Rotulagem e imagem de placas amilóides no tecido cerebral usando a curcumina polifenóis naturais

Resumo

A curcumina é um fluorofifora ideal para rotulagem e imagem de placas de proteína beta amilóide no tecido cerebral devido à sua ligação preferencial à proteína beta amilóide, bem como suas semelhanças estruturais com outros corantes de ligação amilóide tradicionais. Ele pode ser usado para rotular e imagem placas de proteína beta amilóide de forma mais eficiente e barata do que os métodos tradicionais.

Resumo

A deposição da proteína beta amilóide (Aβ) em espaços extra e intracelulares é uma das patologias marcantes da doença de Alzheimer (DA). Portanto, a detecção da presença de Aβ no tecido cerebral da DA é uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de novos tratamentos para evitar a progressão da DA. Vários corantes clássicos de ligação amilóide, fluorocromático, sondas de imagem e anticorpos específicos de Aβ têm sido usados para detectar Aβ histoquimicamente no tecido cerebral da DA. O uso desses compostos para detecção de Aβ é caro e demorado. No entanto, devido à sua intensa atividade fluorescente, alta afinidade e especificidade para Aβ, bem como semelhanças estruturais com corantes tradicionais de ligação amilóide, a curcumina (Cur) é um candidato promissor para rotulagem e imagem de placas Aβ em pós-morte tecido cerebral. É um polifenóis natural da erva Curcuma longa. No presente estudo, Cur foi usado para rotular histoquimicamente as placas de Aβ de um modelo genético de camundongos 5x da doença de Alzheimer familiar (5xFAD) quanto do tecido humano da DA em um minuto. A capacidade de rotulagem de Cur foi comparada aos corantes de ligação amilóide convencionais, como tialavina-S (Thio-S), Congo vermelho (CR) e Fluoro-jade C (FJC), bem como anticorpos específicos de Aβ (6E10 e A11). Observamos que cur é a maneira mais barata e mais rápida de rotular e imagem placas Aβ quando comparado a esses corantes convencionais e é comparável aos anticorpos específicos aβ. Além disso, Cur se liga com a maioria das espécies aβ, como oligomers e fibrilas. Portanto, cur poderia ser usado como o mais rentável, simples e rápido agente de detecção fluorocromática para placas Aβ.

Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é uma das mais comuns, relacionadas à idade, distúrbios neurológicos progressivos e uma das principais causas de morte em todo o mundo^1,2. Aprendizagem, memória e deficiência de cognição, juntamente com distúrbios neuropsiquiátricos, são os sintomas comuns manifestados em³d.A. . Embora a etiologia da DA não tenha sido totalmente elucidada, as evidências genéticas, bioquímicas e experimentais disponíveis indicam que a deposição gradual de Aβ é um biomarcador definitivo para⁴dC. Esta proteína mal dobrada se acumula em espaços intracelulares e extracelulares e é pensado para estar envolvido na perda sináptica, aumento da neuroinflamação, e neurodegeneração nas regiões corticais e hipocampais no cérebro afetado sd⁵. Portanto, a detecção histoquímica de Aβ no tecido da DA é um primeiro passo crucial no desenvolvimento de medicamentos anti-amilóides não tóxicos para evitar a progressão da DA.

Durante as últimas décadas, vários corantes e anticorpos têm sido usados por muitos laboratórios de pesquisa para rotular e imagem placas Aβ no tecido cerebral, mas alguns desses métodos são demorados e os corantes ou anticorpos utilizados são caros, exigindo vários acessórios Produtos químicos. Portanto, o desenvolvimento de um meio barato de detecção de placas Aβ no cérebro da DA seria uma nova ferramenta bem-vinda. Muitos laboratórios começaram a utilizar cur, um promissor polifenol natural anti-amilóide, para rotulagem e imagem Aβ, bem como um agente terapêutico para^{AD 6,7,8,9}. Sua hidrofóbica e natureza lipofilia, semelhanças estruturais com corantes de ligação amilóide clássico, forte atividade fluorescente, bem como forte afinidade para se ligar com Aβ torna um fluorofofóbico ideal para rotulagem e imagem de placas Aβ no tecido ad¹⁰ . A coalhada se liga com placas e oligomeros aβ e sua presença também é detectada nos espaços intracelulares^7,11,12,13. Além disso, tem sido demonstrado que quantidades mínimas (1-10 nM) de Cur podem rotular placas Aβ na doença de Alzheimer 5x (5xFAD) tecido cerebral⁷. Embora a concentração de 1 nM não forneça a intensidade ideal da fluorescência para contar de chapas de Aβ, uma concentração de 10 nM ou mais elevada de Cur faz. Ran e colegas¹⁴ relataram que doses tão baixas quanto 0,2 nM de cur derivada difluoroboron pode detectar in vivo aβ depósitos quase tão bem como uma sonda infravermelha. Se esta dose é suficiente para rotular placas Aβ no tecido ainda não está claro. A maioria dos estudos anteriores usou 20 a 30 min para colorir placas Aβ usando Cur, mas a coloração ideal pode exigir muito menos tempo.

