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Resumo

Apresentamos uma metodologia para estabelecer os requisitos de polinização das cultivares de damasco(Prunus armeniaca L.) combinando a determinação da auto-(in)compatibilidade por microscopia de fluorescência com a identificação do S-genótipo pela análise pcr.

Resumo

A autoincompatibilidade em Rosaceae é determinada por um Sistema de Autoincompatibilidade Gametofitic (GSI) que é controlado principalmente pelo lócus multiloelico S. No damasco, a determinação das relações de auto e inter-(in)compatibilidade é cada vez mais importante, uma vez que a liberação de um importante número de novas cultivares resultou no aumento de cultivares com requisitos desconhecidos de polinização. Aqui, descrevemos uma metodologia que combina a determinação da auto-(in)compatibilidade por polinizações manuais e microscopia com a identificação do genótipo Spela análise pcr. Para a determinação de auto-(in)compatibilidade, foram coletadas flores em fase de balão de cada cultivar no campo, polinizado à mão em laboratório, fixado e manchado com azul anilina para observação do comportamento do tubo de pólen sob a microscopia de fluorescência. Para o estabelecimento de relações de incompatibilidade entre cultivares, o DNA Sde cada cultivar foi extraído de folhas jovens e S-alelos foram identificados pela PCR. Essa abordagem permite estabelecer grupos de incompatibilidade e elucidar relações de incompatibilidade entre cultivares, o que fornece informações valiosas para escolher polinizadores adequados na concepção de novos pomares e selecionar pais apropriados em programas de reprodução.

Introdução

A autoincompatibilidade é uma estratégia de floração das plantas para prevenir a auto polinização e promover o outcrossing1. Em Rosaceae, esse mecanismo é determinado por um Sistema de Autoincompatibilidade Gametofitic (GSI) que é controlado principalmente pelo lócus multitélico S2. No estilo, o gene RNase codifica o determinante S-stylar, um RNase3, enquanto uma proteína F-box, que determina o determinante do pólen S,é codificada pelo gene SFB 4. A interação de autoincompatibilidade ocorre através da inibição do crescimento do tubo de pólen ao longo do estilo que impede a fertilização do ovule5,6.

No damasco, uma renovação varietal ocorreu em todo o mundo nas últimas duas décadas7,8. Essa introdução de um importante número de novas cultivares, de diferentes programas de reprodução pública e privada, resultou no aumento de cultivares de damasco com requisitos desconhecidos de polinização8.

Diferentes metodologias têm sido usadas para determinar os requisitos de polinização em damasco. No campo, a auto-compatibilidade pode ser estabelecida por polinização controlada em árvores enjauladas ou em flores emasculadas e,posteriormente,registrando o percentual de conjunto de frutas9,10,,11,12. Além disso, polinizações controladas têm sido realizadas em laboratório pela cultura semi-in vivo de flores e análise do comportamento do tubo de pólen sob microscopia de fluorescência8,,13,,14,,15,,16,17. Recentemente, técnicas moleculares, como análise e sequenciamento de PCR, permitiram a caracterização de relações de incompatibilidade com base no estudo dos genes RNase e SFB 18,19. No damasco, foram relatados 33 S-alelos(S1 a S20, S22 a S30, S52, S53, Sv, Sx), incluindo um alelo relacionado com auto-compatibilidade(Sc)12, 18,,18,20,,21,,22,,23,,24. Até agora, 26 grupos de incompatibilidade foram estabelecidos nesta espécie de acordo com o S-genótipo8,9,17,25,26,27. Cultivares com os mesmos alelos Ssão intercompatíveis, enquanto cultivares com pelo menos um s-alelodiferente e, consequentemente, alocados em diferentes grupos incompatíveis, são intercompatíveis.

Para definir os requisitos de polinização das cultivares de damasco, descrevemos uma metodologia que combina a determinação da auto-(in)compatibilidade por microscopia de fluorescência com a identificação do genótipo Spela análise pcr em cultivares de damasco. Essa abordagem permite estabelecer grupos de incompatibilidade e elucidar relações de incompatibilidade entre cultivares.

