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요약

PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별과 형광 현미경 검사법에 의한 자기(in)호환성을 결합한살구(Prunus armeniaca L.) 품종의 수분 요건을 확립하는 방법론을 제시한다.

초록

Rosaceae의 자기 비호환성은 주로 다골 궤적 S에 의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성 시스템(GSI)에 의해 결정됩니다. 살구에서, 새로운 품종의 중요한 수의 방출이 알려지지 않은 수분 요구 사항을 가진 품종의 증가를 초래했기 때문에 자기 및 인터 -(in) 호환성 관계의 결정은 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기서는 PCR 분석에 의한 S-유전자형식별과 손-오염 및 현미경 검사법에 의한 자기(in)호환성의 측정을 결합한 방법론을 설명한다. S- 자기(in)호환성 측정을 위해 각 품종의 풍선 스테이지에서의 꽃은 현장에서 수집되고, 실험실에서 수분, 고정 및 형광 현미경 검사하에 꽃가루 튜브 거동을 관찰하기 위해 애니라인 블루로 염색하였다. 품종 간의 비호환성 관계의 설립을 위해, 각 품종에서 DNA는 젊은 잎에서 추출되었고 S-alleles는 PCR에 의해 확인되었다. S 이 접근 법은 비호환성 그룹을 수립하고 품종 사이의 비호환성 관계를 해명 할 수 있으며, 이는 새로운 과수원 설계에 적합한 수분제를 선택하고 번식 프로그램에서 적절한 부모를 선택하는 귀중한 정보를 제공합니다.

서문

자기 비호환성은 식물을 꽃피는 전략으로 자가 수분을 방지하고 횡단 을 촉진하는1을촉진합니다. Rosaceae에서, 이 기계장치는 주로 다발성 궤적 S2에의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성 시스템 (GSI)에 의해 결정됩니다. 스타일에서, RNase 유전자는 S-s타이라 결정제, RNase3을인코딩하고, S-꽃가루결정제를 결정하는 F 박스 단백질은 SFB 유전자4에의해 명문화된다. 자가비호환성 상호작용은 배란5,,6의수정을 방지하는 스타일을 따라 꽃가루 관 성장의 억제를 통해 일어난다.

살구에서, 품종 갱신은 지난 2 년 동안 전 세계적으로 일어났다7,,8. 이러한 새로운 품종의 중요한 수의 도입, 다른 공공 및 민간 사육 프로그램에서, 알 수없는 수분 요구 사항8살구 품종의 증가를 초래했다.

살구의 수분 요구 사항을 결정하는 데 다른 방법론이 사용되었습니다. 현장에서, 자체(in)호환성은 케이지 나무 또는 에뮬레이트된 꽃에서 제어된 오염에 의해 확립되고, 이후에 과일 세트9,,10,,11,12의백분율을기록할 수 있다. 또한, 대조된 오염은 꽃의 반 생체 배양에 의해 실험실에서 수행되었으며 형광 현미경검사법 8,13,,,14, 15,,16,,17하에서꽃가루 튜브 거동을 분석한다.15, 최근에는 PCR 분석 및 시퀀싱과 같은 분자 기법은 RNase 및 SFB 유전자18,,19의연구에 기초하여 비호환성 관계의 특성화를 허용하고 있다. 살구에서, 33 S-alleles(S1 ~ S20, S22 ~ S30,S52, S53,Sv, S S Sx)자가 호환성(SSc)12,18,,20,,,21,21,,22,,23,,24. 지금까지, 26 비호환성 그룹은 S-유전자형8,9,,17,25,,,,26,,27에따라 이 종에서 찌르고 있다. 동일한 S-대립구를 S가진 품종은 상호 호환되지 않는 반면, 적어도 하나의 다른 S-대립구를 가진 품종및 결과적으로, 다른 호환되지 않는 그룹에 할당, 상호 호환됩니다. S

살구 품종의 수분 요구 사항을 정의하기 위해, 우리는 살구 품종에서 PCR 분석에 의한 S-유전자형의식별과 형광 현미경 검사법에 의한 자기(in) 호환성의 측정을 결합하는 방법론을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 비호환성 그룹을 설정하고 품종 간의 비호환성 관계를 설명할 수 있습니다.

