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要約

蛍光顕微鏡による自己適合性とPCR分析によるS-遺伝子型の同定を組み合わせたアプリコット(プルヌスアルメニアカL.)品種の受粉要件を確立する方法論を提示する。

要約

酒さにおける自己非適合性は、主に多アレリック軌跡Sによって制御されるGametophytic自己非適合システム(GSI)によって決定される。アプリコットでは、重要な数の新しい品種が放出され、未知の受粉要件を持つ品種が増加しているため、自己および相互互換性関係の決定がますます重要になっています。ここでは、自己(in)の適合性を、手受粉法と顕微鏡による、PCR解析によるS-遺伝子型の同定と組み合わせた方法論を述べた。自己(in)適合性決定のために、各品種からのバルーンステージで花を現場に集め、実験室で手受粉し、固定し、蛍光顕微鏡下で花粉管の挙動を観察するためにアニリンブルーで染色した。品種間の非相溶性関係の確立のために、各品種からDNAを若葉から抽出し、S-アレスをPCRによって同定した。このアプローチは、非互換性グループを確立し、新しい果樹園の設計に適切な受粉者を選択し、繁殖プログラムで適切な親を選択するための貴重な情報を提供する品種間の非互換性関係を解明することができます。

概要

自己非適合性は、自己受粉を防ぎ、1を越えることを促進するために植物を開花させる戦略です。酒さでは、この機構は、主に多アレリック軌跡S22によって制御されるGametophytic自己非適合システム(GSI)によって決定される。この様式では、RNase遺伝子はS−sタイラー決定基であるRNase3をコードし3、一方、S−花粉決定基を決定するFボックスタンパク質は、SFB遺伝子4によって体系化される。自己非適合性相互作用は、排卵体5,6,6の受精を防止するスタイルに沿った花粉管の成長の阻害を通じて行われる。

アプリコットでは、品種の更新は、過去20年間で世界中で行われました7,,8.この重要な数の新しい品種の導入は、異なる公的および民間の繁殖プログラムから、未知の受粉要件を有するアプリコット品種の増加をもたらした8。

アプリコットの受粉要件を決定するために、さまざまな方法論が使用されてきました。この分野では、ケージの木や魅惑的な花の中で制御された花粉化によって自己(in)互換性が確立され、その後、果実セット99、10、11、1210,11,12の割合を記録することができる。また、半生体内の花の培養や蛍,光顕微鏡,8、13、14、15、16、1713,14,の下で花粉管挙動の分析によって実験室で制御された受粉が行われている。151617近年、PCR解析やシーケンシングなどの分子技術により、RNase遺伝子とSFB遺伝子18,19,の研究に基づく非相溶関係の特徴付けが可能となった。アプリコットでは、33個のS対立アレス(S1〜S S20、S S22〜S S30、S,52、S S53、S Sv、S Sx)が報告されている(S Sc)12、18、20、21、22、23、24。22,23,2412,18,2021,cこれまで、26の非適合群は、S-遺伝子,型8、9、17、25、26、279,17に従ってこの種で刺されています。,26,27825同じS-allelesSを持つ品種は相互に互換性がありませんが、少なくとも1つの異なるS-対立アレスを持つ品種は、異なる非互換性グループに割り当てられ、相互互換性があります。

アプリコット品種の受粉要件を定義するために、蛍光顕微鏡による自己適合性の決定とアプリコット品種におけるPCR分析によるS-遺伝子型の同定を組み合わせた方法論を記述する。このアプローチは、非互換性グループを確立し、品種間の非互換性関係を解明することができます。