Protocolo

1. Determinação de auto-(in)compatibilidade

  1. Prove as flores no campo. É necessário coletar as flores no estágio do balão(Figura 1A),correspondente ao estágio 58 na escala BBCH para damasco28, para evitar polinização prévia indesejada.
  2. Polinizações auto e cruzadas em laboratório
    1. Retire os anteratos das flores no estágio do balão e coloque-os em um pedaço de papel para secar à temperatura do laboratório.
    2. Após 24h, peneirar os grãos de pólen utilizando uma malha fina (0,26 mm)(Figura 1B).
    3. Emascular um grupo de 30 flores no mesmo estágio de balão para cada auto-polinização e polinização cruzada e colocar os pistils na espuma florista na água em temperatura laboratorial(Figura 1C).
    4. Polinize as pistils com a ajuda de um pincel com pólen de flores da mesma cultivar 24 h após a emasculação. Além disso, poliniza outro conjunto de pistils de cada cultivar com pólen a partir de flores de um polinizador compatível como controle(Figura 1D).
    5. Após 72 h, fixar os pistils em uma solução fixativa de etanol/ácido acético (3:1) por pelo menos 24 h a 4 °C29. Em seguida, descarte o fixador e adicione 75% de etanol garantindo que as amostras estejam completamente submersas na solução. As amostras podem ser conservadas nesta solução a 4 °C até o uso8,17,30,31,32.
  3. Avaliação da viabilidade do pólen através da germinação in vitro de pólen
    1. Para preparar o meio de germinação, peso 25 g de sacarose, 0,075 g de ácido bórico (H3BO3) e 0,075 g de nitrato de cálcio (Ca(NO3)2)33.
    2. Adicione os componentes do meio em 250 mL de água destilada e dissolva completamente.
    3. Solidifique o meio adicionando 2 g de agarose e misture girando.
    4. Verifique o pH do meio usando um medidor de pH e ajuste o valor para 7.0 com solução NaOH ou HCl.
    5. Autoclave a mistura para esterilizar o meio.
    6. Depois de autoclaving, esfrie o meio e distribua-o em pratos petri em um capô de fluxo laminar estéril.
    7. Espalhe os grãos de pólen das mesmas cultivares utilizadas para as polinizações controladas no meio de germinação solidificada do pólen e observe-os sob o microscópio após 24 horas6.
      NOTA: Para esterilizar a coifa de fluxo laminar, limpe a superfície com 70% de etanol e ligue a lâmpada UV durante 10 minutos.
    8. Guarde as placas de Petri em uma geladeira a 4 °C até usar.
  4. Observações de microscopia
    1. Lave os pistils três vezes por 1h com água destilada e deixe-os em 5% de sulfito de sódio a 4 °C. Após 24 h, autoclave-os a 1 kg/cm2 durante 10 min em sulfito de sódio para suavizar os tecidos34.
    2. Coloque os pistils autoclavados sobre um escorregador de vidro e, com a ajuda de um bisturi, remova as casas trica ao redor do ovário para obter uma melhor visualização dos tubos de pólen. Em seguida, esmague os pistils com um copo de cobertura.
    3. Prepare 0,1% (v/v) mancha azul anilina: misture 0,1 mL de azul anilina em 100 mL de 0,1 N linfóteo de potássio tribasic (K3PO4). Aplique uma gota de azul anilina sobre os preparativos para manchar os depoimentos de callose durante o crescimento do tubo de pólen.
    4. Observe os tubos de pólen ao longo do estilo por um microscópio com epifluorescência UV usando 340-380 bandpass e 425 filtros de longopass.

2. Extração de DNA

  1. Amostra 2-3 folhas no campo na primavera. Recomenda-se a amostra das folhas em estágios jovens, uma vez que o DNA obtido é de maior qualidade e níveis mais baixos de compostos fenólicos em comparação com as folhas antigas.
  2. Extrair DNA genômico seguindo as etapas descritas em um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
  3. Analise a quantidade e a qualidade das concentrações de DNA utilizando espectrofotômetro UV-vis (260 nm).