프로토콜

1. 자체(in) 호환성 결정

  1. 필드에 있는 꽃을 샘플링합니다. 원치 않는 이전 수분을 피하기 위해, 살구28에대한 BBCH 규모에 스테이지 58에 해당하는 풍선 단계(그림 1A)에서꽃을 수집 할 필요가있다.
  2. 실험실에서 자체 및 교차 pollinations
    1. 풍선 단계에서 꽃의 anthers를 제거하고 실험실 온도에서 건조 종이 조각에 배치합니다.
    2. 24시간 후, 미세 메쉬(0.26 mm)를 사용하여 꽃가루 곡물을 체질(도1B).
    3. 각 자가 수분 및 교차 수분에 대해 동일한 풍선 단계에서 30개의 꽃그룹을 방출하고 실험실 온도에서 꽃집 폼에 피스틸을 배치합니다(도1C).
    4. 손으로 는 방출 후 같은 품종 24 h의 꽃가루로 페인트 브러시의 도움으로 피슬을 수분합니다. 또한, 대조군으로 호환되는 꽃가루에서 꽃가루로 각 품종의 또 다른 피스틸 세트를 수분(도1D).
    5. 72h 후, 4°C29에서적어도 24시간 동안 에탄올/아세트산(3:1)의 고정용액으로 미스틸을 수정한다. 그런 다음 고정을 폐기하고 75% 에탄올을 추가하여 샘플이 용액에 완전히 침수되도록 합니다. ,샘플은8,17,,30,31, 32를사용할 때까지 4 °C에서이 용액에서 보존 될 수있습니다.,,
  3. 체외 꽃가루 발아를 통해 꽃가루 생존 가능성 평가
    1. 발아 배지를 준비하려면 자당 25g, 붕산 0.075 g(H3BO3)및 질산 칼슘 0.075 g(Ca(NO3)2)33을준비한다.
    2. 250mL의 증류수에 매체의 성분을 넣고 완전히 녹입니다.
    3. 아가로즈 2 g를 첨가하여 배지를 고형화하고 소용돌이에 섞습니다.
    4. pH 미터를 사용하여 매체의 pH를 확인하고 NaOH 또는 HCl 용액을 사용하여 값을 7.0으로 조정합니다.
    5. 배지를 살균하기 위해 혼합물을 자동 클로 처리합니다.
    6. 오토클레이브 후, 매체를 식히고 멸균 라미나르 플로우 후드에 페트리 접시에 분배합니다.
    7. 고화화 꽃가루 발아 배지에서 제어 된 꽃가루에 사용되는 동일한 품종의 꽃가루 곡물을 분산하고 24 h6후 현미경으로 관찰한다.
      참고: 라미나르 플로우 후드를 살균하려면 표면에 70% 에탄올로 청소하고 10분 동안 UV 램프를 켭분으로 전환합니다.
    8. 페트리 요리를 4°C의 냉장고에 보관하십시오.
  4. 현미경 관찰
    1. 증류수로 1시간 동안 3회 소염제를 세척하고 4°C에서 5% 설파이트 나트륨에 넣습니다. 24시간 후, 설파이트 나트륨에서 10분 동안 1kg/cm2로 오토클레이브하여 조직을 부드럽게한다(34).
    2. 유리 슬라이드 위에 오토클레이브 피슬을 놓고 메스의 도움으로 난소 주변의 삼각집을 제거하여 꽃가루 튜브의 더 나은 시각화를 얻습니다. 그런 다음 피슬을 커버 유리로 분쇄합니다.
    3. 준비 0.1% (v/v) 애니라인 블루 스테인: 0.1 mL의 애니라인 블루를 0.1mL의 100mL에서 0.1N 칼륨 인산염 삼각염(K3PO4)으로혼합한다. 꽃가루 튜브 성장 중 칼로스 증세를 얼룩지게하기 위해 준비 에일린 블루 한 방울을 적용하십시오.
    4. 340-380 밴드패스와 425개의 롱패스 필터를 사용하여 UV 에피플루오렌스를 사용하여 현미경으로 스타일을 따라 꽃가루 튜브를 관찰하십시오.

