使用天然多酚姜黄素对脑组织淀粉样斑块进行标记和成像

摘要

姜黄素是一种理想的荧光素，用于标记和成像脑组织中的淀粉样贝塔蛋白斑块，因为它优先结合淀粉样贝塔蛋白，并且与其他传统的淀粉样蛋白结合染料的结构相似。与传统方法相比，它可用于更高效、更廉价地标记和图像淀粉样β蛋白斑块。

摘要

淀粉样β蛋白（A+）在细胞外和细胞内空间沉积是阿尔茨海默氏病（AD）的显著疾病之一。因此，检测AD脑组织中A+的存在是开发新的治疗方法，防止AD进展的宝贵工具。几种经典的淀粉样结合染料、氟铬、成像探针和A+特异性抗体已用于检测AD脑组织中的A+组织。使用这些化合物进行A+检测既昂贵又耗时。然而，由于其强烈的荧光活性，高亲和力，和特殊性A+，以及结构相似性，传统的淀粉样结合染料，姜黄素（Cur）是一个有前途的候选标签和成像A+斑块在死后脑组织。它是来自草本姜黄龙的天然多酚。在本研究中，Cur在一分钟内从5倍家族性阿尔茨海默氏病（5xFAD）的遗传小鼠模型和人类AD组织中，用组织化学方式标记A+斑块。Cur 的标签能力与传统的淀粉样结合染料（如硫黄素-S（硫黄素-S）、刚果红 （CR） 和氟玉 C （FJC） 以及 A+ 特异性抗体 （6E10 和 A11）进行了比较。我们观察到，与这些传统染料相比，Cur 是最廉价、最快速的标记和图像 A+ 斑块的方法，与 A+ 特异性抗体相媲美。此外，Cur 与大多数 A+ 物种结合，如寡聚物和纤维蛋白。因此，Cur 可用作 A+ 斑块最经济、简单、快速的氟铬检测剂。

引言

阿尔茨海默氏病（AD）是最常见的、与年龄有关、渐进的神经系统疾病之一，也是^全球1、2日死亡的主要原因之一。学习、记忆和认知障碍，以及神经精神障碍，^是AD3中常见的症状。虽然AD的病因尚未完全阐明，但现有的遗传、生化和实验证据表明，A+的逐渐沉积^是AD4的明确生物标志物。这种错误折叠的蛋白质积累在细胞内和细胞外空间，被认为是参与突触损失，增加神经炎症，和神经退化在^受AD5影响的大脑的皮质和海马区域。因此，在AD组织中组织化学检测A+是开发无毒抗淀粉样药物以防止AD进展的关键的第一步。

在过去的几十年中，许多研究实验室使用几种染料和抗体来标记和图像脑组织中的 A+ 斑块，但其中一些方法耗时，使用的染料或抗体昂贵，需要多种附件化学品。因此，开发一种廉价的方法来检测AD大脑中的A+斑块将是一个受欢迎的新工具。许多实验室开始使用Cur，一种有前途的抗淀粉样天然多酚，用于标记和成像A+，^{以及AD6，7，8，9}的治疗剂。其疏水性和嗜血性性质、与经典淀粉样结合染料的结构相似性、强大的荧光活性以及与 A+ 结合的强烈亲和力使其成为 AD 组织 10 中 A+ 斑块标记和成像的理想荧光素.Cur与A+斑块和寡聚物结合，其存在也在细胞内空间7，11，12，13中检测到。此外，已经表明，最小量（1⁄10 nM）的Cur可以标记A+斑块在5倍家族性阿尔茨海默氏病（5xFAD）脑^组织7。虽然 1 nM 浓度不能为 A+ 斑块计数提供最佳荧光强度，但 Cur 的浓度为 10 nM 或更高。Ran^{和他的同事14}日报告说，剂量低至0.2 nM的二氟龙衍生的Cur几乎可以检测体内A+沉积物和红外探头。此剂量是否足以标记组织中的 A+ 斑块仍不清楚。以前的大多数研究都使用 20-30 分钟使用 Cur 染色 A+ 斑块，但最佳染色可能需要的时间要少得多。

本研究旨在测试 Cur 在 AD 脑组织中标记 A+ 斑块所需的最短时间，并比较 5xFAD 小鼠在与其他常规小鼠染色后，在脑组织中标记和成像 A+ 斑块的灵敏度A+ 结合染料，如硫黄素-S（硫-S）、刚果红 （CR） 和氟-玉 C （FJC）。这些经典淀粉样结合染料的A+标记能力与5xFAD小鼠和年龄匹配的人类AD和控制脑组织的石蜡嵌入和冷冻冠状脑部分的Cur染色进行了比较。研究结果表明，Cur以类似于A+特异性抗体（6E10）的方式标记A+斑块，并比Thio-S、CR或FJC中更好。此外，当Cur到5xFAD小鼠的腹内注射被注射2~5天时，它越过了血脑屏障，并与A+^斑块7结合。有趣的是，在5xFAD脑^组织7，14中，纳米摩尔浓度已经被用来标记和图像A+斑块。此外，形态上截然不同的A+斑块，如核心、神经质、扩散和烧坏斑块，可以比任何其他传统的淀粉样结合^染料7更高效地标记Cur。总体而言，Cur 可以以简单且廉价的方式应用于 AD 动物模型和/或人类 AD 组织死后脑组织中的 A+ 斑块的标签和图像，作为 A+ 特异性抗体的可靠替代品。

