Etichettatura e imaging di placche amiloidi nel tessuto cerebrale utilizzando la curcumina polifenolo naturale

Riepilogo

La curcumina è un fluoroforo ideale per l'etichettatura e l'imaging di placche proteiche beta amiloidi nel tessuto cerebrale a causa del suo legame preferenziale alla proteina beta amiloide e delle sue somiglianze strutturali con altri coloranti di legame amiloidi tradizionali. Può essere utilizzato per etichettare e immagini placche proteiche beta amiloidi in modo più efficiente ed economico rispetto ai metodi tradizionali.

Abstract

La deposizione di proteine beta amiloidi (A) in spazi extra e intracellulari è una delle patologie distintive del morbo di Alzheimer (AD). Pertanto, il rilevamento della presenza di A , nel tessuto cerebrale dell'AD, è uno strumento prezioso per lo sviluppo di nuovi trattamenti per prevenire la progressione dell'AD. Diversi coloranti di legame amiloide classici, fluorocro, sonde di imaging e anticorpi specifici per l'AO sono stati utilizzati per rilevare l'A - istochimicamente nel tessuto cerebrale dell'AD. L'uso di questi composti per il rilevamento di A - è costoso e richiede molto tempo. Tuttavia, a causa della sua intensa attività fluorescente, dell'alta affinità e della specificità per l'Az, così come le somiglianze strutturali con i coloranti leganti amiloidi tradizionali, la curcumina (Cur) è un promettente candidato per l'etichettatura e l'imaging delle placche A tessuto cerebrale. È un polifenolo naturale dell'erba Curcuma longa. Nel presente studio, Cur è stato utilizzato per etichettare istochimicamente placche di Az sia da un modello murino genetico della malattia di Alzheimer familiare 5x (5xFAD) e dal tessuto umano AD entro un minuto. La capacità di etichettatura di Cur è stata confrontata con i tradizionali coloranti di legame amiloide, come thioflavin-S (Thio-S), Congo rosso (CR) e Fluoro-jade C (FJC), così come gli anticorpi specifici di Az (6E10 e A11). Abbiamo osservato che Cur è il modo più economico e più veloce per etichettare e immagini le placche DiZ rispetto a questi coloranti convenzionali ed è paragonabile agli anticorpi specifici di A . Inoltre, Cur si lega con la maggior parte delle specie di A, come oligomeri e fibrille. Pertanto, Cur potrebbe essere utilizzato come l'agente di rilevamento fluorocro più conveniente, semplice e veloce per le placche A .

Introduzione

Il morbo di Alzheimer (AD) è uno dei disturbi neurologici più comuni, legati all'età e progressivi e una delle principali cause di morte in tutto il mondo^1,2. Apprendimento, memoria, e compromissione della cognizione, insieme a disturbi neuropsichiatrici, sono i sintomi comuni manifestati in AD³. Anche se l'eziologia dell'AD non è stata completamente chiarita, le prove genetiche, biochimiche e sperimentali disponibili indicano che la graduale deposizione di Ao è un biomarcatore definitivo per AD⁴. Questa proteina piegata male si accumula negli spazi intracellulari ed extracellulari ed è pensata per essere coinvolta nella perdita sinaptica, nell'aumento della neuroinfiammazione e nella neurodegenerazione nelle regioni corticali ed ippocampali nel cervello colpite da^{AD 5}. Pertanto, il rilevamento istochimico di A , nel tessuto AD, è un primo passo fondamentale nello sviluppo di farmaci anti-amiloidi non tossici per prevenire la progressione dell'AD.

Nel corso degli ultimi decenni, diversi coloranti e anticorpi sono stati utilizzati da molti laboratori di ricerca per etichettare e immagini le placche A - nel tessuto cerebrale, ma alcuni di questi metodi richiedono molto tempo e i coloranti o gli anticorpi utilizzati sono costosi, richiedendo diversi accessori Prodotti chimici. Pertanto, lo sviluppo di un mezzo economico di rilevamento delle placche di AC nel cervello AD sarebbe un nuovo strumento gradito. Molti laboratori hanno iniziato a utilizzare Cur, un promettente polifenolo naturale anti-amiloide, per l'etichettatura e l'imaging di A, nonché un agente terapeutico per AD^6,7,8^,9. La sua idropobicità e la natura lofilica, le somiglianze strutturali con i coloranti leganti amiloidi classici, la forte attività fluorescente, così come la forte affinità da legare con l'Az lo rendono un fluoroforo ideale per l'etichettatura e l'imaging delle placche di A . Cur si lega con le placche az e oligomeri e la sua presenza viene rilevata anche negli spazi intracellulari^7,11,12,13. Inoltre, è stato dimostrato che una quantità minima di Cur può etichettare le placche affar-Alzheimer familiari 5x (5xFAD)⁷. Anche se la concentrazione di 1 nM non fornisce l'intensità di fluorescenza ottimale per il conteggio delle placche di Ao, una concentrazione di 10 nM o superiore di Cur fa. Ran e colleghi¹⁴ hanno riferito che dosi a partire da 0,2 nM di Cur derivato da difluoroboron sono in grado di rilevare i depositi in vivo di A, quasi come una sonda a infrarossi. Non è ancora chiaro se questa dose sia sufficiente per etichettare le placche di Az nei tessuti. La maggior parte degli studi precedenti ha utilizzato 20-30 min per colorare le placche di Az usando Cur, ma la colorazione ottimale può richiedere molto meno tempo.