プロトコル

1. 自己(in)互換性判定

  1. 畑の花を試す。気球段階で花を集める必要があります (図1A),アプリコット28のためのBBCHスケールのステージ58に対応し、不要な以前の受粉を避けるために.
  2. 実験室での自己受粉とクロス受粉
    1. バルーンステージで花のアンサーを取り除き、実験室の温度で乾燥させるために紙の上に置きます。
    2. 24時間後、細かいメッシュ(0.26mm)を用いて花粉粒をふるいにかける(図1B)。
    3. 自己受粉とクロス受粉のそれぞれについて同じバルーンステージで30本の花のグループをエマキュレートし、実験室の温度で水の中で花屋の泡にピスチルを置く(図1C)。
    4. 手は、同じ品種24時間後の花から花粉で絵筆の助けを借りて、ピステイルを受粉させる。さらに、各品種の別のピスチルのセットを、コントロールとして互換性のある受粉者の花から花粉で受粉する(図1D)。
    5. 72時間後、4°C29で少なくとも24時間エタノール/酢酸(3:1)の固定溶液中のピスチルを固定する。その後、固定液を捨て、75%のエタノールを加えて、サンプルが溶液に完全に沈み込まないようにします。サンプル,は、8、17、30、31、32,17,30,31を使用するまで4°Cでこの溶液中で保存することができます。32
  3. 体外花粉の発芽による花粉の生存率の評価
    1. 発芽培地を調製するために、スクロースの重量25g、ホウ酸の0.075g(H33BO3)および0.075gの硝酸カルシウム(Ca(NO33)2)33。233
    2. 250mLの蒸留水に培地の成分を加え、完全に溶解します。
    3. アガロースの2gを加えた培地を固め、渦巻いて混ぜます。
    4. pHメーターを使用して培地のpHを確認し、NaOHまたはHCl溶液で値を7.0に調整します。
    5. 混合物をオートクレーブして培地を殺菌する。
    6. オートクレーブ処理後、培地を冷やして、滅菌層流れフードでペトリ皿に配ります。
    7. 固化花粉発芽培地で制御された花粉に使用される同じ品種の花粉粒を散乱し、24時間6後に顕微鏡下でそれらを観察する。
      注:ラミナルフローフードを殺菌するには、70%エタノールで表面を清掃し、10分の間にUVランプをオンにします。
    8. ペトリ皿は使用するまで4°Cの冷蔵庫に保管してください。
  4. 顕微鏡観察
    1. 蒸留水で1時間3回ニスティルを洗浄し、4°Cで5%硫酸ナトリウムに入れておきます。24時間後、10分の間に1kg/cm22でオートクレーブし、組織34を軟化させる。
    2. ガラススライドの上にオートクレーブのピスティルを置き、メスの助けを借りて、花粉管のより良い視覚化を得るために卵巣の周りの毛状突起を取り除きます。次に、カバーガラスでカステイルを押しつぶします。
    3. 0.1%(v/v)アニリンブルー染色を準備する:0.1 Nリン酸カリウム3塩基の100 mLにアニリンブルーの0.1mLを混ぜる(K3PO4)。花粉管の成長中にカロース堆積物を染色する製剤の上にアニリンブルーの滴を適用します。
    4. 340-380バンドパスと425のロングパスフィルターを使用して、UV発蛍光を用いた顕微鏡でスタイルに沿って花粉管を観察します。

2. DNA抽出

  1. 春のフィールドでサンプル2-3の葉。得られたDNAは古い葉と比較してより高品質で低いレベルのフェノール化合物であるため、若い段階で葉をサンプリングすることをお勧めします。
  2. 市販キットに記載されている手順に従ってゲノムDNAを抽出する(材料表を参照)。
  3. UV-vis分光光度計(260nm)を用いてDNA濃度の量と質を解析します。