研究方案

这里描述的所有方法都已获得萨吉诺谷州立大学动物护理和使用委员会（ACUC）的批准。人体组织是从亚利桑那州班纳太阳健康^{研究所15、16}日建立的脑库获得的。

1. 动物灌注

1. 准备固定和灌注缓冲液。
   1. 通过加入 80 g 氯化钠 （NaCl）、2 g 氯化钾 （KCl）、21.7 g 磷酸氢钠 （Na₂HPO₄+7H₂O）、2.59 克磷酸二氢钾（KH₂PO 4）制备 0.1 M 磷酸钠缓冲液），和双蒸馏水共1升。
   2. 制备4%的甲醛（PFA）。
      1. 将40克甲醛加入1 L的PBS（0.1M，pH 7.4）。
      2. 将 PFA 溶液加热至 60~65 °C，并使用磁性搅拌器混合。
         注:温度不应超过65°C。
      3. 加入几滴NaOH（1 N）与滴滴完全溶解PFA。
      4. 用中等到细滤纸过滤PFA溶液，并储存在4°C。
         注:该解决方案适合一个月使用。
2. 进行动物麻醉和灌注。
   注:12个月大的B6SJL-Tg APP SwFlLon、PSEN1_M146L+L286V、1136799Vas/J（5°FAD）年龄匹配对照小鼠（n = 每组6只）从供应商处购买，并在萨吉诺谷州立大学的动物之家饲养。基因分型通过聚合酶链反应（PCR）确认，如前^所述7。人类AD脑组织包括死后AD脑组织和年龄匹配的控制组织。
   1. 用适当的麻醉剂麻醉动物，如五巴比妥钠（390毫克/千克体重），或氯胺酮/木氨酸混合物（高达80毫克/千克体重氯胺酮和10毫克/千克体重的木氨酸）通过腹内注射（27 G针和1mL 注射器）。通过捏脚趾检查麻醉水平。如果动物没有反应，那么它已经准备好进行灌注手术了。
   2. 将麻醉动物置于灌注手术托盘上的上部位置，并使用小虹膜剪刀对左心室的后端进行切口。
   3. 将 22 G 灌注针插入左心室，并在右腹膜处进行小切口，以去除体内的灌注液。使用重力灌注系统使冰冷的灌注液（0.1 M PBS，pH 7.4）流动5~6分钟（流速20~25ml/min）。
      注:清晰的肝脏是最佳灌注的指标。
   4. 将缓冲阀切换到冰冷的 4% 甲醛溶液中进行固定，使其流动 8-10 分钟。
      注: 震颤后硬化或僵硬的四肢是良好的固定指标。
   5. 用剪刀把大脑从头骨上取出来。使用铲子，收集大脑，并将其放入4%PFA（至少10倍于大脑体积）的瓶中，并储存在4°C，直到进一步使用。