Il presente studio è stato progettato per testare il tempo minimo richiesto da Cur per etichettare le placche di Az nel tessuto cerebrale dell'AD e per confrontare la sensibilità per l'etichettatura e l'imaging delle placche di A, dai topi 5xFAD dopo la colorazione con Cur con altri Coloranti leganti a z, come Thioflavin-S (Thio-S), Congo rosso (CR) e Fluoro-jade C (FJC). La capacità di etichettatura di questi classici coloranti di legame amiloide è stata confrontata con la colorazione in sezioni cerebrali coronariche incorporate in paraffina e criostati da topi 5xFAD e da tessuto umano e di controllo del cervello. I risultati suggeriscono che Cur etichetta le placche di Az in modo simile agli anticorpi specifici di A - (6E10) e moderatamente migliore di Thio-S, CR o FJC. Inoltre, quando sono state somministrate iniezioni intraperiteali di topi Cur to 5xFAD per 2/5 giorni, ha attraversato la barriera emato-encefalica e legato con placche ad Ao⁷. È interessante notare che, le concentrazioni nanomolare di Cur sono state utilizzate per etichettare e l'immagine placche di Ao nel tessuto cerebrale 5xFAD^7,14. Inoltre, le placche di A, come le placche di nucleo, neuritiche, diffuse e bruciate, possono essere etichettate da Cur in modo più efficiente rispetto a qualsiasi altro colorante di legame amiloide convenzionale⁷. Nel complesso, Cur può essere applicato per etichettare e immagini placche az in tessuto cerebrale post-mortem da modelli animali AD e/o tessuto AD umano in modo semplice ed economico, come alternativa affidabile agli anticorpi specifici di A.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee (ACUC) della Saginaw Valley State University. Il tessuto umano è stato ottenuto da una banca del cervello stabilito presso lo Banner Sun Health Institute in Arizona^15,16.

1. Perfusione degli animali

1. Preparare i buffer fissativi e perfusione.
   1. Preparare il buffer di fosfato di sodio da 0,1 M aggiungendo 80 g di cloruro di sodio (NaCl), 2 g di cloruro di potassio (KCl), 21,7 g di fosfato di idrogeno dissodico (Na₂HPO₄- 7H₂O), 2,59 g di fosfato di diidrogeno di potassio (KH₂PO₄ ), e doppia acqua distillata per un totale di 1 L.
   2. Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA).
      1. Aggiungere 40 g di paraformaldeide a 1 L di PBS (0,1 M, pH 7,4).
      2. Riscaldare la soluzione PFA a 60-65 gradi centigradi e mescolare utilizzando un agitatore magnetico.
         N.B.: La temperatura non deve superare i 65 gradi centigradi.
      3. Aggiungere alcune gocce di NaOH (1 N) con un contagocce per sciogliere completamente l'APIs.
      4. Filtrare la soluzione PFA con carta da filtro medio-fine e conservarla a 4 gradi centigradi.
         NOTA: La soluzione è valida per un mese.
2. Eseguire l'anestesia animale e la perfusione.
   NOTA: i topi di controllo B6SJL-Tg APP SwLon, PSEN1-M146L-L286V, 1136799Vas/J (5 x FAD) abbinati all'età (n . 6 per gruppo) sono stati acquistati da venditori e allevati nella casa animali della Saginaw Valley State University. La genotipizzazione è stata confermata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) come descritto in precedenza⁷. Il tessuto cerebrale dell'AD umana include il tessuto cerebrale dell'AD e il tessuto di controllo corrispondente all'età.
   1. Anestetizzare l'animale con un agente anestetico appropriato, come pentobarbital di sodio (390 mg/kg di peso corporeo), o una miscela di ketamina/xilarina (fino a 80 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di peso corporeo xylazina) per iniezione intraperitoneale (27 G di ago e 1 siringa mL). Controllare il livello di anestesia pizzicando un dito del dito del dito. Se l'animale non risponde, allora è pronto per la chirurgia perfusione.
   2. Posizionare l'animale anestetizzato nella posizione supina sul vassoio di chirurgia perfusione e utilizzando piccole forbici iride fare un'incisione all'estremità posteriore del ventricolo sinistro.
   3. Inserire un ago perfusione da 22 G sul ventricolo sinistro e fare una piccola incisione al cauricolo destro per rimuovere il liquido perfusione dal corpo. Utilizzare un sistema di perfusione alimentato a gravità per consentire al fluido di perfusione a freddo ghiaccio (0,1 M PBS, pH 7,4) di fluire per 5 x 6 min (velocità di flusso 20-25 ml/min).
      NOTA: Un fegato chiaro è l'indicatore di perfusione ottimale.
   4. Passare la valvola tampone a una soluzione di paraformaldeide 4% ghiacciata per il fissaggio e lasciarla fluire per 8-10 min.
      NOTA: Il tremore seguito da arti induriti o rigidi sono indicatori di buona fissazione.
   5. Rimuovere il cervello dal cranio con le forbici. Utilizzando una spatola, raccogliere il cervello e metterlo in una fiala di 4% PFA (almeno 10 volte il volume del volume del cervello) e conservare a 4 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo.

