Etikettierung und Bildgebung von Amyloid-Plaques im Gehirngewebe mit dem natürlichen Polyphenol Curcumin

Zusammenfassung

Curcumin ist ein ideales Fluorophor für die Kennzeichnung und Bildgebung von Amyloid-Beta-Protein-Plaques im Gehirngewebe aufgrund seiner bevorzugten Bindung an Amyloid-Beta-Protein sowie seiner strukturellen Ähnlichkeiten mit anderen traditionellen Amyloid-Bindungsfarbstoffen. Es kann verwendet werden, um Amyloid-Beta-Protein-Plaques effizienter und kostengünstiger als herkömmliche Methoden zu beschriften und abzubilden.

Zusammenfassung

Die Ablagerung von Amyloid-Beta-Proteinen (A) in extra- und intrazellulären Räumen ist eine der charakteristischen Pathologien der Alzheimer-Krankheit (AD). Daher ist der Nachweis des Vorhandenseins von Aa im AD-Gehirngewebe ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, um das Fortschreiten von AD zu verhindern. Mehrere klassische Amyloid-Bindungsfarbstoffe, Fluorchrom, bildgebende Sonden und A-spezifische Antikörper wurden verwendet, um Aa histochemisch im AD-Gehirngewebe zu detektieren. Die Verwendung dieser Verbindungen für die A-Erkennung ist kostspielig und zeitaufwändig. Aufgrund seiner intensiven fluoreszierenden Aktivität, der hohen Affinität und der Spezifität von Aa sowie struktureller Ähnlichkeiten mit traditionellen Amyloid-Bindungsfarbstoffen ist Curcumin (Cur) jedoch ein vielversprechender Kandidat für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques in postmortem Hirngewebe. Es ist ein natürliches Polyphenol aus dem Kraut Curcuma longa. In der vorliegenden Studie wurde Cur verwendet, um A-Plaques sowohl aus einem genetischen Mausmodell der 5x familiären Alzheimer-Krankheit (5xFAD) als auch aus menschlichem AD-Gewebe innerhalb einer Minute histochemisch zu kennzeichnen. Die Etikettierfähigkeit von Cur wurde mit herkömmlichen Amyloid-Bindungsfarbstoffen wie Thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR) und Fluoro-jade C (FJC) sowie A-spezifischen Antikörpern (6E10 und A11) verglichen. Wir beobachteten, dass Cur der preiswerteste und schnellste Weg ist, A-Plaques im Vergleich zu diesen herkömmlichen Farbstoffen zu beschriften und abzubilden und mit A-spezifischen Antikörpern vergleichbar ist. Darüber hinaus bindet Cur mit den meisten A-Arten, wie Oligomere und Fibrillen. Daher könnte Cur als kostengünstigstes, einfachstes und schnellstes Fluorchrom-Detektionsmittel für A-Plaques verwendet werden.

Einleitung

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der häufigsten, altersbedingten, fortschreitenden neurologischen Erkrankungen und eine der häufigsten Todesursachen weltweit^1,2. Lern-, Gedächtnis- und Kognitionsstörungen, zusammen mit neuropsychiatrischen Störungen, sind die häufigsten Symptome, die sich in AD³manifestieren. Obwohl die Ätiologie von AD noch nicht vollständig aufgeklärt wurde, deuten die verfügbaren genetischen, biochemischen und experimentellen Beweise darauf hin, dass die allmähliche Ablagerung von Aa ein endgültiger Biomarker für AD⁴ist. Dieses falsch gefaltete Protein sammelt sich in intrazellulären und extrazellulären Räumen an und wird angenommen, dass es an synaptischen Verlusten, erhöhter Neuroinflammation und Neurodegeneration in den kortikalen und hippocampalen Regionen im Gehirn beteiligt ist, die von AD⁵betroffen sind. Daher ist der histochemische Nachweis von Aa im AD-Gewebe ein entscheidender erster Schritt bei der Entwicklung ungiftiger Anti-Amyloid-Medikamente zur Verhinderung der AD-Progression.

