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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methodik vor, um die Bestäubungsanforderungen vonAprikosensorten (Prunus armeniaca L.) zu ermitteln, die die Bestimmung der Selbstverträglichkeit durch Fluoreszenzmikroskopie mit der Identifizierung des S-Genotyps durch PCR-Analyse kombinieren.

Zusammenfassung

Die Selbstinkompatibilität in Rosaceae wird durch ein Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) bestimmt, das hauptsächlich vom multiallelic locus S gesteuert wird. In Der Aprikosen-Aprikosen-Beziehung wird die Bestimmung von Selbst- und Inter-(In-)Kompatibilitätsverhältnissen immer wichtiger, da die Freisetzung einer bedeutenden Anzahl neuer Sorten zu einer Zunahme von Sorten mit unbekannten Bestäubungsanforderungen geführt hat. Hier beschreiben wir eine Methodik, die die Bestimmung der Selbstverträglichkeit durch Handbestäubungen und Mikroskopie mit der Identifizierung des S-Genotypsdurch PCR-Analyse kombiniert. Zur Selbst-(In-)Kompatibilitätsbestimmung wurden im Ballonstadium aus jeder Sorte Blumen aus jeder Sorte gesammelt, im Labor von Hand bestäubt, fixiert und mit Anilineblau für die Beobachtung des Pollenrohrverhaltens unter der Fluoreszenzmikroskopie gefärbt. Für die Herstellung von Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten wurde DNA aus jeder Sorte Saus jungen Blättern extrahiert und S-Allele wurden von PCR identifiziert. Dieser Ansatz ermöglicht die Einrichtung von Inkompatibilitätsgruppen und die Aufklärung von Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten, die eine wertvolle Information liefern, um geeignete Bestäubern bei der Gestaltung neuer Obstgärten zu wählen und geeignete Eltern in Zuchtprogrammen auszuwählen.

Einleitung

Selbstinkompatibilität ist eine Strategie der Blühenden Pflanzen, um Selbstbestäubung zu verhindern und Outcrossing1zu fördern. In Rosaceae wird dieser Mechanismus durch ein Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) bestimmt, das hauptsächlich durch den multiallelic locus S2gesteuert wird. Im Stil kodiert das RNase-Gen den S-s-Tylar-Determinanten, eine RNase3, während ein F-Box-Protein, das die S-Pollen-Determinantebestimmt, durch das SFB-Gen 4kodifiziert wird. S-s Die Selbstinkompatibilitätsinteraktion erfolgt durch die Hemmung des Pollenrohrwachstums entlang des Stils, der die Befruchtung der Ovule5,6verhindert.

In Der Aprikosen-Aprikosen-Aprikosen-Erneuerung hat in den letzten zwei Jahrzehnten weltweit eine Sortenerneuerung stattgefunden7,8. Diese Einführung einer wichtigen Anzahl neuer Sorten, aus verschiedenen öffentlichen und privaten Zuchtprogrammen, hat zu einer Zunahme von Aprikosensorten mit unbekannten Bestäubungsanforderungen geführt8.

Verschiedene Methoden wurden verwendet, um den Bestäubungsbedarf in Aprikosen zu bestimmen. Im Feld kann die Selbstverträglichkeit durch kontrollierte Bestäubungen in Käfigbäumen oder in entkalkten Blüten festgestellt werden und anschließend den Prozentsatz der Fruchtmenge9,10,11,12. Darüber hinaus wurden kontrollierte Bestäubungen im Labor durch semi-in vivo Kultur von Blumen und Analyse des Pollenrohrverhaltens unter Fluoreszenzmikroskopie8,13,14,15,16,17durchgeführt. In jüngster Zeit haben molekulare Techniken wie PCR-Analyse und Sequenzierung die Charakterisierung von Inkompatibilitätsbeziehungen ermöglicht, die auf der Untersuchung der RNase- und SFB-Gene 18,19basieren. In Aprikosen wurden 33 S-Allele gemeldet (S1 bis S20, S22 bis S30, S52, S53, Sv, Sx), einschließlich eines Alleels im Zusammenhang mit Selbstkompatibilität (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Bisher wurden 26 Inkompatibilitätsgruppen in dieser Art nach dem S-Genotyp8, S9,,17,25,26,27festgestellt. Sorten mit den gleichen SS-Allelen sind miteinander kompatibel, während Sorten mit mindestens einem anderen S-Allel, die in verschiedenen inkompatiblen Gruppen zugeordnet sind, miteinander kompatibel sind. S

Um die Bestäubungsanforderungen von Aprikosensorten zu definieren, beschreiben wir eine Methode, die die Bestimmung der Selbstverträglichkeit durch S-Fluoreszenzmikroskopie mit der Identifizierung des S-Genotyps durch PCR-Analyse in Aprikosensorten kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht die Etablierung von Inkompatibilitätsgruppen und die Aufklärung von Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten.