2. Lavorazione dei tessuti

1. Tagliare le sezioni criostati.
   1. Trasferire il cervello a soluzioni di saccarosio classificato (10%, 20% e 30%) e conservare a 4 gradi centigradi per 24 ore ciascuno, fino all'uso.
   2. Con un criostato a -22 gradi centigradi, tagliare sezioni spesse 40 m. Raccogliere le 10-20 sezioni per pozzo in un 6 pozzetto riempito con PBS e azide di sodio (0,02%).
2. Paraffin incorporare le sezioni per il topo e tessuto cerebrale umano.
   1. Per le sezioni di paraffina, disidratare il tessuto cerebrale perfuso e 24 h post-fisso con alcool graduato (50%, 70%, 90%) per 2 h ciascuno, seguito da 100% alcol 2x per 1 h ciascuno), e poi con xilene 2x per 1 h ciascuno) a temperatura ambiente.
   2. Penetrare il tessuto con xylene-paraffina (1:1) 2x per 1 h a 56 gradi centigradi in un flacone conico di vetro ricoperto di foglio di alluminio.
   3. Immergi il tessuto in paraffina fusa (56 gradi centigradi) per 4/6 h.
   4. Tagliare 5 sezioni di spessore utilizzando un microtoma rotativo a temperatura ambiente e metterli in un bagno d'acqua di tessuto a 45 gradi centigradi.
3. Etichettare istochimicamente le placche di Az nelle sezioni criostat con Cur.
   1. Risciacquare le sezioni dal passo 2.1.2 con PBS (pH 7.4) 3x per 5 min ciascuno.
   2. Immergere le sezioni nel 70% di etanolo per 2 min a temperatura ambiente.
   3. Sciogliere lo stock Cur (1 mM) in metanolo e diluire con il 70% di etanolo per ottenere una concentrazione di lavoro finale di 10 M.
   4. Immergi le sezioni con la soluzione Cur funzionante per un valore di 1/5 min a temperatura ambiente su uno shaker a 150 giri/mm.
   5. Scartare la soluzione Cur e lavare con 70% etanolo 3x per 2 min ciascuno.
   6. Mettere le sezioni su vetrini in vetro rivestito in poli-L-lisina e montare con un coverslip utilizzando supporti di montaggio organici, come distigna plasticizer xylene (DPX).
   7. Vista al microscopio a fluorescenza utilizzando filtri di eccitazione/emissione a 480/550 nm.
4. L'etichetta istochimica delle placche di Az nelle sezioni del topo incorporato in paraffina e del cervello umano con Cur.
   1. Deparaffinizzare le sezioni di tessuto dal passo 2.2.4 con xilene 2x per 5 min ciascuno a temperatura ambiente.
   2. Reidratato con soluzioni alcoliche graduate (100%, 80%, 70%, 50% per 1 min ciascuno) e con acqua distillata 2x per 5 min ciascuna a temperatura ambiente.
   3. Sezioni di macchia con Cur (10m) per 10 min a temperatura ambiente al buio, agitando a 150 giri/m. Lavare con 70%, 90% e 100% alcol per 2 min ciascuno.
   4. Chiaro con xilene 2x per 5 min ciascuno e cover slip con DPX.
   5. Visualizza al microscopio a fluorescenza come menzionato al punto 2.3.7.
5. Colocalizzano Cur con l'anticorpo di Az nelle placche e negli oligomeri di Ao.
   1. Lavare le sezioni di criostat dal passo 2.1.2 con PBS 3x in un piatto 12 po ' .
   2. Bloccare le sezioni con il 10% di siero di capra normale (NGS) sciolto in PBS con 0.5% Triton-X-100 a temperatura ambiente per 1 h.
   3. Eliminare la soluzione di blocco. Incubare le sezioni con anticorpi specifici per A- (6E10 o A11, diluiti 1:200) disciolti in soluzione di blocco fresco contenente il 10% NGS e lo 0,5% Triton-X100 durante la notte a 4 gradi centigradi in uno shaker a 150 giri/min.
   4. Eliminare la soluzione anticorpale e lavare le sezioni con PBS 3x per 10 min ciascuna.
   5. Incubare con il tag anticorpo secondario con fluoroforo rosso (ad esempio, Alexa 594) per 1 h a temperatura ambiente al buio.
   6. Lavare con PBS 3x per 10 min ciascuno.
   7. Lavare con il 70% di alcol 1x.
   8. Incubare le sezioni con Cur (10 M) per 5 min a temperatura ambiente.
   9. Lavare con 70% alcol 3x per 1 min ciascuno.
   10. Disidrata con alcool del 90% e 100% per 1 min ciascuno, chiaro con xilene 2x per 5 min ciascuno, e montare su vetrini utilizzando DPX.
   11. Visualizza utilizzando un microscopio a fluorescenza con filtri di eccitazione/emissione appropriati per i segnali rosso e verde.
   12. Per la co-localizzazione intracellulare di A- macchia le sezioni che utilizzano l'anticorpo A-a (6E10), il resto con Cur a temperatura ambiente al buio con agitazione a 150 rpm e il controstaina con Hoechst-33342 (1 mg/ml) e/o DAPI (1ug/ml) per 10 min a temperatura ambiente in il buio con agitazione a 150 giri/min. Lavare con PBS 3x.
   13. Scatta immagini con i filtri rosso, verde e blu con un obiettivo 100x (ingrandimento totale 1.000x).
6. Etichettare le targhe A e FJC.
   NOTA: i protocolli dettagliati per l'etichettatura Thio-S e CR sono stati precedentemente segnalati⁷.
   1. Per la colorazione FJC, lavare le sezioni galleggianti libere ottenute dal passaggio 2.1.2 con PBS 3x per 5 min ciascuna.
   2. Collocare le sezioni in una piastra di 12 pozzetto e macchiare con FJC (0,001%) per 10 min al buio a temperatura ambiente.
   3. Scartare la soluzione FJC e lavare con PBS 3x per 5 min ciascuno.
   4. Incubare con cloruro di ammonio (NH₄Cl, 50 mM disciolto in PBS) per 10 min a temperatura ambiente.
   5. Scartare la soluzione NH₄Cl e lavare con PBS 3x per 5 min ciascuno.
   6. Seguendo i passaggi della sezione 2.4, disidratare con soluzioni alcoliche graduate, chiare, montate e visualizzate al microscopio a fluorescenza utilizzando filtri di eccitazione/emissione a 450/520 nm.