2. 组织处理

1. 切割低温部分。
   1. 将大脑转移到分级蔗糖溶液（10%、20%和30%）并储存在4°C，每次24小时，直到使用。
   2. 在-22°C下使用低温，切割40μm厚的部分。在充满PBS和钠的6个孔盘中，每口收集10~20节（0.02%）。
2. 石蜡嵌入了小鼠和人类脑组织的部分。
   1. 对于石蜡部分，用分级酒精（50%、70%、90%）脱水渗透和24小时固定后脑组织每2小时，然后是100%酒精2倍，每次1小时），然后用二甲苯2x，每个1小时）在室温下。
   2. 在56°C下，在覆盖着铝箔的玻璃锥形烧瓶中，用二甲苯-石蜡（1:1）2倍2倍进入组织。
   3. 将组织浸入融化的石蜡（56°C）中4~6小时。
   4. 在室温下使用旋转微托体切割5μm厚的部分，并将其置于45°C的组织水浴中。
3. 在化学上用 Cur 标记低温部分中的 A+ 斑块。
   1. 用 PBS （pH 7.4） 3x 冲洗步骤 2.1.2 中的部分，每次 5 分钟。
   2. 在室温下将部分浸入 70% 乙醇中 2 分钟。
   3. 将Cur（1 mM）溶解在甲醇中，用70%乙醇稀释，以获得10μM的最终工作浓度。
   4. 在室温下，在 150 rpm 的摇床上浸入工作 Cur 溶液的部分 1⁄5 分钟。
   5. 丢弃Cur溶液，用70%乙醇3倍清洗，每次2分钟。
   6. 将部分放在聚L-流因为层涂层玻璃玻片上，并使用有机安装介质（如脱苯增塑剂二甲苯（DPX））安装盖玻片。
   7. 使用 480/550 nm 激励/发射过滤器在荧光显微镜下查看。
4. 在石蜡嵌入的小鼠和人类大脑部分用Cur标记A+斑块。
   1. 在室温下，用二甲苯2x将组织部分从步骤2.2.4中除化5分钟。
   2. 用分级酒精溶液（100%、80%、70%、50%各1分钟）和蒸馏水2次，每次在室温下5分钟补充水。
   3. 在黑暗中，在室温下，用 Cur （10 μM） 染色 10 分钟，在 150 rpm 时摇动。用70%、90%和100%酒精分别洗2分钟。
   4. 用二甲苯2x每片5分钟清除，用DPX盖滑。
   5. 如步骤 2.3.7 所述，在荧光显微镜下可视化。
5. 在 A+ 斑块和寡聚物中与 A+ 抗体共同粘合 Cur。
   1. 在 12 孔板中用 PBS 3x 清洗步骤 2.1.2 中的低温部分。
   2. 用10%正常山羊血清（NGS）在PBS中溶解0.5%Triton-X-100，在室温下1小时。
   3. 丢弃阻塞解决方案。用A+特异性抗体（6E10或A11，稀释1:200）孵育在含有10%NGS和0.5%Triton-X100的新鲜阻断溶液中，在150rpm的摇摇器中过夜。
   4. 丢弃抗体溶液，用PBS 3x洗涤各10分钟。
   5. 在室内温度下用红色荧光素（例如 Alexa 594）孵育第二抗体标记 1 小时。
   6. 用PBS 3次清洗，每次10分钟。
   7. 用70%酒精洗1次。
   8. 在室温下用Cur（10 μM）孵育各部分5分钟。
   9. 用70%酒精洗涤3次，每次1分钟。
   10. 脱水90%和100%酒精各1分钟，用二甲苯2次，每次5分钟，并用DPX安装在幻灯片上。
   11. 使用荧光显微镜使用荧光显微镜进行可视化，该显微镜具有相应的红色和绿色信号激发/发射滤波器。
   12. 对于细胞内 A+ 共定位，使用 A+ 抗体 （6E10） 染色部分，在黑暗中与 Cur 一起染色，在 150 rpm 下摇动，并在室温下用 Hoechst-33342（1 mg/ml） 和/或 DAPI （1ug/ml） 进行 10 分钟的染色。在150 rpm下摇动的黑暗。用 PBS 3x 清洗。
   13. 使用 100 倍物镜（总放大倍数 1，000 倍）使用红色、绿色和蓝色滤镜拍摄图像。
6. 使用 Thio-S、CR 和 FJC 标记 A+ 斑块。
   注:Thio-S和CR标签的详细协议先前已^报告7。
   1. 对于 FJC 染色，用 PBS 3x 清洗从步骤 2.1.2 获得的游离部分，每次 5 分钟。
   2. 将部分放入 12 孔板中，用 FJC 染色 （0.001%）在室温下在黑暗中10分钟。
   3. 丢弃 FJC 溶液，用 PBS 3x 每洗涤 5 分钟。
   4. 在室温下用氯化铵（NH₄Cl，50 mM溶解在PBS中）孵育10分钟。
   5. 丢弃 NH₄Cl 溶液，用 PBS 3x 每块洗涤 5 分钟。
   6. 按照第 2.4 节中的步骤，使用 450/520 nm 激励/排放过滤器在荧光显微镜下用分级酒精溶液脱水、清除、安装和查看。

结果

姜黄素在一分钟内标记A+斑块。当我们用Cur染色5xFAD组织时，我们发现Cur标签A+斑块在1分钟内。虽然Cur的孵育时间略有增加A+斑块的荧光强度，但观察到的A+斑块数量在1分钟至5分钟的染色时间之间没有显著差异（图1）。

Cur 可以在冷冻制备的石蜡嵌入小鼠和人类 AD 组织中标记 A+ 斑块，与小鼠 AD 脑组织中 A...

讨论

我们的假设是，与其他经典淀粉样结合染料以及 A+ 特异性抗体相比，Cur 可用作在死后 AD 脑组织中标记和图像 A+ 斑块的最快速、最简单和最便宜的方法。本研究的目的是确定Cur在死后AD脑组织中标记和图像A+斑块所需的最短时间，并确定Cur是否可以作为A+抗体的替代物来标记A+斑块。为此，在不同时间点观察到Cur的A+标记能力。Cur 能够在一分钟内将 A+ 贴上标签。此外，Cur 对 A+ 的标记大于其他常规?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	IHC world, Woodstock, MD
Aanimal model of Alzheimer's disease	Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10	Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11	Millipore, Burlington, MA
Compound light microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus BX51
Congo red	Sigma, St. Louis, MO
Cryostat	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
Curcumin	Sigma, St. Louis, MO
Disodium hydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Dystyrene plasticizer xylene	BDH, Dawsonville, GA
Filter papers	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342	Sigma, St. Louis, MO
Inverted fluorescent microscope	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
Inverted fluorescent microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus 1x70
Normal goat serum	Sigma, St. Louis, MO
Paraffin	Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lysine coated charged glass slide	Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Potassium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Sodium azide	Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide	EMD Millipore, Burlington, MA
Sodium pentobarbital	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Thioflavin-S	Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO
Xylene	VWR,Radnor, PA