Protokoll

1. Selbst-(In-)Kompatibilitätsbestimmung

  1. Probieren Sie die Blumen auf dem Feld. Es ist notwendig, die Blumen in ballonPhase zu sammeln (Abbildung 1A), entsprechend Stufe 58 auf der BBCH-Skala für Aprikosen28, um unerwünschte vorherige Bestäubung zu vermeiden.
  2. Selbst- und Kreuzbestäubungen im Labor
    1. Entfernen Sie die Anther der Blumen im Ballonstadium und legen Sie sie auf ein Stück Papier, um bei Labortemperatur zu trocknen.
    2. Nach 24 h die Pollenkörner mit einem feinen Maschen (0,26 mm)(Abbildung 1B) absieben
    3. Entleeren Sie eine Gruppe von 30 Blüten in der gleichen Ballonstufe für jede Selbstbestäubung und Kreuzbestäubung und legen Sie die Stempel auf Floristschaum in Wasser bei Labortemperatur (Abbildung 1C).
    4. Hand bestäuben die Stempel mit Hilfe eines Pinsels mit Pollen aus Blüten der gleichen Sorte 24 h nach der Entstung. Darüber hinaus bestäuben Sie einen weiteren Satz von Stempeln jeder Sorte mit Pollen aus Blüten eines kompatiblen Bestäubern als Kontrolle (Abbildung 1D).
    5. Nach 72 h die Stempel in einer fixativen Lösung von Ethanol/Essigsäure (3:1) für mindestens 24 h bei 4 °C29fixieren. Dann entsorgen Sie das Fixativ und fügen Sie 75% Ethanol hinzu, um sicherzustellen, dass die Proben vollständig in die Lösung eingetaucht sind. Proben können in dieser Lösung bei 4 °C bis zum Gebrauchvon 8,17,30,31,32konserviert werden.
  3. Bewertung der Tragfähigkeit von Pollen durch In-vitro-Pollenkeimung
    1. Zur Herstellung des Keimmediums Gewicht 25 g Saccharose, 0,075 g Borsäure (H3BO3) und 0,075 g Calciumnitrat (Ca(NO3)2) 33.
    2. Fügen Sie die Komponenten des Mediums in 250 ml destilliertem Wasser hinzu und lösen Sie sie vollständig auf.
    3. Erstarren Sie das Medium, das 2 g Agarose hinzufügt, und mischen Sie es durch Wirbeln.
    4. Überprüfen Sie den pH-Wert des Mediums mit einem pH-Messgerät und stellen Sie den Wert mit NaOH- oder HCl-Lösung auf 7,0 ein.
    5. Autoclave die Mischung, um das Medium zu sterilisieren.
    6. Nach dem Autoklavieren das Medium abkühlen und in einer sterilen laminaren Fließhaube in Petrischalen verteilen.
    7. Streuen Sie die Pollenkörner der gleichen Sorten, die für die kontrollierten Bestäubungen im erstarrten Pollenkeimungsmedium verwendet werden, und beobachten Sie sie nach 24 h6unter dem Mikroskop.
      HINWEIS: Um die laminare Durchflusshaube zu sterilisieren, reinigen Sie die Oberfläche mit 70% Ethanol und schalten Sie die UV-Lampe während 10 min ein.
    8. Die Petri-Gerichte bis zum Gebrauch im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahren.
  4. Mikroskopische Beobachtungen
    1. Die Stempel dreimal 1 h mit destilliertem Wasser waschen und bei 4 °C in 5% Natriumsulfit lassen. Nach 24 h, autoklavieren Sie sie bei 1 kg/cm2 während 10 min in Natriumsulfit, um das Gewebe zu erweichen34.
    2. Legen Sie die autoklavierten Stempel über eine Glasrutsche und entfernen Sie mit Hilfe eines Skalpells die Trichome um den Eierstock, um eine bessere Visualisierung der Pollenröhren zu erhalten. Dann die Stempel mit einem Deckglas zerquetschen.
    3. 0,1% (v/v) anilineblauer Fleck vorbereiten: 0,1 ml Aniinblau in 100 ml 0,1 N Kaliumphosphat-Tribasis (K3PO4) mischen Tragen Sie einen Tropfen Anilineblau über die Präparate auf, um Callose-Ablagerungen während des Pollenrohrwachstums zu färben.
    4. Beobachten Sie die Pollenröhren entlang des Stils durch ein Mikroskop mit UV-Epifluoreszenz mit 340-380 Bandpass und 425 Langpassfiltern.