Risultati

La curcumina etichetta le placche di Az entro un minuto. Quando abbiamo macchiato il tessuto 5xFAD con Cur, abbiamo scoperto che le placche Cur az sono all'interno di 1 min. Anche se l'aumento del tempo di incubazione con Cur ha leggermente aumentato l'intensità di fluorescenza delle placche di Ao, il numero di placche di Az osservate non era significativamente diverso tra 1 min e 5 min di colorazione (Figura 1).

Discussione

La nostra ipotesi era che Cur potesse essere usato come il modo più veloce, semplice e meno costoso per etichettare e immaginile le placche A e az nel tessuto cerebrale dell'AD postmortem rispetto ad altri coloranti di legame amiloide classici, così come gli anticorpi specifici di Az. Gli obiettivi di questo studio erano determinare il tempo minimo necessario per etichettare e immagini le placche di Az da Cur nel tessuto cerebrale post mortem AD e determinare se Cur può essere utilizzato come alternativa agli anticorp...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	IHC world, Woodstock, MD
Aanimal model of Alzheimer's disease	Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10	Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11	Millipore, Burlington, MA
Compound light microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus BX51
Congo red	Sigma, St. Louis, MO
Cryostat	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
Curcumin	Sigma, St. Louis, MO
Disodium hydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Dystyrene plasticizer xylene	BDH, Dawsonville, GA
Filter papers	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342	Sigma, St. Louis, MO
Inverted fluorescent microscope	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
Inverted fluorescent microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus 1x70
Normal goat serum	Sigma, St. Louis, MO
Paraffin	Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lysine coated charged glass slide	Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Potassium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Sodium azide	Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide	EMD Millipore, Burlington, MA
Sodium pentobarbital	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Thioflavin-S	Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO
Xylene	VWR,Radnor, PA