O presente estudo foi projetado para testar o tempo mínimo exigido pela Cur para rotular placas Aβ no tecido cerebral da DA e comparar a sensibilidade para rotulagem e imagem de placas Aβ no tecido cerebral dos camundongos 5xFAD após colorir com Cur com outros Corantes de ligação a aβ, como Thioflavin-S (Thio-S), Congo vermelho (CR) e Fluoro-jade C (FJC). A capacidade de rotulagem aβ desses corantes de ligação amilóide clássicas foi comparada com a coloração de Cur em seções de cérebro coronal de parafina e criostata de camundongos 5xFAD e de dad humana com correspondência com idade e controle do tecido cerebral. Os resultados sugerem que Cur rotula as placas de Aβ de uma forma semelhante aos anticorpos específicos de Aβ (6E10) e moderadamente melhor do que Thio-S, CR ou FJC. Além disso, quando as injeções intraperitoneal de Cur para camundongos 5xFAD foram administradas por 2 a 5 dias, ela cruzou a barreira sangue-cérebro e encadernada com placas Aβ⁷. Curiosamente, concentrações nanomolar de Cur têm sido usados para rotular e imagem placas Aβ em 5xFAD tecido cerebral^7,14. Além disso, placas aβ morfologicamente distintas, como placas de núcleo, neuritic, difusas e queimadas podem ser rotuladas por Cur de forma mais eficiente do que com qualquer uma das outras tinturas de ligação amilóide convencionais⁷. No geral, cur pode ser aplicado para rotular e imagem placas Aβ no tecido cerebral pós-morte de modelos animais da DA e / ou tecido da DA humana de uma forma fácil e barata, como uma alternativa confiável para anticorpos específicos Aβ.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Animal Care and Use Committee (ACUC) da Saginaw Valley State University. O tecido humano foi obtido a partir de um banco de cérebro estabelecido no Banner Sun Health Institute, no Arizona^15,16.

1. Perfusão dos animais

1. Prepare os amortecedores fixadores e de perfusão.
   1. Prepare 0,1 M tampão de fosfato de sódio adicionando 80 g de cloreto de sódio (NaCl), 2 g de cloreto de potássio (KCl), 21,7 g de fosfato de hidrogênio disódio (Na₂HPO₄·7H₂O), 2,59 g de fosfato de dihidrogênio de potássio (KH₂PO₄ ), e água destilada dupla para fazer um total de 1 L.
   2. Prepare 4% de paraformaldeído (PFA).
      1. Adicione 40 g de paraformaldeído a 1 L de PBS (0,1 M, pH 7,4).
      2. Aqueça a solução PFA a 60 a 65 °C e misture com um agitador magnético.
         NOTA: A temperatura não deve exceder 65 °C.
      3. Adicione poucas gotas de NaOH (1 N) com um conta-gotas para dissolver completamente o PFA.
      4. Filtre a solução PFA com papel de filtro médio a fino e guarde a 4 °C.
         NOTA: A solução é boa para um mês.
2. Realizar anestesia animal e perfusão.
   NOTA: Doze meses de idade B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1 *M146L*L286V, 1136799Vas/J (5×FAD) ratos controle de idade (n = 6 por grupo) foram comprados de vendedores e criados na casa animal da Universidade Estadual de Saginaw Valley. Genotyping foi confirmado pela reação em cadeia de polimerase (PCR), conforme descrito anteriormente⁷. O tecido cerebral humano da DA inclui tecido cerebral pós-morte e tecido de controle compatível com a idade.
   1. Anestésico o animal com um agente anestésico adequado, como o pentobarbital de sódio (390 mg/kg de peso corporal), ou uma mistura de cetamina/xilázine (até 80 mg/kg de peso corporal quetamina e 10 mg/kg de peso corporal xylazine) por injeção intraneal peritoperito (27 G agulha e 1 seringa mL). Check the level of anesthesia by pinching a toe. Se o animal não responde, então ele está pronto para a cirurgia de perfusão.
   2. Coloque o animal anestesiado na posição supina na bandeja de cirurgia de perfusão e usando pequenas tesouras de íris faça uma incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo.
   3. Insira uma agulha de perfusão de 22 G no ventrículo esquerdo e faça uma pequena incisão no auricle direito para remover o fluido de perfusão do corpo. Use um sistema de perfusão alimentado por gravidade para permitir que o fluido de perfusão de gelo-frio (0,1 M PBS, pH 7,4) flua para 5-6 min (taxa de fluxo de 20 a 25 ml/min).
      NOTA: Um fígado claro é o indicador de perfusão ideal.
   4. Troque a válvula tampão para uma solução de paraformaldeído de 4% gelada para fixação e permita que ela flua por 8 a 10 min.
      NOTA: Tremor seguido por membros endurecidos ou rígidos são indicadores de boa fixação.
   5. Retire o cérebro do crânio usando uma tesoura. Usando uma espátula, recolher o cérebro e colocá-lo em um frasco de 4% PFA (pelo menos 10x o volume do volume cerebral) e armazenar a 4 °C até novo uso.