2. DNA 추출

  1. 봄에 필드에 2-3 잎을 샘플링합니다. DNA가 얻은 것은 오래된 잎에 비해 페놀 화합물의 높은 품질과 낮은 수준이기 때문에 젊은 단계에서 잎을 샘플링하는 것이 좋습니다.
  2. 시판되는 키트에 기재된 단계를 따라 유전체 DNA를 추출합니다(재료표참조).
  3. UV-비스 분광광미터(260nm)를 사용하여 DNA 농도의 양과 품질을 분석합니다.

3. S-알레알렐 식별

  1. PCR 반응 설정
    1. 각 DNA 추출 샘플의 증류수에 50 ng/μL 희석을 준비합니다.
    2. PCR 시약을 천천히 해동하고 얼음 위에 보관하십시오. 필요할 때까지 DNA 폴리머라아제를 냉동실에 둡니다.
    3. 프라이머의 다른 조합을 사용하여 증폭 반응을 준비합니다. 표 1의구성 요소를 결합하여 PCR 반응 믹스를 만듭니다. PCR 반응이 잘 섞여 서 프라이머의 상이한 조합에 대해 표시된 부피를 PCR 플레이트의 각 웰에 분배한다. 그런 다음 각 우물에 DNA 희석의 1 μL을 추가합니다.
    4. PCR 플레이트를 열순환기에 놓고 표 1에표시된 해당 PCR 프로그램을 실행합니다.
  2. 증폭된 조각을 분석합니다. PCR 증폭 된 단편을 분석하는 두 가지 방법이 주로 있습니다 : 형광 라벨 프라이머를 가진 모세관 전기 포근 (CE) 또는 표기되지 않은 프라이머와 아가로즈 젤 전기 포의 앰프슨을 시각화.
    1. 모세관 전기 포레시스
      1. 로딩 버퍼를 준비하려면 35 μL의 탈이온화된 포름아미드를 라벨이 붙은 크기 조정 표준의 0.45 μL을 혼합합니다. 시약이 잘 섞인 다음 35.5 μL을 판독판의 우물에 분배합니다.
      2. PCR 제품의 1 μL을 우물에 넣습니다. 또한, 물 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일 한 방울을 추가합니다.
      3. 분리 버퍼를 추가하는 분리 플레이트를 준비합니다.
      4. 유전자 분석기와 함께 포함된 상용 소프트웨어를 사용합니다(재료표참조). 새 샘플 플레이트를 만들고 플레이트의 모든 우물에 대한 샘플 이름을 저장합니다.
      5. 분석 방법을 선택합니다. 이 경우, 120s에 대해 90°C에서 샘플을 분해하고, 30초 동안 2.0kV에서 주입하고, 35분 동안 6.0kV로 분리한다.
      6. 유전자 분석기에 두 개의 플레이트를 삽입합니다. 모세관 배열을 증류수로 채웁니다.
      7. 특허받은 선형 폴리아크라이아미드(LPA) 젤을 적재한다. 마지막으로 실행을 클릭합니다.
    2. 젤 전기전증
      1. 1.5g의 분자생물학급 아가로즈를 1xTAE(Tris-아세테이트-EDTA) 전기포고리(40m Tris, 20mM 아세트산, 1mM EDTA pH 8.0)로 첨가하여 1%의 아가로즈 젤을 준비한다. 2-3 분 동안 전자 레인지 가열에 의해 아가로즈를 녹입니다.
      2. DNA를 시각화하려면 핵산 얼룩의 4 μL을 추가하고(재료 표 참조) 부드럽게 섞습니다.
      3. 사다리, 컨트롤 및 샘플을 위한 충분한 우물이 있는 젤 빗을 젤 트레이에 넣습니다. 그런 다음 젤 트레이 의 중간에 천천히 믹스를 붓고 거품을 피하십시오.
      4. 젤이 완전히 고화될 때까지 실온에서 30-45분 동안 젤을 식힙니다. 전기 전광 챔버에 젤을 소개하고, 젤 빗을 제거하고 젤을 덮을 충분한 1x TAE 버퍼로 챔버를 채웁니다.
        참고: 젤의 배치를 확인합니다. 우물은 음극쪽으로 부정적인 충전 된 DNA가 이동하기 때문에 부정적인 극에 가깝게 배치해야합니다.
      5. PCR 제품에 로딩 버퍼 5μL(0.1% (v/v) 브로모페놀 블루를 추가하고 잘 섞는다.
      6. 대역의 크기를 추정하려면 DNA 분자량 사다리의 5 μL을 적재합니다(재료 표참조).
      7. 샘플을 젤의 추가 우물에 적재합니다.
      8. 모든 샘플과 DNA 분자량 사다리가 로드되면, 블루 염료 라인이 젤의 길이약 75%가 될 때까지 90 V에서 1-1.5h로 젤을 실행합니다.
      9. 핵산에 대한 일루미에이터에서 밴드를 시각화합니다.

