂到_S30，S S_52，S S_53，S S_v，S S_x），包括一个与自我S兼容（S_cc）12，18，20，21，22，23，24相关的等位基因。^{12,18,20,21,22,23,24}截至目前，该物种已根据S-基因型^{,,8、9、17、25、26、279,17}组，对该物种进行了^25,26次不相容组。⁸²⁶具有相同S-等位基因的培养体是互不兼容的，而具有至少一个不同 S-alleleS的培养器，因此，在不同的不兼容组中分配，是相互兼容的。

为了确定杏培养的授粉要求，我们描述了一种方法，将荧光显微镜的自（in）相容性测定与杏仁培养体中PCR分析的S-基因型的识别相结合的方法。这种方法允许建立不兼容组，并阐明品种之间的不相容关系。

研究方案

1. 自（内）兼容性确定

1. 在田里品尝花。有必要在气球阶段采集花（图1A），与杏子²⁸的BBCH刻度第58阶段相对应，以避免不必要的先前授粉。
2. 实验室的自检和交叉授粉
   1. 在气球阶段取出花的麻醉剂，放在一张纸上，在实验室温度下干燥。
   2. 24小时后，使用细网（0.26毫米）筛分花粉颗粒（图1B）。
   3. 在同一气球阶段为每一个自授粉和交叉授粉而对30朵花进行浸化，并在实验室温度下将花花泡沫上的皮皮放在水中（图1C）。
   4. 在消瘦后24小时，手用画笔用来自同一品种24小时的花朵的花粉对皮丝进行授粉。此外，将每种品种的另一组皮质与来自兼容授粉器花的花粉进行控制（图1D）。
   5. 72小时后，在4°C²⁹下将皮酸固定在乙醇/醋酸（3:1）的固定溶液中至少24小时。然后丢弃固定剂，加入75%乙醇，确保样品完全浸入溶液中。样品可在4°C下保存在4°C下，直到使用⁸8、17、30、31、32。^,17,30,31,32
3. 通过体外花粉发芽评估花粉生存能力
   1. 制备发芽介质时，重量为25克蔗糖、0.075克硼酸（H₃BO_3）和0.075克硝酸钙（Ca（NO₃3）2）33。₂³³
   2. 将介质的成分加入250 mL蒸馏水中，然后完全溶解。
   3. 凝固介质加入2克琼脂，并通过旋转混合。
   4. 使用 pH 仪表检查介质的 pH 值，并使用 NaOH 或 HCl 解决方案将值调整为 7.0。
   5. 高压灭菌混合物以消毒介质。
   6. 高压后，冷却介质并将其分发到无菌层流罩中的培养皿中。
   7. 在凝固的花粉发芽介质中分散用于受控授粉的相同品种的花粉颗粒，并在24小时⁶后在显微镜下观察它们。
      注:要消毒层流罩，请使用 70% 乙醇清洁表面，并在 10 分钟内打开紫外线灯。
   8. 将培养皿存放在冰箱中，温度为 4°C，直到使用。
4. 显微镜观察
   1. 用蒸馏水洗三次1小时，在4°C下将其留在5%硫酸钠中。24小时后，在硫酸钠10分钟内以1公斤/厘米²高压灭菌，以软化组织^34。
   2. 将自切除的皮片放在玻璃幻灯片上，在手术刀的帮助下，取出卵巢周围的三角，以更好地可视化花粉管。然后，用盖玻璃挤压皮片。
   3. 制备 0.1% （v/v） 艾林蓝色污渍:将 0.1 mL 的艾林蓝色混合在 100 mL 的 0.1 N 磷酸钾三基 （K₃PO₄）。在准备上涂上一滴青联蓝，在花粉管生长过程中染色钙化物沉积。
   4. 使用 340-380 带通和 425 长通滤波器，通过具有紫外线外皮的显微镜观察沿样式的花粉管。

2. 脱氧核糖核酸提取

1. 在春季的田间中取样2-3片。建议在幼年阶段对叶子进行取样，因为获得的DNA与旧叶相比，酚类化合物的质量更高，水平更低。
2. 按照商用套件中描述的步骤提取基因组DNA（参见材料表）。
3. 使用 UV-vis 分光光光光度计 （260 nm） 分析 DNA 浓度的数量和质量。

