用于研究和教育应用的定制微流体器件的快速制造

摘要

在这里，我们提出一个协议，以最小的财务和时间投资设计和制造定制微流体器件。其目的是促进在生物医学研究实验室和教育环境中采用微流体技术。

摘要

微流体设备允许在纳米到亚毫米尺度的通道中操作流体、颗粒、细胞、微型器官或生物体。在生物科学中，这种技术的使用迅速增加，这促使人们需要各种研究团体都能使用的方法。目前的制造标准（如 PDMS 粘合）需要昂贵且耗时的光刻和粘接技术。一个可行的替代方法是使用易于经济实惠、需要极少专业知识且能够快速迭代设计的设备和材料。在本工作中，我们描述了用于设计和生产 PET 层压板 （PETL） 的协议，这种微流体器件价格低廉，易于制造，并且比其他微流体技术方法的生成时间少得多。它们由热粘结膜片组成，其中通道和其他特征使用工艺切割机定义。PETL 可解决特定于现场的技术挑战，同时显著减少采用的障碍。这种方法有助于微流体设备在研究和教育环境中的可及性，为新的调查方法提供了一个可靠的平台。

引言

微流体在小尺度上实现流体控制，体积范围从微升（1 x 10^-6 L）到比奥利特（1 x 10^-12 L）。这种控制之所以成为可能，部分是由于微^{处理器工业1}所采用的微制造技术的应用。使用微型通道和腔室网络，用户可以利用小尺寸特征的明显物理现象。例如，在微米尺度上，流体可以使用层流进行操作，其中粘性力主导惯性力。因此，扩散传输成为微流体学的突出特征，可以定量和实验地进行研究。这些系统可以使用菲克定律、布朗运动理论、热方程和/或纳维尔-斯托克斯方程正确理解，它们是流体力学和运输^现象2领域的重要推导。

由于生物科学中的许多团体在微观层面上研究复杂的系统，最初认为微流体装置会对^{生物学2、3}的研究应用产生立竿见影和重大的影响。这是因为扩散在小分子在膜或细胞内传输中占主导地位，细胞和微生物的尺寸是亚毫米系统和设备的理想匹配。因此，在加强细胞和分子实验的方式方面有着巨大的潜力。然而，生物学家广泛采用微流体技术，已经落后于^预期4。缺乏技术转让的一个简单原因可能是工程师和生物学家之间的学科界限。定制设备设计和制造一直超出了大多数生物研究组的能力，因此依赖于外部的专业知识和设施。不熟悉潜在的应用程序、成本和设计迭代所需的时间也是新采用者面临的重大障碍。这些障碍很可能破坏了创新，阻碍了微流体学在生物科学中应对挑战的广泛应用。

一个例子:自20世纪90年代末以来，软光刻一直是微流体器件制造的首选方法。PDMS（聚二甲基硅氧烷，一种硅基有机聚合物）是一种广泛使用的材料，因为它的物理特性，如透明度，变形性和生物相容^性5。该技术取得了巨大的成功，芯片上的实验室和片上的器官器件不断^{在这个平台上}开发。然而，大多数从事这些技术研究的团体都存在于工程部门，或与它们有着密切^的联系。光刻通常需要洁净室来制造模具和专门的粘接设备。对于许多组来说，由于资本成本和提前期，标准 PDMS 设备不太理想，尤其是在需要重复修改设计时。此外，对于普通生物学家和无法进入专业工程实验室的学生来说，这项技术大多无法获得。有人建议，要广泛采用微流体装置，必须模仿生物学家常用材料的一些特性。例如，用于细胞培养和生物测定的聚苯乙烯价格低廉，一次性，适合大规模生产。相比之下，基于PDMS的微流体的工业制造由于机械柔软性、表面处理不稳定性和气体渗透性^而一直未能实现。由于这些限制，并旨在解决技术挑战使用定制设备内置"内部"，我们描述了一种替代方法，利用xrxxxxxx7，8，9协议和热层压。该方法在资金和时间投入少时即可采用。

PETL 是使用聚乙烯对苯二甲酸酯 （PET） 薄膜制造的，薄膜上涂有热粘性乙烯醋酸乙烯 （EVA）。这两种材料都广泛用于消费品，具有生物相容性，并且以最低的^{价格为10。"}PET/EVA 薄膜可以以层压袋或卷筒的形式获得。使用在业余爱好者或工艺商店中常见的计算机控制的工艺切割机，从一张薄膜片中剪出通道，以定义设备的^架构11。然后，通过应用使用（办公室）热层压（图 1A） 粘合的附加薄膜（或玻璃）层来密封通道。增加了穿孔、自粘的乙烯基保险杠，以方便进入通道。制造时间从 5 分钟到 15 分钟不等，因此可以快速进行设计迭代。用于制造 PETL 的所有设备和材料都是商业上可及且经济实惠的（<350 美元起拍成本，而光刻的 USD 为数千美元）。因此，PETL为传统微流体引起的两个主要问题提供了一种新解决方案:可负担性和时间有效性（参见补充表1、2中的PDMS/PETL比较）。