결과

살구의 수분 연구는마취(그림 1A)가발생하기 하루 전에 늦은 풍선 단계에서 꽃을 사용해야 합니다. 이 단계는 꽃가루와 피스티트 컬렉션 모두에 가장 유리한 것으로 간주됩니다, 꽃 무늬 구조는 거의 성숙하기 때문에, 하지만 anther dehiscence는 아직 발생하지 않았습니다. 이는 폐쇄된 꽃잎이 외부 꽃가루를 운반하는 곤충의 도착을 방해하기 때문에 같은 꽃가루뿐?...

토론

전통적으로, 대부분의 상업 살구 유럽 품종은 자기 호환36이었다. 그럼에도 불구하고, 지난 수십 년 동안 번식 프로그램에서 부모로서 북미 자가 호환되지 않는 품종의 사용은 알 수없는 수분 요구 사항7,,8,,37새로운자기 호환 품종의 증가의 출시 결과. 따라서 살구 품종에서 의외의 호환성 관계의 결정은 점점...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 장관 드 시엔시아에 의해 투자되었다, 혁신시온 y Universidades-유럽 지역 개발 기금, 유럽 연합 (AGL2016-77267-R, AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y 알리멘타리아 (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); 고비에르노 데 아라곤-유럽 사회 기금, 유럽 연합 (그루포 콘솔리다 A12_17R), 펀다시온 바이오 다이버 시다드, 그리고 아로즈구로 S.A.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose D1 Low EEOConda8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kitBiolineBIO-21060
Bright field microscopeLeica MicrosystemsDM2500
CEQ System SoftwareBeckman Coulter
DNeasy Plant Mini KitQIAGEN69106
dNTP Set, 4 x 25 µmolBiolineBIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400Beckman Coulter608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis SystemBeckman Coulter
GenomeLab Separation BufferBeckman Coulter608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1Beckman Coulter391438
HyperLadder 100bpBiolineBIO-33029
HyperLadder 1kbBiolineBIO-33025
Image Analysis SystemLeica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system Bio-Rad170-8640
NanoDrop One SpectrophotometerThermo Fisher Scientific13-400-518
pH-Meter BASIC 20Crison
Phusion High-Fidelity PCR KitThermo Fisher ScientificF553S
Power Pack P 25 TBiometra
Primer ForwardIsogen Life Science
Primer ReverseIsogen Life Science
Quantity One SoftwareBio-Rad
Stereoscopic microscopeLeica MicrosystemsMZ-16
Sub-Cell GTBio-Rad
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Taq DNA PolymeraseQIAGEN201203
Vertical Stand AutoclaveJP Selecta

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