In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Farbstoffe und Antikörper von vielen Forschungslaboratorien verwendet, um A-Plaques im Hirngewebe zu kennzeichnen und abzubilden, aber einige dieser Methoden sind zeitaufwändig und die verwendeten Farbstoffe oder Antikörper sind teuer, was mehrere Zubehörteile erfordert. Chemikalien. Daher wäre die Entwicklung eines kostengünstigen Nachweismittels für A-Plaques im AD-Gehirn ein willkommenes neues Werkzeug. Viele Laboratorien begannen mit Cur, einem vielversprechenden Anti-Amyloid-Naturpolyphenol, für die Kennzeichnung und Bildgebung von A, sowie einem therapeutischen Mittel für AD^6,7,8,9. Seine Hydrophobie und lypophile Natur, strukturelle Ähnlichkeiten mit klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffen, starke fluoreszierende Aktivität, sowie eine starke Affinität zur Bindung mit Aa macht es zu einem idealen Fluorophor für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques im AD-Gewebe¹⁰ . Cur bindet mit A-Plaques und Oligomeren und seine Anwesenheit wird auch in intrazellulären Räumen^7,11,12,13nachgewiesen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass minimale Mengen (1x 10 nM) von Cur A-Plaques bei 5x familiärer Alzheimer-Krankheit (5xFAD) Hirngewebe⁷beschriften können. Obwohl die 1 nM-Konzentration nicht die optimale Fluoreszenzintensität für die Zählung von A-Plaques liefert, ist eine 10 nM oder höhere Konzentration von Cur nicht. Ran und Kollegen¹⁴ berichteten, dass Dosen von bis zu 0,2 nM difluoroboron-derivatisierter Kur in vivo A-Ablagerungen fast so gut wie eine Infrarotsonde erkennen können. Ob diese Dosis ausreicht, um A-Plaques im Gewebe zu kennzeichnen, ist noch unklar. Die meisten früheren Studien haben 20-30 min für die Färbung von A-Plaques mit Cur verwendet, aber eine optimale Färbung kann viel weniger Zeit in Sicherstellung enden.

Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um die minimale Zeit zu testen, die Cur benötigt, um A-Plaques im AD-Gehirngewebe zu kennzeichnen und die Empfindlichkeit für die Kennzeichnung und Bildgebung von A-Plaques im Hirngewebe von den 5xFAD-Mäusen nach der Färbung mit Cur mit anderen konventionellen Bindende Farbstoffe wie Thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR) und Fluoro-jade C (FJC). Die A-Etikettierungsfähigkeit dieser klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffe wurde mit Der Färbung in paraffin-eingebetteten und kryostatkoronalen Hirnabschnitten von 5xFAD-Mäusen und aus altersgerechten menschlichen AD und der Kontrolle des Hirngewebes verglichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cur-Plaques in einer Weise, die A-spezifischen Antikörpern (6E10) und mäßig besser als Thio-S, CR oder FJC ähnelt. Darüber hinaus, wenn intraperitoneale Injektionen von Cur an 5xFAD Mäuse für 2-5 Tage verabreicht wurden, überquerte es die Blut - Hirn-Schranke und gebunden mit A- Plaques⁷. Interessanterweise wurden nanomolare Konzentrationen von Cur verwendet, um A-Plaques in 5xFAD Hirngewebe^7,14zu beschriften und abzubilden. Darüber hinaus können morphologisch unterschiedliche A-Plaques, wie Kern-, neuritische, diffuse und ausgebrannte Plaques, durch Cur effizienter gekennzeichnet werden als bei jedem anderen konventionellen Amyloid-Bindungsfarbstoff⁷. Insgesamt kann Cur auf die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques in postmortem Hirngewebe aus AD-Tiermodellen und/oder menschlichem AD-Gewebe auf einfache und kostengünstige Weise angewendet werden, als zuverlässige Alternative zu A-spezifischen Antikörpern.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee (ACUC) der Saginaw Valley State University genehmigt. Das menschliche Gewebe wurde von einer etablierten Gehirnbank am Banner Sun Health Institute in Arizona^15,16gewonnen.