2. DNA-Extraktion

  1. Probe 2-3 Blätter im Feld im Frühjahr. Es wird empfohlen, die Blätter in jungen Stadien zu beproben, da die erhaltene DNA von höherer Qualität und niedrigeren Konzentrationen von Phenolverbindungen im Vergleich zu alten Blättern ist.
  2. Extrahieren Sie Genomische DNA nach den schritten, die in einem handelsüblichen Kit beschrieben sind (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Analysieren Sie die Quantität und Qualität der DNA-Konzentrationen mit dem UV-Vis-Spektrophotometer (260 nm).

3. SS-Allel-Identifikation

  1. Einrichten der PCR-Reaktionen
    1. Bereiten Sie eine Verdünnung von 50 ng/L in destilliertem Wasser jeder DNA-Extraktionsprobe vor.
    2. Die PCR-Reagenzien langsam auftauen und auf Eis halten. Lassen Sie die DNA-Polymerase im Gefrierschrank, bis sie benötigt wird.
    3. Bereiten Sie die Amplifikationsreaktionen mit den verschiedenen Kombinationen von Primern vor. Erstellen Sie den PCR-Reaktionsmix, indem Sie die Komponenten in Tabelle 1kombinieren. Vortex die PCR-Reaktion gut mischen und verteilen Sie das Volumen für die verschiedenen Kombinationen von Primern auf jeden Brunnen der PCR-Platte angegeben. Fügen Sie dann in jedem Brunnen 1 L der DNA-Verdünnung hinzu.
    4. Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie das entsprechende PCR-Programm aus, das in Tabelle 1dargestellt ist.
  2. Analysieren Sie die verstärkten Fragmente. Es gibt hauptsächlich zwei verschiedene Möglichkeiten, die PCR-verstärkten Fragmente zu analysieren: Kapillarelektrophorese (CE) mit fluoreszierend gekennzeichneten Primern oder als visualisierende Amplicons der Agarose-Gel-Elektrophorese mit nicht gekennzeichneten Primern.
    1. Kapillarelektrophorese
      1. Zur Vorbereitung des Ladepuffers 35 l entionisiertes Formamid mit 0,45 l beschrifteten Größenstandard mischen. Das Reagenz gut zu mischen, und geben Sie dann 35,5 l in den Brunnen der Leseplatte.
      2. Fügen Sie 1 L des PCR-Produkts in den Brunnen ein. Darüber hinaus fügen Sie einen Tropfen Mineralöl hinzu, um eine Verdunstung von Wasser zu verhindern.
      3. Bereiten Sie die Trennplatte vor, die einen Trennpuffer hinzufügt.
      4. Verwenden Sie die kommerzielle Software, die im Genanalysator enthalten ist (siehe Tabelle der Materialien). Erstellen Sie eine neue Probenplatte und speichern Sie die Probennamen für alle Brunnen auf der Platte.
      5. Wählen Sie die Analysemethode aus. In diesem Fall denaturieren Sie die Proben bei 90 °C für 120 s, injizieren Bei 2,0 kV für 30 s und trennen Sie bei 6,0 kV für 35 min.
      6. Setzen Sie die beiden Platten in den Genanalysator ein. Füllen Sie das Kapillararray mit destilliertem Wasser.
      7. Laden Sie das patentierte lineare Polyacrylamid (LPA) Gel. Klicken Sie schließlich auf Ausführen.
    2. Gelelektrophorese
      1. Bereiten Sie ein 1% Agarose-Gel zu, das 1,5 g molekularbiologische Sanarose in 150 ml 1x TAE (Tris-Acetat-EDTA) Elektrophorese-Laufpuffer (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA bei pH 8,0) hinzufügt. Lösen Sie die Agarose durch Mikrowellenheizung für 2-3 min.
      2. Um die DNA zu visualisieren, fügen Sie 4 L eines Nukleinsäureflecks hinzu (siehe Tabelle der Materialien) und mischen Sie sanft.
      3. Fügen Sie einen Gelkamm mit ausreichenden Brunnen für Leitern, Steuerungen und Proben in ein Geltablett ein. Dann gießen Sie langsam die Mischung in die Mitte des Geltabletts und vermeiden Sie Blasen.
      4. Lassen Sie das Gel 30-45 min bei Raumtemperatur abkühlen, bis das Gel vollständig erstarrt ist. Führen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer ein, entfernen Sie den Gelkamm und füllen Sie die Kammer mit genügend 1x TAE Puffer, um das Gel zu bedecken.
        HINWEIS: Überprüfen Sie die Platzierung des Gels. Die Brunnen sollten in der Nähe des negativen Pols platziert werden, da negativ geladene DNA zur Kathode wandert.
      5. Den PCR-Produkten 5 l Ladepuffer (0,1% (v/v) Bromophenolblau) hinzufügen und gut mischen.
      6. Um die Größe der Bänder zu schätzen, laden Sie 5 l DNA-Molekulargewichtsleiter (siehe Tabelle der Materialien).
      7. Die Proben in die zusätzlichen Brunnen des Gels laden.
      8. Sobald alle Proben und die DNA-Molekulargewichtsleiter geladen sind, führen Sie das Gel bei 90 V für 1-1,5 h, bis die blaue Farbstofflinie etwa 75% der Länge des Gels beträgt.
      9. Visualisieren Sie die Bänder in einem Transilluminator für Nukleinsäuren.

