Étiquetage et imagerie des plaques amyloïdes dans les tissus cérébraux à l'aide de la curcumine polyphénol naturelle

Résumé

La curcumine est un fluorophore idéal pour l'étiquetage et l'imagerie des plaques de protéines bêta amyloïdes dans le tissu cérébral en raison de sa liaison préférentielle à la protéine bêta amyloïde ainsi que ses similitudes structurelles avec d'autres colorants de liaison amyloïdes traditionnels. Il peut être utilisé pour étiqueter et imager les plaques de protéines bêta-amyloïdes plus efficacement et à peu de frais que les méthodes traditionnelles.

Résumé

Le dépôt de la protéine bêta amyloïde (A) dans les espaces extra- et intracellulaires est l'une des pathologies caractéristiques de la maladie d'Alzheimer (MA). Par conséquent, la détection de la présence de l'A dans le tissu cérébral de la MA est un outil précieux pour le développement de nouveaux traitements pour prévenir la progression de la MA. Plusieurs colorants de liaison amyloïdes classiques, fluorochrome, sondes d'imagerie, et des anticorps spécifiques à aa ont été utilisés pour détecter ahistochimiquement dans le tissu cérébral DeA. L'utilisation de ces composés pour la détection de l'A est coûteuse et prend beaucoup de temps. Cependant, en raison de son activité fluorescente intense, de sa forte affinité et de sa spécificité pour l'A, ainsi que des similitudes structurelles avec les colorants de liaison amyloïdes traditionnels, la curcumine (Cur) est un candidat prometteur pour l'étiquetage et l'imagerie des plaques A en post mortem tissu cérébral. C'est un polyphénol naturel de l'herbe Curcuma longa. Dans la présente étude, Cur a été utilisé pour étiqueter histochimiquement plaques A à partir à la fois d'un modèle de souris génétiques de 5x maladie d'Alzheimer familiale (5xFAD) et à partir de tissu aD humain dans une minute. La capacité d'étiquetage de Cur a été comparée aux colorants de liaison amyloïdes conventionnels, tels que le thioflavine-S (Thio-S), le rouge du Congo (CR) et le Fluoro-jade C (FJC), ainsi que les anticorps spécifiques à l'A (6E10 et A11). Nous avons observé que Cur est le moyen le plus peu coûteux et le plus rapide d'étiqueter et d'imager les plaques A par rapport à ces colorants conventionnels et est comparable aux anticorps spécifiques à l'A. En outre, Cur se lie à la plupart des espèces de a, comme les oligomères et les fibrilles. Par conséquent, Cur pourrait être utilisé comme l'agent de détection fluorochrome le plus rentable, simple et rapide pour les plaques A.

Introduction

La maladie d'Alzheimer (MA) est l'un des troubles neurologiques les plus fréquents, liés à l'âge et progressifs et l'une des principales causes de décès dans le monde^1,2. L'apprentissage, la mémoire, et l'affaiblissement de cognition, avec des désordres neuropsychiatriques, sont les symptômes communs manifestés dans AD^3. Bien que l'étiologie de la MA n'ait pas été entièrement élucidée, les preuves génétiques, biochimiques et expérimentales disponibles indiquent que le dépôt progressif de l'A est un biomarqueur définitif pour l'AD⁴. Cette protéine mal repliée s'accumule dans les espaces intracellulaires et extracellulaires et est pensé pour être impliqué dans la perte synaptique, la neuroinflammation accrue, et la neurodégénérescence dans les régions corticales et hippocampal dans le cerveau affecté par AD⁵. Par conséquent, la détection histochimique de l'A dans le tissu de la MA est une première étape cruciale dans le développement de médicaments anti-amyloïdes non toxiques pour prévenir la progression de la MA.

Au cours des dernières décennies, plusieurs colorants et anticorps ont été utilisés par de nombreux laboratoires de recherche pour étiqueter et imager les plaques A dans les tissus cérébraux, mais certaines de ces méthodes prennent beaucoup de temps et les colorants ou anticorps utilisés sont coûteux, nécessitant plusieurs accessoires Produits chimiques. Par conséquent, le développement d'un moyen peu coûteux de détection des plaques A dans le cerveau AD serait un nouvel outil bienvenu. De nombreux laboratoires ont commencé à utiliser Cur, un polyphénol naturel anti-amyloïde prometteur, pour l'étiquetage et l'imagerie A, ainsi qu'un agent thérapeutique pour AD^6,7,8,9. Son hydrophobicité et sa nature lypophile, ses similitudes structurelles avec les colorants reliure smyloïdes classiques, sa forte activité fluorescente, ainsi qu'une forte affinité pour se lier à aô en fait un fluorophore idéal pour l'étiquetage et l'imagerie des plaques Adans le tissu AD¹⁰ . Cur se lie avec des plaques aet et des oligomères et sa présence est également détectée dans les espaces intracellulaires^7,11,12,13. En outre, il a été démontré que des quantités minimales (1 à 10 nM) de Cur peuvent étiqueter les plaques A dans 5x tissus cérébraux familiaux de la maladie d'Alzheimer (5xFAD)⁷. Bien que la concentration de 1 nM ne fournit pas l'intensité optimale de fluorescence pour le comptage des plaques de l'A, une concentration de 10 nM ou plus de Cur ne. Ran et ses collègues¹⁴ ont signalé que des doses aussi faibles que 0,2 nM de Cur dérivée du difluoroboron peuvent détecter des dépôts in vivo a presque aussi bien qu'une sonde infrarouge. Il n'est pas encore clair si cette dose est suffisante pour étiqueter les plaques Adans les tissus. La plupart des études antérieures ont utilisé 20 à 30 min pour tacher les plaques de l'A à l'aide de Cur, mais une coloration optimale peut nécessiter beaucoup moins de temps.