2. Processamento de tecidos

1. Corte as seções de criostat.
   1. Transferir o cérebro para soluções de sacarose graduadas (10%, 20% e 30%) e guarde a 4 °C para 24 h cada, até o uso.
   2. Usando um criostat em -22 °C, corte 40 seções μm-grossas. Colete 10 a 20 seções por poço em uma placa de 6 poços cheia de PBS e azida de sódio (0,02%).
2. Parafina incorporar as seções para o rato e tecido cerebral humano.
   1. Para seções de parafina, desidratar o tecido cerebral pós-fixo perfundido e 24 h com álcoois classificados (50%, 70%, 90%) para 2 h cada, seguido por 100% de álcool 2x para 1 h cada), e depois com xileno 2x para 1 h cada) à temperatura ambiente.
   2. Penetre o tecido com xilena-parafina (1:1) 2x para 1 h a 56 °C em um frasco cônico de vidro coberto com folha de alumínio.
   3. Mergulhe o tecido na parafina derretida (56 °C) por 4 a 6 h.
   4. Corte seções de 5 μm de espessura usando um microtome rotativo à temperatura ambiente e coloque-as em um banho de água de tecido a 45 °C.
3. Histoquimicamente rotular as placas Aβ nas seções criostat com Cur.
   1. Lave as seções da etapa 2.1.2 com PBS (pH 7.4) 3x para 5 min cada.
   2. Mergulhe as seções em 70% de etanol por 2 min à temperatura ambiente.
   3. Dissolva o estoque Cur (1 mM) em metanol e diluir com 70% de etanol para obter uma concentração final de trabalho de 10 μM.
   4. Mergulhe as seções com a solução Cur de trabalho para 1-5 min à temperatura ambiente em uma coqueteleira em 150 rpm.
   5. Descarte a solução Cur e lave com 70% de etanol 3x por 2 min cada.
   6. Coloque as seções em slides de vidro revestidos de poli-L-lisina e monte com um deslizamento de cobertura usando mídia de montagem orgânica, como xileno de plásticoizador de estireno (DPX).
   7. Vista um microscópio de fluorescência usando filtros de excitação/emissão de 480/550 nm.
4. Histoquimicamente rotular as placas Aβ no rato embutido na parafina e seções cerebrais humanas com Cur.
   1. Deparafinaas seções de tecido do passo 2.2.4 com xileno 2x para 5 min cada um à temperatura ambiente.
   2. Reidrate com soluções de álcool graduada (100%, 80%, 70%, 50% para 1 min cada) e com água destilada 2x para 5 min cada em temperatura ambiente.
   3. Seções de manchas com Cur (10 μM) por 10 min à temperatura ambiente no escuro, tremendo a 150 rpm. Lave com 70%, 90% e 100% de álcool por 2 min cada.
   4. Claro com xileno 2x para 5 min cada e escorregar cobrir com DPX.
   5. Visualize um microscópio de fluorescência, como mencionado na etapa 2.3.7.
5. Colocalize Cur com o anticorpo Aβ em placas e oligomers Aβ.
   1. Lave seções criostat a partir do passo 2.1.2 com PBS 3x em uma placa de 12 poços.
   2. Bloqueie as seções com 10% de soro de cabra normal (NGS) dissolvido em PBS com 0,5% Triton-X-100 à temperatura ambiente por 1 h.
   3. Descarte a solução de bloqueio. Incubar as seções com anticorpos específicos aβ (6E10 ou A11, diluído 1:200) dissolvido em nova solução de bloqueio contendo 10% NGS e 0,5% Triton-X100 durante a noite em 4 °C em um shaker em 150 rpm.
   4. Descarte a solução de anticorpos e lave as seções com PBS 3x por 10 min cada.
   5. Incubar com a etiqueta secundária do anticorpo com fluorophore vermelho (por exemplo, Alexa 594) para 1 h na temperatura ambiente na obscuridade.
   6. Lave com PBS 3x por 10 min cada.
   7. Lave com 70% de álcool 1x.
   8. Incubar as seções com Cur (10 μM) por 5 min à temperatura ambiente.
   9. Lave com 70% de álcool 3x por 1 min cada.
   10. Desidratar com 90% e 100% de álcool por 1 min cada, claro com xileno 2x para 5 min cada, e montar em slides usando DPX.
   11. Visualize usando um microscópio de fluorescência com filtros apropriados de excitação/emissão para os sinais vermelhos e verdes.
   12. Para a colocalização intracelular de Aβ, manche as seções usando Aβ-anticorpo (6E10), restain com Cur à temperatura ambiente no escuro com agitação a 150 rpm, e contramancha com Hoechst-33342 (1 mg/ml) e/ou DAPI (1ug/ml) por 10 min à temperatura ambiente em o escuro com agitação em 150 rpm. Lave com PBS 3x.
   13. Tire imagens com filtros vermelhos, verdes e azuis com um objetivo de 100x (ampliação total 1.000x).
6. Rotular placas Aβ com Thio-S, CR e FJC.
   NOTA: Protocolos detalhados para rotulagem De Thio-S e CR foram relatados anteriormente⁷.
   1. Para a coloração de FJC, lave as seções free-floating obtidas da etapa 2.1.2 com PBS 3x para 5 min cada.
   2. Coloque as seções em uma placa de 12 poços e mancha com FJC (0,001%) por 10 min no escuro à temperatura ambiente.
   3. Descarte a solução FJC e lave com PBS 3x por 5 min cada.
   4. Incubate com cloreto de amônio (NH₄Cl, 50 mM dissolvido em PBS) por 10 min à temperatura ambiente.
   5. Descarte a solução NH₄Cl e lave com PBS 3x por 5 min cada.
   6. Seguindo as etapas na seção 2.4, desidratar com soluções graduadas do álcool, cancelar, montar, e ver um microscópio da fluorescência usando filtros da excitação/emissão de 450/520 nm.