Ergebnisse

Bestäubungsstudien an Aprikosen erfordern die Verwendung von Blumen im späten Ballonstadium einen Tag vor der Anthese (Abbildung 1A). Diese Phase gilt als die günstigste für Pollen und Stempel Sammlung, da florale Strukturen sind fast ausgereift, aber Anther Dehiscence hat noch nicht stattgefunden. Dies verhindert die Interferenz unerwünschter Pollen, nicht nur von Pollen aus der gleichen Blüte, sondern auch von anderen Blüten, da die geschlossenen Blütenblätter die...

Diskussion

Traditionell waren die meisten kommerziellen Aprikosen-Sorten in Europa selbstkompatibel36. Nichtsdestotrotz hat die Verwendung von nordamerikanischen selbstinkompatiblen Sorten als Eltern in Zuchtprogrammen in den letzten Jahrzehnten zur Freisetzung einer wachsenden Anzahl neuer selbstinkompatibler Sorten mit unbekannten Bestäubungsanforderungen7,8,37geführt. So wird die Bestimmung von Selbst- und Inte...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades-European Regional Development Fund, European Union (AGL2016-77267-R und AGL2015-74071-JIN) finanziert. Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologa Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragén-Europäischer Sozialfonds, Europäische Union (Grupo Consolidado A12_17R), Fundacion Biodiversidad und Agroseguro S.A.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose D1 Low EEOConda8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kitBiolineBIO-21060
Bright field microscopeLeica MicrosystemsDM2500
CEQ System SoftwareBeckman Coulter
DNeasy Plant Mini KitQIAGEN69106
dNTP Set, 4 x 25 µmolBiolineBIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit - 400Beckman Coulter608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis SystemBeckman Coulter
GenomeLab Separation BufferBeckman Coulter608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1Beckman Coulter391438
HyperLadder 100bpBiolineBIO-33029
HyperLadder 1kbBiolineBIO-33025
Image Analysis SystemLeica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system Bio-Rad170-8640
NanoDrop One SpectrophotometerThermo Fisher Scientific13-400-518
pH-Meter BASIC 20Crison
Phusion High-Fidelity PCR KitThermo Fisher ScientificF553S
Power Pack P 25 TBiometra
Primer ForwardIsogen Life Science
Primer ReverseIsogen Life Science
Quantity One SoftwareBio-Rad
Stereoscopic microscopeLeica MicrosystemsMZ-16
Sub-Cell GTBio-Rad
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Taq DNA PolymeraseQIAGEN201203
Vertical Stand AutoclaveJP Selecta

Referenzen

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