La présente étude a été conçue pour tester le temps minimum requis par Cur pour étiqueter les plaques A dans le tissu cérébral de l'AD et pour comparer la sensibilité à l'étiquetage et à l'imagerie des plaques A dans le tissu cérébral des souris 5xFAD après coloration avec Cur avec d'autres Les colorants liés à l'A, tels que Thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR) et Fluoro-jade C (FJC). La capacité d'étiquetage de l'A mD de ces colorants de liaison amyloïdes classiques a été comparée à la coloration De Cur dans les sections du cerveau coronal incorporées à la paraffine et cryostat de souris 5xFAD et de la MA humaine et du tissu cérébral de contrôle. Les résultats suggèrent que Cur étiquettes plaques A d'une manière similaire aux anticorps spécifiques à a (6E10) et modérément mieux que Thio-S, CR, ou FJC. En outre, lorsque des injections intrapéritones de souris Cur à 5xFAD ont été administrées pendant 2 à 5 jours, elle a traversé la barrière hémato-encéphalique et a été liée avec des plaques^A7. Fait intéressant, les concentrations nanomolaires de Cur ont été utilisées pour étiqueter et imager les plaques A dans le tissu cérébral 5xFAD^7,14. De plus, les plaques a- morphologiquement distinctes, telles que les plaques de noyau, de neuritique, diffuses et brûlées, peuvent être étiquetées par Cur plus efficacement qu'avec n'importe lequel des autres colorants amyloïdes conventionnels^7. Dans l'ensemble, la curpeut-être peut être appliquée à l'étiquette et à l'image des plaques adans le tissu cérébral post-mortem à partir de modèles animaux AD et/ou de tissus ad humains d'une manière facile et peu coûteuse, comme une alternative fiable aux anticorps spécifiques à l'A.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux (ACUC) de l'Université d'État de Saginaw Valley. Le tissu humain a été obtenu à partir d'une banque de cerveau établie au Banner Sun Health Institute en Arizona^15,16.

1. Perfusion des animaux

1. Préparer les tampons de fixation et de perfusion.
   1. Préparer un tampon de phosphate de sodium de 0,1 M en ajoutant 80 g de chlorure de sodium (NaCl), 2 g de chlorure de potassium (KCl), 21,7 g de phosphate d'hydrogène disodium (Na₂HPO₄x 7H₂O), 2,59 g de phosphate de potassium (KH₂PO₄₎ ), et double de l'eau distillée pour un total de 1 L.
   2. Préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA).
      1. Ajouter 40 g de paraformaldéhyde à 1 L de PBS (0,1 M, pH 7,4).
      2. Chauffer la solution PFA à 60 à 65 oC et mélanger à l'aide d'un agitateur magnétique.
         REMARQUE : La température ne doit pas dépasser 65 oC.
      3. Ajouter quelques gouttes de NaOH (1 N) avec un goutte-à-goutte pour dissoudre complètement le PFA.
      4. Filtrer la solution PFA avec du papier filtre moyen à fin et conserver à 4 oC.
         REMARQUE: La solution est bonne pour un mois.
2. Effectuer l'anesthésie animale et la perfusion.
   REMARQUE : Des souris témoins de b6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1-M146L-L286V, 1136799Vas/J (5-FAD) souris témoins par âge (n - 6 par groupe) ont été achetées chez des vendeurs et élevées dans la maison d'animaux de l'Université d'État de Saginaw Valley. Le génotypage a été confirmé par la réaction en chaîne de polymérase (PCR) comme décrit précédemment⁷. Le tissu cérébral de la MA humaine comprend le tissu cérébral administre post mortem et le tissu témoin assorti à l'âge.
   1. Anesthésiez l'animal avec un agent anesthésique approprié, comme le pentobarbital de sodium (390 mg/kg de poids corporel), ou un mélange de kétamine/xylazine (jusqu'à 80 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine) par injection intrapéritone (27 G aiguille et 1 seringue mL). Vérifiez le niveau d'anesthésie en pinçant un orteil. Si l'animal ne répond pas, il est prêt pour la chirurgie de perfusion.
   2. Placer l'animal anesthésié en position de supine sur le plateau de chirurgie de perfusion et à l'aide de petits ciseaux d'iris faire une incision à l'extrémité postérieure du ventricule gauche.
   3. Insérez une aiguille de perfusion de 22 G au ventricule gauche et faites une petite incision à l'oreillette droite pour enlever le liquide de perfusion du corps. Utiliser un système de perfusion alimenté par gravité pour permettre au fluide de perfusion glace-froid (0,1 M PBS, pH 7,4) de circuler de 5 à 6 min (débit de 20 à 25 ml/min).
      REMARQUE : Un foie clair est l'indicateur de perfusion optimale.
   4. Passez la soupape tampon à une solution de paraformaldéhyde de 4 % glacée pour la fixation et laissez-la couler pendant 8 à 10 minutes.
      REMARQUE : Les tremblements suivis de membres durcis ou raides sont des indicateurs de bonne fixation.
   5. Retirez le cerveau du crâne à l'aide de ciseaux. À l'aide d'une spatule, recueillir le cerveau et le placer dans une fiole de 4% de PFA (au moins 10 fois le volume du volume du cerveau) et stocker à 4 oC jusqu'à une utilisation ultérieure.