1. Perfusion der Tiere

1. Bereiten Sie die Fixier- und Perfusionspuffer vor.
   1. 0,1 M Natriumphosphatpuffer vorbereiten, indem 80 g Natriumchlorid (NaCl), 2 g Kaliumchlorid (KCl), 21,7 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄,7H₂O), 2,59 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄₎ ) und doppelt destilliertes Wasser, um insgesamt 1 L zu bilden.
   2. 4% Paraformaldehyd (PFA) zubereiten.
      1. 40 g Paraformaldehyd zu 1 L PBS (0,1 M, pH 7,4) hinzufügen.
      2. Erhitzen Sie die PFA-Lösung auf 60 bis 65 °C und mischen Sie sie mit einem Magnetrührer.
         HINWEIS: Die Temperatur sollte 65 °C nicht überschreiten.
      3. Fügen Sie einige Tropfen NaOH (1 N) mit einem Trasen hinzu, um die PFA vollständig aufzulösen.
      4. Filtern Sie die PFA-Lösung mit mittlerem bis feinem Filterpapier und lagern Sie sie bei 4 °C.
         HINWEIS: Die Lösung ist gut für einen Monat.
2. Tieranästhesie und Perfusion durchführen.
   HINWEIS: Zwölf Monate alte B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J (5-FAD) altersgerechte Kontrollmäuse (n = 6 pro Gruppe) wurden von Verkäufern gekauft und im Tierhaus der Saginaw Valley State University gezüchtet. Die Genotypisierung wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie zuvor beschrieben⁷bestätigt. Menschliches AD-Gehirngewebe umfasst postmortem AD Gehirngewebe und altersgerechtes Kontrollgewebe.
   1. Anästhesisieren Sie das Tier mit einem geeigneten Anästhetikum, wie Natriumpentobarbital (390 mg/kg Körpergewicht), oder einem Ketamin/Xylazin-Gemisch (bis zu 80 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg/kg Körpergewicht Xylazin) durch intraperitoneale Injektion (27 G Nadel und 1 ml-Spritze). Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie einen Zehen kneifen. Wenn das Tier nicht reagiert, dann ist es bereit für eine Perfusionsoperation.
   2. Anästhesisiertes Tier in die Rückenlage auf das Perfusions-Operationstablett legen und mit einer kleinen Irisschere einen Schnitt an das hintere Ende der linken Herzkammer machen.
   3. Setzen Sie eine 22 G Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein und machen Sie einen kleinen Schnitt an der rechten Ohrmuschel, um Perfusionsflüssigkeit aus dem Körper zu entfernen. Verwenden Sie ein schwerkraftgespeistes Perfusionssystem, um die eiskalte Perfusionsflüssigkeit (0,1 M PBS, pH 7,4) für 5 x 6 min (Durchflussrate 20 x 25 ml/min) fließen zu lassen.
      HINWEIS: Eine klare Leber ist der Indikator für eine optimale Perfusion.
   4. Schalten Sie das Pufferventil zur Fixierung auf eine eiskalte 4%-Paraformaldehydlösung um und lassen Sie es für 8 bis 10 min fließen.
      HINWEIS: Tremor gefolgt von gehärteten oder steifen Gliedmaßen sind Indikatoren für eine gute Fixierung.
   5. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel mit einer Schere. Mit einem Spachtel, sammeln Sie das Gehirn und legen Sie es in einer Durchstechflasche von 4% PFA (mindestens 10x das Volumen des Gehirnvolumens) und speichern bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung.