除了为研究人员提供设计和制造自己设备的机会外，PETL 还可以轻松地在课堂上采用，因为它们使用简单直观。PETLs可以包括在高中和大学^课程8，其中他们被用来帮助学生更好地了解物理，化学和生物的概念，如扩散，层流，微混合，纳米粒子合成，梯度形成和化学。

在本工作中，我们将说明制造具有不同复杂程度的 PETL 模型芯片的总体工作流程。第一个装置用于促进小室中细胞和微器官的成像。第二种更复杂的装置由多层和材料组成，用于研究微^化学9。最后，我们构建了一个用于教育目的的装置，用于显示多个流体动力学概念（流体动力学对焦、层流、扩散传输和微混合）。此处介绍的工作流程和设备设计可轻松定制，用于研究和课堂环境中的各种用途。

研究方案

1. 设计

1. 确定设备的应用程序，并列出所需的通道/腔室组件。
   注:所有设备都需要输入和输出通道。用于显微镜的设备需要成像室。更复杂的设备需要位于多层的通道和腔室。
2. 首先手动绘制每个图层，考虑设备的功能如何受到图层叠加的影响。
3. 使用任何允许绘制线条和形状的软件在计算机上绘制最终设计。
   1. 使用没有阴影的黑色、实线和形状分别绘制每个图层。建议线厚度为 6 点或更多。在此阶段，通道和腔室特征的尺寸不如整体比例重要。
   2. 创建要素和叠加图层时，请使用复制和粘贴功能。有关图层图纸的示例，请参阅图 1B。
4. 将每一层导入工艺切割机软件 （图 1C）。为此，请对绘制的设计进行屏幕截图，并使用拖放方法。
   1. 在工艺切割机软件中创建新文档（免费下载）。将图像文件放在显示的垫子上。该软件将识别大多数图像文件。
   2. 放大图像，通过从角拉出来简化处理。现在，软件可以使用跟踪功能识别该设计。
      注:用户可以直接在此软件上生成 de novo 设计（在设计调色板中使用绘图工具）。
5. 要跟踪设计，请选择窗口右侧的"跟踪"图标（蝴蝶形状），然后完全选择导入的设计。
   1. 选择标记为"轮廓"的"跟踪预览"选项。调整（如果需要）阈值和缩放设置以调整黄色跟踪以匹配设计。
   2. 黄色跟踪与设计匹配后，从"跟踪"菜单中选择"跟踪"。通道现在显示为红色轮廓。如果红色轮廓与设计匹配，则可以选择和删除导入的图像。现在已导入设计，并准备好调整大小。
6. 通过选择跟踪设计并使用软件提供的网格调整设备的大小。拉动以更改通道和腔室的宽度和长度。
   注:该软件提供测量，可以临时绘制小线（使用窗口左侧的设计调色板）来测量设备内的尺寸。功能通道宽度尺寸范围从100μm到900μm。尺寸可能需要在测试初始原型后进行调整。重要的是，所有图层的大小都成比例，以确保在装配过程中正确对齐。
   1. 正确调整设计尺寸后，选择形状绘图菜单上的方形工具，以在设备的每一层周围绘制一个正方形/矩形。对于所有图层，此形状的大小应相同。有关示例，请参阅图 1C。
7. 创建包含对通道的访问端口的单独顶层。简单的设计将包括主（中间）通道层、底部密封层（通常是玻璃层）和顶层，该层应包含圆形穿孔以进入通道（入口/出口）。
   注:包含三个以上层的设计需要多个层的入口/出口穿孔（参见图1C，图5A）。这些穿孔可能已包含在设计中，也可以此时添加。
   1. 选择屏幕左侧的绘图工具。在设计入口和出口口上画圆圈。
   2. 复制并粘贴原始设计和圆形。从基础设备擦除通道。
      注: 这会使入口/出口端口处于与原始设计相对应的正确位置。也可以将形状添加到每个图层的外围，以帮助对齐。
8. 将要剪切的所有图层排列在显示的垫子上。设备现已准备好进行切割。