2. Traitement des tissus

1. Couper les sections de cryostat.
   1. Transférer le cerveau vers des solutions de saccharose graduées (10 %, 20 % et 30 %) et conserver à 4 oC pendant 24 h chacun, jusqu'à utilisation.
   2. À l'aide d'un cryostat à -22 oC, couper des sections de 40 m d'épaisseur. Recueillir 10 à 20 sections par puits dans une assiette de 6 puits remplie de PBS et d'azide de sodium (0,02 %).
2. La paraffine intègre les sections pour la souris et le tissu cérébral humain.
   1. Pour les sections de paraffine, déshydrater le tissu cérébral perfused et de 24 h post-fixe avec des alcools classés (50%, 70%, 90%) pour 2 h chacun, suivi de 100% alcool 2x pour 1 h chacun), puis avec xylène 2x pour 1 h chacun) à température ambiante.
   2. Pénétrer le tissu avec de la xylène-paraffine (1:1) 2x pendant 1 h à 56 oC dans un flacon conique en verre recouvert de papier d'aluminium.
   3. Immerger le tissu dans de la paraffine fondue (56 oC) pendant 4 à 6 h.
   4. Couper des sections de 5 m d'épaisseur à l'aide d'un microtome rotatif à température ambiante et les placer dans un bain d'eau de tissu à 45 oC.
3. Étiquetez histochimiquement les plaques A dans les sections cryostat avec Cur.
   1. Rincer les sections de l'étape 2.1.2 avec PBS (pH 7.4) 3x pour 5 min chacune.
   2. Immerger les sections dans 70 % d'éthanol pendant 2 min à température ambiante.
   3. Dissoudre le bouillon Cur (1 mM) dans du méthanol et diluer avec 70 % d'éthanol pour obtenir une concentration de travail finale de 10 M.
   4. Immerger les sections avec la solution Cur de travail pendant 1 à 5 min à température ambiante sur un shaker à 150 tr/min.
   5. Jeter la solution Cur et laver avec 70% d'éthanol 3x pendant 2 min chacun.
   6. Placez les sections sur des lames de verre recouvertes de poly-L-lysine et montez à l'aide d'un support de montage organique, comme le xylène de distyrène xylène (DPX).
   7. Afficher sous un microscope à fluorescence à l'aide de filtres d'excitation/émission de 480/550 nm.
4. Étiquetez histochimiquement les plaques Adans les sections de souris et de cerveau humain intégrées à la paraffine avec Cur.
   1. Déparaffiniser les sections de tissu de l'étape 2.2.4 avec xylène 2x pendant 5 min chacune à température ambiante.
   2. Réhydratez-vous avec des solutions d'alcool classé (100%, 80%, 70%, 50% pour 1 min chacune) et avec de l'eau distillée 2x pendant 5 min chacune à température ambiante.
   3. Sections de tache avec Cur (10 M) pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité, secouant à 150 tr/min. Laver avec 70%, 90%, et 100% d'alcool pendant 2 min chacun.
   4. Effacer avec xylène 2x pendant 5 min chacun et couvrir glisser avec DPX.
   5. Visualisez-vous sous un microscope à fluorescence tel que mentionné à l'étape 2.3.7.
5. Colocalisez Cur avec l'anticorps AmD dans les plaques et les oligomères.
   1. Laver les sections cryostat de l'étape 2.1.2 avec PBS 3x dans une plaque de 12 puits.
   2. Bloquer les sections avec 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dissous en PBS avec 0,5% Triton-X-100 à température ambiante pendant 1 h.
   3. Jetez la solution de blocage. Incuber les sections avec des anticorps spécifiques à l'A (6E10 ou A11, dilué 1:200) dissous dans une solution de blocage fraîche contenant 10 % de NGS et 0,5 % de Triton-X100 pendant la nuit à 4 oC dans un shaker à 150 tr/min.
   4. Jeter la solution d'anticorps et laver les sections avec PBS 3x pendant 10 min chacune.
   5. Incuber avec l'étiquette d'anticorps secondaire avec le fluorophore rouge (par exemple, Alexa 594) pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
   6. Laver avec PBS 3x pendant 10 min chacun.
   7. Laver avec 70% d'alcool 1x.
   8. Incuber les sections avec cur (10 m) pendant 5 min à température ambiante.
   9. Laver avec 70% d'alcool 3x pendant 1 min chacun.
   10. Déshydrater avec 90% et 100% d'alcool pendant 1 min chacun, effacer avec xylène 2x pendant 5 min chacun, et monter sur des lames à l'aide de DPX.
   11. Visualisez à l'aide d'un microscope à fluorescence avec des filtres d'excitation/émission appropriés pour les signaux rouges et verts.
   12. Pour la colocalisation intracellulaire de l'A, tacher les sections à l'aide de l'anticorps A (6E10), la restaine avec Cur à température ambiante avec des secousses à 150 tr/min, et contre-tache avec Hoechst-33342 (1 mg/ml) et/ou DAPI (1ug/ml) pendant 10 min à température ambiante l'obscurité avec des secousses à 150 tr/min. Laver avec PBS 3x.
   13. Prenez des images avec les filtres rouge, vert et bleu avec un objectif 100x (grossissement total 1000x).
6. Étiquette plaques AmD avec Thio-S, CR et FJC.
   REMARQUE : Des protocoles détaillés pour l'étiquetage Thio-S et CR ont déjà été signalés⁷.
   1. Pour la coloration FJC, lavez les sections flottantes obtenues à partir de l'étape 2.1.2 avec PBS 3x pendant 5 min chacune.
   2. Placer les sections dans une plaque de 12 puits et la tache avec FJC (0.001%) pendant 10 min dans l'obscurité à température ambiante.
   3. Jeter la solution FJC et laver avec PBS 3x pendant 5 min chacun.
   4. Incuber avec du chlorure d'ammonium (NH₄Cl, 50 mM dissous en PBS) pendant 10 min à température ambiante.
   5. Jeter la solution NH₄Cl et laver avec PBS 3x pendant 5 min chacun.
   6. Après les étapes de la section 2.4, déshydrater avec des solutions d'alcool gradués, effacer, monter et voir sous un microscope à fluorescence à l'aide de filtres d'excitation/émission de 450/520 nm.