3. Identificação de alelo

  1. Configuração das reações do PCR
    1. Prepare uma diluição de 50 ng/μL em água destilada de cada amostra de extração de DNA.
    2. Descongele os reagentes PCR lentamente e mantenha-os no gelo. Deixe o DNA polimerase no congelador até que seja necessário.
    3. Prepare as reações de amplificação usando as diferentes combinações de primers. Crie o mix de reação pcr combinando os componentes na Tabela 1. Vortex a reação PCR mistura bem e distribui o volume indicado para as diferentes combinações de primers para cada poço da placa PCR. Em seguida, adicione 1 μL da diluição de DNA em cada poço.
    4. Coloque a placa PCR no termociclador e execute o programa PCR correspondente mostrado na Tabela 1.
  2. Analise os fragmentos amplificados. Há principalmente duas maneiras diferentes de analisar os fragmentos amplificados do PCR: eletroforese capilar (CE) com primers fluorescentes rotulados ou como amplificadores visuais de eletroforese de gel agarose com primers não rotulados.
    1. Eletroforese capilar
      1. Para preparar o tampão de carga, misture 35 μL de formamide deionizado com 0,45 μL de padrão de dimensionamento rotulado. Vórtice o reagente para misturar bem, e depois dispense 35,5 μL no poço da placa do leitor.
      2. Adicione 1 μL do produto PCR no poço. Além disso, adicione uma gota de óleo mineral para evitar a evaporação da água.
      3. Prepare a placa de separação adicionando tampão de separação.
      4. Use o software comercial incluído com o analisador genético (ver Tabela de Materiais). Crie uma nova placa de amostra e guarde os nomes da amostra para todos os poços na placa.
      5. Selecione o método de análise. Neste caso, desnaturar as amostras a 90 °C para 120 s, injetar a 2,0 kV para 30 s e separar a 6,0 kV por 35 min.
      6. Insira as duas placas no analisador genético. Encha a matriz capilar com água destilada.
      7. Carregue o gel de poliacrilamida linear patenteado (LPA). Finalmente, clique em Executar.
    2. Eletroforese de gel
      1. Prepare um gel de 1% de agarose adicionando 1,5 g de agarose grau de biologia molecular em 150 mL de 1x TAE (Tris-acetato-EDTA) tampão de execução (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM e 1 mM EDTA no pH 8.0). Dissolva a ágarose por aquecimento de micro-ondas por 2-3 min.
      2. Para visualizar o DNA, adicione 4 μL de uma mancha de ácido nucleico (ver Tabela de Materiais) e misture suavemente.
      3. Adicione um pente de gel, com poços suficientes para escadas, controles e amostras, em uma bandeja de gel. Em seguida, despeje lentamente a mistura no meio da bandeja de gel e evite bolhas.
      4. Deixe o gel esfriar por 30-45 min em temperatura ambiente até que o gel se solidifique completamente. Introduza o gel na câmara de eletroforese, remova o pente de gel e encha a câmara com tampão TAE suficiente para cobrir o gel.
        NOTA: Verifique a colocação do gel. Os poços devem ser colocados perto do polo negativo, uma vez que o DNA carregado negativamente migra para o cátodo.
      5. Adicione 5 μL de tampão de carga (0,1% (v/v) azul bromofenol) aos produtos PCR e misture bem.
      6. Para estimar o tamanho das bandas, carregue 5 μL de escada de peso molecular de DNA (ver Tabela de Materiais).
      7. Coloque as amostras nos poços adicionais do gel.
      8. Uma vez que todas as amostras e a escada de peso molecular de DNA são carregadas, execute o gel a 90 V por 1-1,5 h, até que a linha de corante azul esteja aproximadamente a 75% do comprimento do gel.
      9. Visualize as bandas em um transilluminador para ácidos nucleicos.

Resultados

Estudos de polinização em damasco exigem o uso de flores na fase final do balão um dia antes da anestesia (Figura 1A). Esta etapa é considerada a mais favorável tanto para a coleta de pólen quanto para pistil, uma vez que as estruturas florais estão quase maduras, mas a deshiscência anther ainda não ocorreu. Isso evita a interferência de pólen indesejado, não só de pólen da mesma flor, mas também de outras flores, uma vez que as pétalas fechadas impedem a che...

Discussão

Tradicionalmente, a maioria das cultivares europeias de damasco comercial eram autocompatíveis36. No entanto, o uso de cultivares autocompatíveis norte-americanas como pais em programas de reprodução nas últimas décadas resultou na liberação de um número crescente de novas cultivares auto-incompatíveis com requisitos de polinização desconhecidos7,,8,,37. Assim, a determinação das relações ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-European Regional Development Fund, União Europeia (AGL2016-77267-R e AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigação y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-000); Gobierno de Aragón-European Social Fund, União Europeia (Grupo Consolidado A12_17R), Fundação Biodiversidad e Agroseguro S.A.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose D1 Low EEOConda8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kitBiolineBIO-21060
Bright field microscopeLeica MicrosystemsDM2500
CEQ System SoftwareBeckman Coulter
DNeasy Plant Mini KitQIAGEN69106
dNTP Set, 4 x 25 µmolBiolineBIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400Beckman Coulter608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis SystemBeckman Coulter
GenomeLab Separation BufferBeckman Coulter608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1Beckman Coulter391438
HyperLadder 100bpBiolineBIO-33029
HyperLadder 1kbBiolineBIO-33025
Image Analysis SystemLeica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system Bio-Rad170-8640
NanoDrop One SpectrophotometerThermo Fisher Scientific13-400-518
pH-Meter BASIC 20Crison
Phusion High-Fidelity PCR KitThermo Fisher ScientificF553S
Power Pack P 25 TBiometra
Primer ForwardIsogen Life Science
Primer ReverseIsogen Life Science
Quantity One SoftwareBio-Rad
Stereoscopic microscopeLeica MicrosystemsMZ-16
Sub-Cell GTBio-Rad
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Taq DNA PolymeraseQIAGEN201203
Vertical Stand AutoclaveJP Selecta

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