2. 切割

1. 在胶粘剂切割垫上涂抹一块首选厚度（3 mil 标准）的 PET/EVA 薄膜（或其他材料）。确保胶粘剂（哑光）侧朝上，塑料（闪亮）侧朝下。
   注意:使用干净的手套，避免将油和微粒引入层。
2. 将薄膜平平在垫子上（图1D），去除所有可能被困的空气。这可以用戴手套的手或滚筒来完成。
3. 将切割垫的边缘与刀具上指示的线对齐。按刀具上的负载垫来装载垫子。根据薄膜厚度，将切割刀片上的设置保持在 3 到 5 之间。
4. 将刀具 USB 电缆连接到计算机。
   1. 选择"发送"选项卡并选择切割设置。
      注: 级联菜单上有多种设置可用。-标签纸，透明- 是一种与厚度为 3~5 mil （75–125 μm） 的 PET/EVA 薄膜配合良好的设置。修改不同材质的设置，并保存自定义设置以供将来使用。
5. 单击"发送"。切割将开始 （图 1E）.确保刀具背面有足够的空间让垫子畅通无阻地移动。刀具完成后，通过选择"在刀具上卸载"来卸载垫。卸载前不要将垫子拉出。

3. 对齐

1. 将切割垫放在干净的表面旁边。用戴手套的手，使用一对钳子将微流体装置的每一层从切割垫上提起（图1F）。在通道中转弯和弯曲时要特别小心;这些是特别微妙的，容易撕裂和翘曲。
2. 将微流体装置的层放在干净的表面上。根据设备中的从上到下位置对其进行排序（图 1G、图2A、图 5A和图 7A）。
3. 切割小件（±3 毫米 x 10 毫米）的双面胶带，用于暂时将层连接在一起。
4. 逐个叠加图层，从底部图层开始。将一小块双面胶带添加到层之间的一个角上，远离任何通道或入口/出口（图1G，箭头）。磁带虽然不是必需的，但会固定层，并确保它们不会在层压过程中移动。使用线形夹具促进具有 4 个以上层的设备中的层对齐（补充图 3）。
5. 确保薄膜的胶粘剂（哑光-EVA）侧始终面向设备的内部（层内部分）。
   注意:裸露的粘合剂会熔化压片的内部部件并粘附在层压器上，不仅导致设备丢失，还会影响层压器的未来性能。
6. 叠加所有图层后，检查设备。所有图层之间应至少有一个 EVA 侧，并且不应公开 EVA。在引入非 EVA 涂层材料（例如聚氯乙烯 （PVC） 薄膜、玻璃时，可能需要两侧涂有 EVA 的薄膜，尤其是对于更复杂的设备（图 5）。

4. 层压

1. 打开，并将层压器设置为所需的厚度设置。有些层压器提供 3 和 5 mil 设置，而有些则不提供。对于任何具有 4 个或更多图层的设备，请使用 5 mil 设置。
2. 一旦层压器准备就绪，通过层压辊运行器件（图1H+I）。放置已添加双面胶带的末端，以获得最佳效果。
   注: 制造五层或更多层的设备时，它们可能会多次通过层压器运行。
3. 恢复层压设备。
   注意:建议设备足够大，以便从层压器中轻松恢复。这种考虑不会影响通道或芯片架构的大小，它只是要求一个"帧"，可以很容易地通过层压器，而无需留在里面。

5. 入口/出口口

1. 使用旋转工具和 1/32 in. 钻头在家具保险杠中心切割一个小孔。或者，使用 1 mm 活检冲孔穿孔保险杠。
   注:建议使用钻床。虽然尺寸不同，但建议使用 2 mm x 6 mm 直径的保险杠。避免简单地"刺伤"保险杠。除非拆下材料，否则保险杠将再次密封 （补充图 1）。如上所述的穿孔用于与聚苯乙烯 （PEEK） 管、移液器和尖端或钝针 （16-18 G） 接口。使用旋转冲孔钳可以实现更大的穿孔 （补充图 1）。当保险杠用作液体或其他生物的"储液罐"时，这些非常有用。
2. 通过用一对小钳子清除任何碎屑（由钻孔或冲孔引起），确保孔完全清晰。
3. 成功清除入口/出口口后，小心地将保险杠与层压设备上的进气/出口口对齐（图 1J+K）。此步骤对于液体正确进出设备至关重要。握住设备后面的保险杠，将面向打开入口/出口的粘合面定位在设备上，然后对齐并粘住。设备组件现已完成。