2. Gewebeverarbeitung

1. Schneiden Sie Kryostatabschnitte.
   1. Übertragen Sie das Gehirn auf abgestufte Saccharoselösungen (10%, 20% und 30%) 4 °C für jeweils 24 h lagern, bis sie verwendet werden.
   2. Mit einem Kryostat bei -22 °C 40 m dicke Abschnitte schneiden. Sammeln Sie 10 bis 20 Abschnitte pro Brunnen in einer 6-Well-Platte mit PBS und Natriumazid gefüllt (0,02%).
2. Paraffin einbetten die Abschnitte für Maus und menschliches Gehirngewebe.
   1. Bei Paraffinabschnitten dehydrieren Sie das perfundierte und 24 h postfixierte Hirngewebe mit abgestuften Alkoholen (50%, 70%, 90%) für je 2 h, gefolgt von 100% Alkohol 2x für je 1 h), und dann mit Xylol 2x für je 1 h) bei Raumtemperatur.
   2. Mit Xylolparaffin (1:1) 2x bei 56 °C in einen mit Aluminiumfolie überzogenen Glaskolben in das Gewebe eindringen.
   3. Tauchen Sie das Gewebe in geschmolzenes Paraffin (56 °C) für 4 x 6 h ein.
   4. Schneiden Sie die 5 m dicken Abschnitte mit einem rotierenden Mikrotom bei Raumtemperatur und legen Sie sie bei 45 °C in ein Gewebewasserbad.
3. Histochemisch beschriften Sie die A-Plaques in den Kryostatabschnitten mit Cur.
   1. Spülen Sie die Abschnitte ab Schritt 2.1.2 mit PBS (pH 7.4) 3x für je 5 min.
   2. Tauchen Sie die Abschnitte in 70% Ethanol für 2 min bei Raumtemperatur ein.
   3. Den Bestand Cur (1 mM) in Methanol auflösen und mit 70% Ethanol verdünnen, um eine endende Arbeitskonzentration von 10 m zu erhalten.
   4. Tauchen Sie die Abschnitte mit Arbeits-Cur-Lösung für 1-5 min bei Raumtemperatur auf einem Shaker bei 150 Rpm.
   5. Discard Cur Lösung und waschen Sie mit 70% Ethanol 3x für je 2 min.
   6. Setzen Sie die Abschnitte auf poly-L-Lysin beschichtete Glasschlitten und montieren Sie mit einem Deckelschlupf mit organischen Montagemedien, wie Zölalmischer Xylol (DPX).
   7. Sehen Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop mit 480/550 nm Anregungs-/Emissionsfiltern.
4. Histochemisch beschriften Sie die A-Plaques in den paraffineingebetteten Maus- und menschlichen Gehirnabschnitten mit Cur.
   1. Entparaffinisieren Sie die Gewebeabschnitte ab Schritt 2.2.4 mit Xylol 2x für jeweils 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Rehydratisieren Sie mit abgestuften Alkohollösungen (100%, 80%, 70%, 50% für je 1 min) und mit destilliertem Wasser 2x für je 5 min bei Raumtemperatur.
   3. Fleckenabschnitte mit Cur (10 m) für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln, schütteln bei 150 Umdrehungen pro Minute. Waschen Sie mit 70%, 90% und 100% Alkohol für je 2 min.
   4. Mit Xylol 2x für je 5 min und Deckelschlupf mit DPX abschliessen.
   5. Visualisieren Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop, wie in Schritt 2.3.7 erwähnt.
5. Kolokalisieren Cur mit dem A-Antikörper in A-Plaques und Oligomeren.
   1. Waschen Sie Kryostatabschnitte ab Schritt 2.1.2 mit PBS 3x in einer 12-Well-Platte.
   2. Blockieren Sie die Abschnitte mit 10% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS gelöst mit 0,5% Triton-X-100 bei Raumtemperatur für 1 h.
   3. Verwerfen Sie die Blockierungslösung. Inkubieren Sie die Abschnitte mit A-spezifischen Antikörpern (6E10 oder A11, verdünnt 1:200), gelöst in frischer Sperrlösung, die 10% NGS und 0,5% Triton-X100 über Nacht bei 4 °C in einem Shaker bei 150 Rpm enthält.
   4. Entsorgen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Abschnitte mit PBS 3x für jeweils 10 min.
   5. Mit dem sekundären Antikörper-Tag mit rotem Fluorophor (z.B. Alexa 594) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
   6. Waschen Sie mit PBS 3x für je 10 min.
   7. Waschen Sie mit 70% Alkohol 1x.
   8. Inkubieren Sie die Abschnitte mit Cur (10 m) für 5 min bei Raumtemperatur.
   9. Waschen Sie mit 70% Alkohol 3x für je 1 min.
   10. Mit 90% und 100% Alkohol für je 1 min dehydrieren, mit Xylol 2x für je 5 min löschen und mit DPX auf Dias montieren.
   11. Visualisieren Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Anregungs-/Emissionsfiltern für die roten und grünen Signale.
   12. Bei intrazellulärer A-Kolokalisierung die Abschnitte mit A-Antikörper (6E10), Restain mit Cur bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Schütteln bei 150 U/min und Gegenfärbung mit entweder Hoechst-33342 (1 mg/ml) und/oder DAPI (1ug/ml) für 10 min bei Raumtemperatur in die Dunkelheit mit Schütteln bei 150 Rpm. Waschen mit PBS 3x.
   13. Nehmen Sie Bilder mit den roten, grünen und blauen Filtern mit einem 100-fachen Objektiv auf (Gesamtvergrößerung 1.000x).
6. Label A-Plaques mit Thio-S, CR und FJC.
   HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die Thio-S- und CR-Kennzeichnung wurden zuvor gemeldet⁷.
   1. Für FJC Färbung die frei schwebenden Abschnitte aus Schritt 2.1.2 mit PBS 3x für je 5 min waschen.
   2. Legen Sie die Abschnitte in eine 12 Brunnenplatte und Flecken mit FJC (0.001%) für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
   3. FJC-Lösung entsorgen und mit PBS 3x für jeweils 5 min waschen.
   4. Mit Ammoniumchlorid (NH₄Cl, 50 mM in PBS gelöst) für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. Entsorgen Sie die NH₄Cl Lösung und waschen Sie sie mit PBS 3x für jeweils 5 min.
   6. Nach den Schritten in Abschnitt 2.4 dehydrieren Sie mit abgestuften Alkohollösungen, klar, montieren und betrachten Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop mit 450/520 nm Anregungs-/Emissionsfiltern.