3. S-アレーレ識別

  1. PCR 反応の設定
    1. 各DNA抽出サンプルの蒸留水に50 ng/μLの希釈液を調製します。
    2. PCR試薬をゆっくりと解凍し、氷の上に保管してください。必要になるまで、DNAポリメラーゼを冷凍庫に入れておきます。
    3. プライマーの異なる組み合わせを使用して増幅反応を準備します。表 1のコンポーネントを組み合わせて PCR 反応ミックスを作成します。PCR反応をよく混合し、プライマーの異なる組み合わせに対して示された体積をPCRプレートの各ウェルに分配します。次に、各ウェルに1μLのDNA希釈液を加える。
    4. PCR プレートをサーモサイクラーに入れ、表 1に示す対応する PCR プログラムを実行します。
  2. 増幅された断片を分析します。PCR増幅断片を分析する方法は主に2種類あります:蛍光標識プライマーを用いたキャピラリー電気泳動(CE)または標識されていないプライマーを有するアガロースゲル電気泳動のアンプリコンを可視化する方法があります。
    1. 毛細管電気泳動
      1. ローディングバッファを準備するには、35 μLの脱イオン化ホルムアミドを0.45 μLのラベル付きサイジング規格と混合します。試薬をよく混ぜ合わせ、35.5 μLをリーダープレートのウェルに分配する。
      2. 1 μLの PCR産物をウェルに加えます。また、水の蒸発を防ぐために、ミネラルオイルの滴を追加します。
      3. 分離用のプレートを用意し、分離バッファーを追加します。
      4. 遺伝子分析装置に付属する商用ソフトウェアを使用します (材料表を参照)。新しいサンプルプレートを作成し、プレート上のすべてのウェルのサンプル名を保存します。
      5. 分析方法を選択します。この場合、サンプルを120sの90°Cで変性し、2.0kVで30sで注入し、6.0kVで35分間分離する。
      6. 2つのプレートを遺伝子分析装置に挿入します。キャピラリーアレイに蒸留水を充填します。
      7. 特許取得済みのリニアポリアクリルアミド(LPA)ゲルをロードします。最後に、[ファイルを実行] をクリックします。
    2. ゲル電気泳動
      1. 1x TAE(トリス-アセテート-EDTA)の150 mLに1.5gの分子生物学グレードアガロースを加える1%アガロースゲルを調製します(40 mM Tris、20 mM酢酸、およびpH 8.0で1mM EDTA)。2~3分間マイクロ波加熱でアガロースを溶かします。
      2. DNAを可視化するには、核酸染色体を4μL加え(材料表を参照)、軽く混ぜます。
      3. はしご、コントロール、サンプルに十分なウェルを備えたゲルコームをゲルトレイに追加します。その後、ゆっくりとゲルトレイの中央にミックスを注ぎ、泡を避けます。
      4. ゲルが完全に固まるまで、ゲルを室温で30〜45分間冷却します。電気泳動チャンバにゲルを導入し、ゲルコームを取り外し、ゲルを覆うのに十分な1x TAEバッファーでチャンバーを満たします。
        注:ゲルの配置を確認してください。負に荷電したDNAが陰極に向かって移動するので、井戸は負極の近くに置かれるべきです。
      5. PCR製品に5μLのローディングバッファー(0.1%(v/v)ブロモフェノールブルー)を加え、よく混ぜます。
      6. バンドのサイズを推定するには、DNA分子量ラダーの5 μLをロードします(材料表を参照)。
      7. サンプルをゲルの追加ウェルにロードします。
      8. すべてのサンプルとDNA分子量ラダーをロードしたら、青い染料線がゲルの約75%の長さになるまで、ゲルを1〜1.5時間90Vで実行します。
      9. 核酸のトランスイルミニューエーターでバンドを視覚化します。

結果

アプリコットの受粉研究は、麻酔の前日に風船の後期段階で花を使用する必要があります(図1A)。花の構造はほぼ成熟しているので、この段階は花粉とピスティルコレクションの両方にとって最も有利であると考えられていますが、アンサーの非難はまだ起こっていません。これは、閉じた花びらは外部花粉を運ぶ昆虫の到着を妨げるので、同じ花から花粉?...

ディスカッション

伝統的に、ほとんどの市販アプリコットヨーロッパの品種は、自己互換性のある36でした。それにもかかわらず、過去数十年の繁殖プログラムにおける親としての北米の自己適合性品種の使用は、未知の受粉要件77、8、378,37を持つ新しい自己互換性のない品種の増加をもたらした。したがって、アプリコ?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、シエンシア大臣、イノベルシダーデス・イ・ウニバーシダーデス・ヨーロピアン地域開発基金、欧州連合(AGL2016-77267-R、AGL2015-74071-JIN)によって資金提供されました。インスティトゥート・ナシオナル・デ・インベスティガシオン・イ・テクノロジア・アグラリア・イ・アリメンタリア(RFP2015-00015-00,RTA2017-00003-00);ゴビエルノ・デ・アラゴン・ヨーロピアン・ソーシャル・ファンド、欧州連合(グルポ・コンソリダド・A12_17R)、フンダシオン・バイオディビジダード、アグロゼグロS.A.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose D1 Low EEOConda8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kitBiolineBIO-21060
Bright field microscopeLeica MicrosystemsDM2500
CEQ System SoftwareBeckman Coulter
DNeasy Plant Mini KitQIAGEN69106
dNTP Set, 4 x 25 µmolBiolineBIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400Beckman Coulter608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis SystemBeckman Coulter
GenomeLab Separation BufferBeckman Coulter608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1Beckman Coulter391438
HyperLadder 100bpBiolineBIO-33029
HyperLadder 1kbBiolineBIO-33025
Image Analysis SystemLeica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system Bio-Rad170-8640
NanoDrop One SpectrophotometerThermo Fisher Scientific13-400-518
pH-Meter BASIC 20Crison
Phusion High-Fidelity PCR KitThermo Fisher ScientificF553S
Power Pack P 25 TBiometra
Primer ForwardIsogen Life Science
Primer ReverseIsogen Life Science
Quantity One SoftwareBio-Rad
Stereoscopic microscopeLeica MicrosystemsMZ-16
Sub-Cell GTBio-Rad
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Taq DNA PolymeraseQIAGEN201203
Vertical Stand AutoclaveJP Selecta

参考文献

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