6. 测试

1. 通过穿孔保险杠（端口）访问通道/腔室架构。关于如何在设备中引入流体和生物物，有多种选择。
2. 将实验室或医疗/手术管连接到塑料接头（例如 Luer 适配器）或钝针，使用实验室或医疗/外科管。也可以使用没有适配器的标准移液器和吸头或PEEK管（补充图2）。
3. 使用注射器或蠕动泵使用注射器和管道进行输液或抽液。
   注:市场上有很多选择，在撰写本文时从300美元起。
4. 根据设备和实验设置不同的流速设置。
   注: 我们通常使用 0.01–100 μL/min 范围内的流速设置，但可以使用其他速率。

图1:制造。（A） 办公室层压机和工艺切割机是制造所需的仅有的两件设备。两者都可在线或工艺品/办公用品商店。其他必需的工具包括剪刀和钳子。（B） 通道和腔室架构可以使用任何包含绘图工具的软件程序以数字方式组成（某些用户可能首选矢量图形，但不是必需的）。线条和形状以黑色绘制，背景为白色。通过拖放，可以将设计的文件或屏幕截图导入工艺切割机软件。（C） 工艺切割机软件可免费下载，并需要控制切割机。该软件获取设计并允许修改，如大小调整。它还提供绘图工具。（D） 切割垫带有用于切割的薄膜.它稍微粘附，允许切割材料的固定性。图中显示了四种准备装载的材料:3 密厚 PET/EVA 薄膜（顶部）、5 密耳厚的 PET/EVA 薄膜（中间）、6 密厚 EVA/PET/EVA（左下）和 PVC 薄膜（右下）。（E） 切割机可打开以显示刀片（黑色）单元和已装载的垫子。（F） 切割后，使用钳子提起各个层。通道和腔室的切口仍附着在垫子上，随后被移除并丢弃。（G） 单个层对齐并叠加进行层压。小块双面胶带（箭头）通常用于帮助对齐和防止层在层压过程中移动。（H，I）设备在层压器顶部进料，并通过插槽恢复。层压提供坚固的密封，使通道路径保持打开状态。（J， K）为了进入通道，有必要添加穿孔，自粘乙烯基保险杠。（J） 中的图像显示"反向"对齐方法，其中保险杠从背面放置，允许入口/出口与保险杠穿孔进行视觉对齐。请点击此处查看此图的较大版本。

结果

除了低成本和快速迭代外，PETL 技术还可以轻松定制，以解决特定挑战。首先，我们描述了一个简单的设备，由玻璃盖玻片、造型室层、通道层和入口/出口层组成（图2）。该装置旨在方便在恒流下对细胞和微器官进行成像。培养基以低流速补充，以鼓励营养和气体交换。圆形腔室采用玻璃底部，允许使用倒置显微镜进行成像。此设备中使用玻璃至少有两个原因。第一个是光...

讨论

虽然微流体越来越多地存在于世界各地的实验室的工具箱中，但鉴于微流体具有^积极影响的潜力，采用速度令人失望。微流体器件制造成本低、效率高，对于加速在普通研究实验室中采用该技术至关重要。此处描述的方法使用多个胶片层以光刻方法所需的时间和成本的一小部分创建两维和三维设备。标准光刻启动成本高达数千美元，需要数天时间才能制作，PETL 制造启动成本不?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biopsy punch (1mm)	Miltex	33-31AA	Optional, replaces rotary tool set up
Blunt needles	Janel, Inc.	JEN JG18-0.5X-90	Remove plastic and attach to Tygon tubing
Coverslips	Any		24 x 60 mm are preferred
Cutting Mat and blades	Silhouette America or Nicapa	www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats	Re-use/Disposables
Double-sided tape	Scotch/3M	667	Small amounts, any width or brand
PEEK tubing	IDEX/any	1581L	Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK
PET/EVA thermal laminate film	Scotch/3M & Transcendia	TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet	3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls.
PVC film - Cling Wrap	Glad / Any		Food wrapping
Rotary tool-drill	Dremel/Any	200-121 or other	1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended
Rubber Roller	Speedball	4126	To facilitate adhesion, any brand will work
Scissors & tweezers	Any	Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12	Quality brands are recommended
Silhouette CAMEO Craft cutter	Silhouette America	www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T	Preferred craft cutter
Silhouette Studio software	Silhouette America	www.silhouetteamerica.com/software	Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC)
Syringe Pump	Harvard Apparatus or New Era	70-4504 or NE-300	Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used.
Syringes	Any		1-3mL
Thermal laminator	Scotch/3M	TL906	Standard home/office model
Tygon tubing (E-3603)	Cole-Parmer	EW-06407-70	Use with blunt needle tips
Vinyl furniture bumpers	DerBlue/3M/ Everbilt	Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm)	Round bumpers are recommended