Résultats

La curcumine étiquette les plaques aïe en moins d'une minute. Lorsque nous avons taché le tissu 5xFAD avec Cur, nous avons constaté que l'étiquette Cur plaques A dans les 1 min. Bien que l'augmentation du temps d'incubation avec Cur ait légèrement augmenté l'intensité de fluorescence des plaques aao, le nombre de plaques a-A observées n'était pas significativement différent entre 1 min et 5 min de temps de coloration (Figure 1).

Discussion

Notre hypothèse était que Cur pourrait être utilisé comme le moyen le plus rapide, le plus facile et le moins coûteux d'étiqueter et d'imager les plaques A-A dans le tissu cérébral admatésique post mortem par rapport à d'autres colorants de liaison amyloïdes classiques, ainsi qu'à des anticorps spécifiques à l'A. Les objectifs de cette étude étaient de déterminer le temps minimum requis pour étiqueter et imager les plaques A par Cur dans le tissu cérébral post mortem AD et de déterminer si Cur peut ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	IHC world, Woodstock, MD
Aanimal model of Alzheimer's disease	Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10	Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11	Millipore, Burlington, MA
Compound light microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus BX51
Congo red	Sigma, St. Louis, MO
Cryostat	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
Curcumin	Sigma, St. Louis, MO
Disodium hydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Dystyrene plasticizer xylene	BDH, Dawsonville, GA
Filter papers	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342	Sigma, St. Louis, MO
Inverted fluorescent microscope	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
Inverted fluorescent microscope	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus 1x70
Normal goat serum	Sigma, St. Louis, MO
Paraffin	Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lysine coated charged glass slide	Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Potassium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma, St. Louis, MO
Sodium azide	Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide	EMD Millipore, Burlington, MA
Sodium pentobarbital	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Thioflavin-S	Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO
Xylene	VWR,Radnor, PA