Resultados

Curcumina rotula placas de Aβ dentro de um minuto. Quando mantomos o tecido 5xFAD com Cur, descobrimos que cur rótulo placas Aβ dentro de 1 min. Embora o aumento do tempo de incubação com Cur tenha aumentado ligeiramente a intensidade da fluorescência das placas de Aβ, o número de placas aβ observadas não foi significativamente diferente entre 1 min e 5 minutos de tempo de coloração (Figura 1).

Discussão

Nossa hipótese era que cur poderia ser usado como a maneira mais rápida, mais fácil e menos cara para rotular e imagem placas Aβ no tecido cerebral pós-morte da aD quando comparado a outros corantes clássicos de ligação amilóide, bem como anticorpos específicos aβ. Os objetivos deste estudo foram determinar o tempo mínimo necessário para rotular e imagem placas Aβ por Cur no tecido cerebral pós-morte ad e determinar se Cur pode ser usado como uma alternativa ao anticorpo Aβ para rotular placas Aβ. Para e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	IHC world, Woodstock, MD
Aanimal model of Alzheimer's disease	Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10	Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11	Millipore, Burlington, MA
Compound light microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus BX51
Congo red	Sigma, St. Louis, MO
Cryostat	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
Curcumin	Sigma, St. Louis, MO
Disodium hydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Dystyrene plasticizer xylene	BDH, Dawsonville, GA
Filter papers	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342	Sigma, St. Louis, MO
Inverted fluorescent microscope	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
Inverted fluorescent microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus 1x70
Normal goat serum	Sigma, St. Louis, MO
Paraffin	Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lysine coated charged glass slide	Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Potassium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Sodium azide	Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide	EMD Millipore, Burlington, MA
Sodium pentobarbital	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Thioflavin-S	Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO
Xylene	VWR,Radnor, PA