3. S-等位基因识别

1. 设置 PCR 反应
   1. 在每个DNA提取样品的蒸馏水中制备50纳克/μL稀释剂。
   2. 慢慢解冻PCR试剂，并把它们保存在冰上。将DNA聚合酶留在冰箱中，直到需要为止。
   3. 使用引素的不同组合准备扩增反应。通过组合表 1中的组件创建 PCR 反应组合。涡旋PCR反应混合良好，并将PCR板每个孔中用于不同底漆组合的体积分配。然后，在每个井中加入1μL的DNA稀释。
   4. 将 PCR 板放在热循环器中，并运行表 1所示的相应 PCR 程序。
2. 分析放大的片段。分析PCR放大片段主要有两种不同的方法:毛细管电泳（CE）与荧光标记的底漆或作为无标签底漆的琼脂凝胶电泳的可视化放大器。
   1. 毛细血管电泳
      1. 要准备装载缓冲液，请将 35 μL 的去离子化形式酰胺与 0.45 μL 的标签尺寸标准混合。将试剂搅拌好，然后将35.5μL分配到读卡板的孔中。
      2. 将 PCR 产品的 1 μL 添加到井中。此外，添加一滴矿物油，以防止水蒸发。
      3. 准备添加分离缓冲液的分离板。
      4. 使用基因分析仪附带的商业软件（参见材料表）。创建新的样品板，并保存板上所有孔的样品名称。
      5. 选择分析方法。在这种情况下，在90°C下对样品进行120 s变性，在2.0 kV下注射30秒，在6.0 kV下分离35分钟。
      6. 将两个板插入基因分析仪。用蒸馏水填充毛细管阵列。
      7. 加载专利的线性聚丙烯酰胺 （LPA） 凝胶。最后，单击"运行"。
   2. 凝胶电泳
      1. 制备1%的琼脂胶凝胶，在150 mL的1x TAE（三酸-醋酸-EDTA）电泳跑步缓冲液（40 mM Tris，20 mM醋酸，和1 mM EDTA在pH 8.0）中加入1.5克分子生物学级阿加松。通过微波加热溶解琼脂，2-3 分钟。
      2. 要可视化DNA，请加入4μL的核酸染色（参见材料表），然后轻轻混合。
      3. 将凝胶梳子与足够的孔用于梯子、控制和样品，放入凝胶托盘中。然后，将混合物缓慢倒入凝胶托盘中间，避免气泡。
      4. 让凝胶在室温下冷却 30-45 分钟，直到凝胶完全凝固。将凝胶引入电泳室，取出凝胶梳子，在腔室中充满足够的 1x TAE 缓冲液来盖住凝胶。
         注:检查凝胶的位置。由于负电荷的DNA向阴极迁移，油井应放置在负极附近。
      5. 在 PCR 产品中加入 5 μL 的加载缓冲液（0.1%（v/v）溴酚蓝），并混合好。
      6. 要估计波段的大小，加载5μL的DNA分子量阶梯（参见材料表）。
      7. 将样品装入凝胶的附加井中。
      8. 一旦所有样品和DNA分子量阶梯被加载，在90V下运行凝胶1-1.5小时，直到蓝色染料线大约是凝胶长度的75%。
      9. 在转射器中可视化核酸的频带。

结果

杏的授粉研究要求在麻醉前一天在晚期气球阶段使用花（图1A）。这个阶段被认为是最有利的花粉和皮酸收集，因为花卉结构几乎成熟，但蚂蚁脱发尚未发生。这可以防止不想要的花粉的干扰，不仅来自同一朵花的花粉，而且来自其他花，因为封闭的花瓣会阻碍携带外部花粉的昆虫的到来。花粉颗粒很容易通过细网（图1B）从?...

讨论

传统上，大多数商业杏欧洲品种是自我兼容^的36。然而，在过去几十年中，在繁殖项目中，使用北美自我不兼容的培养品种作为父母，导致越来越多的新的自我不兼容的培养品种的释放，这些培养动物的授粉要求为^{77、8、37。8,37}因此，确定杏培养素中的自兼容关系和相互兼容关系变得越来越重要。这在冬寒减?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose D1 Low EEO	Conda	8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kit	Bioline	BIO-21060
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
CEQ System Software	Beckman Coulter
DNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	69106
dNTP Set, 4 x 25 µmol	Bioline	BIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400	Beckman Coulter	608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System	Beckman Coulter
GenomeLab Separation Buffer	Beckman Coulter	608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1	Beckman Coulter	391438
HyperLadder 100bp	Bioline	BIO-33029
HyperLadder 1kb	Bioline	BIO-33025
Image Analysis System	Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system	Bio-Rad	170-8640
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
pH-Meter BASIC 20	Crison
Phusion High-Fidelity PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F553S
Power Pack P 25 T	Biometra
Primer Forward	Isogen Life Science
Primer Reverse	Isogen Life Science
Quantity One Software	Bio-Rad
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Sub-Cell GT	Bio-Rad
SYBR Safe DNA Gel Stain	Thermo Fisher Scientific	S33102
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
Taq DNA Polymerase	QIAGEN	201203
Vertical Stand Autoclave	JP Selecta