Ergebnisse

Curcumin beschriftet A-Plaques innerhalb einer Minute. Als wir 5xFAD Gewebe mit Cur färbten, fanden wir, dass Cur-Label A-Plaques innerhalb von 1 min. Obwohl die erhöhte Inkubationszeit mit Cur die Fluoreszenzintensität von A-Plaques leicht erhöhte, war die Anzahl der beobachteten A-Plaques zwischen 1 min und 5 min Färbungszeit nicht signifikant unterschiedlich (Abbildung 1).

Cur kann A-Plaques...

Diskussion

Unsere Hypothese war, dass Cur als schnellste, einfachste und kostengünstigste Methode verwendet werden könnte, um A-Plaques im postmortalen AD-Gehirngewebe im Vergleich zu anderen klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffen sowie A-spezifischen Antikörpern zu beschriften und abzubilden. Ziel dieser Studie war es, die Mindestzeit für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques durch Cur im postmortalen AD-Gehirngewebe zu bestimmen und zu bestimmen, ob Cur als Alternative zum A-Antikörper zur Kennzeichnung von A-Plaque...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	IHC world, Woodstock, MD
Aanimal model of Alzheimer's disease	Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10	Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11	Millipore, Burlington, MA
Compound light microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus BX51
Congo red	Sigma, St. Louis, MO
Cryostat	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
Curcumin	Sigma, St. Louis, MO
Disodium hydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Dystyrene plasticizer xylene	BDH, Dawsonville, GA
Filter papers	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342	Sigma, St. Louis, MO
Inverted fluorescent microscope	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
Inverted fluorescent microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus 1x70
Normal goat serum	Sigma, St. Louis, MO
Paraffin	Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lysine coated charged glass slide	Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Potassium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Sodium azide	Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide	EMD Millipore, Burlington, MA
Sodium pentobarbital	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Thioflavin-S	Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO
Xylene	VWR,Radnor, PA